宋浩杰 宋琴 施為建 呂成偉 蔣鳳蓮 王麗 李全泳

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤,在歐美地區(qū)的發(fā)病率和死亡率位居男性惡性腫瘤的前三位[1]。近幾年來,我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢,前列腺癌發(fā)現(xiàn)時往往以中晚期為主,總體治療效果仍不理想[2],亟需探索新的治療手段。而以樹突狀細胞(dendritic cells,DC)為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗是前列腺癌治療中極有希望取得突破的療法[3]。前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)是前列腺癌的特異性標志物,是一種非常理想的前列腺癌靶抗原。實驗研究表明:以重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)為載體,將前列腺特異性抗原(PSA)基因負載DC,在體外能夠誘導較強的PSA抗原特異性的抗腫瘤效應[4]。但成熟DC存在宿主自身抗原特異性免疫耐受[5],限制了DC疫苗的臨床療效。如何促進DC成熟、共刺激和抗原遞呈能力以及打破對自身腫瘤相關(guān)抗原的免疫耐受是目前DC腫瘤疫苗成功的關(guān)鍵。細胞因子信號抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1) 是一個負性調(diào)控分子家族成員,對多種細胞因子的信號轉(zhuǎn)導起負調(diào)控作用。研究表明,SOCS1可以調(diào)控DC及T細胞的分化、成熟和活化,對DC的免疫負反饋調(diào)節(jié)起重要作用[6]。我們前期的研究證實:沉默人DC的SOCS1表達,可以促進DC的成熟和活化,促進炎性細胞因子的分泌,減少抑制性細胞因子的分泌,參與免疫調(diào)控,有利于促進DC刺激Th1型免疫反應[7]。本研究探索應用重組腺相關(guān)病毒(rAAV)介導的RNA干擾技術(shù),沉默人DC的 SOCS1基因的表達,聯(lián)合攜帶PSA基因的rAAV/PSA感染DC提供持續(xù)的抗原提呈,制備新型DC疫苗,以期促進DC突破宿主水平自身抗原特異性免疫耐受,從而有效激發(fā)針對前列腺癌的特異性免疫應答,為臨床前列腺癌的免疫治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 淋巴細胞分層液(Ficoll-Hypaque)購自天津血液研究所;重組人白細胞介素 2(IL-2)、重組人白細胞介素4(IL-4)、重組人白細胞介素 7(IL-7)、重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)購自Sigma 公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、AIM-V 培養(yǎng)基購自Invitrogen公司;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;RT-PCR試劑盒購自 Takara公司;Anti-SOCS1抗體購自 Millipore公司。熒光標記小鼠抗人抗體CD80-PE、CD83-FITC、CD86- FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、CD25-PE、CD69-PE購自BD公司;FoxP3-APC染色試劑盒購自eBioscience公司;IL-10、IL-12p70、IFN-γ ELISA檢測試劑盒購自eBioscience公司;LDH細胞殺傷檢測試劑盒購自Biovision公司。流式細胞儀為美國 BD公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司;美國Bio-Rad 550型酶標儀。

1.2 重組腺相關(guān)病毒和細胞株 攜帶PSA基因的rAAV/PSA由美國阿肯色大學醫(yī)學院基因治療中心劉勇教授惠贈,病毒滴度為1×1011eg/ml。表達shRNA-SOCS1和綠色熒光蛋白的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-shRNA-SOCS1)已在前期研究中構(gòu)建制備完成[8],病毒滴度為1×1012eg/ml,保存于-80℃。shRNA-SOCS1序列為:F 5’-TCGACCTGGTTGTTGTAGCAGCTTAAA AGCTTAAGCTGCTACAACAACCAGTTTTTT-3’;R 5’-CTAGAAAAAACTGGTTGTTGTAGCAGCTTAAGCTTTT AAGCTGCTACAACAACCAGG-3’。人前列腺癌細胞株LNCaP (HLA-A2+,PSA+)由本實驗室保存。

1.3 方法

1.3.1 人外周血DC的培養(yǎng):無菌抽取HLA-A2陽性健康志愿者外周血50 ml,肝素抗凝,采用Ficoll密度梯度法分離外周血單個核細胞(PBMC),培養(yǎng)于6孔板,貼壁5 h后,輕輕洗去懸浮的淋巴細胞,剩余貼壁的細胞即為DC前體細胞,每孔加2.5 ml含GM-CSF(800 U/ml)的 AIM-V培養(yǎng)基,隔天半量換液,從培養(yǎng)第2天起加入IL-4(1 000 U/ml)。在DC培養(yǎng)第3天,用rAAV-shRNA-SOCS1感染未成熟DC,感染復數(shù)MOI為100,實驗分為空白對照組、陰性對照組和RNA干擾組,感染8 h后除去含病毒的培養(yǎng)基,以新鮮的AIM-V培養(yǎng)基取代之,并于第5天起給予TNF-α(20 ng/ml)刺激DC成熟,第7天收集懸浮細胞,即為成熟的DC。

1.3.2 Western blot檢測DC的SOCS1蛋白的表達:重組腺相關(guān)病毒感染96 h后收集各組細胞進行總蛋白提取,BCA法測定總蛋白濃度,樣品蛋白SDS-PAGE電泳分離,電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,封閉液中孵育,加入SOCS1小鼠抗人單克隆一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜。TBST洗滌后加入山羊抗鼠二抗(1∶1 000)室溫下?lián)u床孵育2 h,TBST洗滌后用化學發(fā)光試劑孵育1 min,用X線片曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參照驗證蛋白的含量。

1.3.3 重組腺相關(guān)病毒感染DC:按照1.2.1方法培養(yǎng)的DC至第3天,重組腺相關(guān)病毒rAAV-shRNA-SOCS1和rAAV/PSA感染未成熟DC,按照不同處理方式將DC分為3組,Control-DC組(空白對照組DC),rAAV/PSA-DC組(rAAV/PSA感染DC),SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組(沉默SOCS1聯(lián)合rAAV/PSA感染DC)。從第5天起給予TNF-α (20 ng/ml)刺激DC成熟。隔天半量換液。第7天收集懸浮細胞,即為成熟的DC,計數(shù)。

1.3.4 ELISA法檢測DC分泌細胞因子的水平:收集3組DC培養(yǎng)第7天的上清液,用ELISA試劑盒檢測上清液中細胞因子IL-10、IL-12 p70的含量。反應終止后0.5 h內(nèi)用酶標儀檢測 450 nm吸光度,按標準品濃度與吸光值關(guān)系繪制標準曲線,再根據(jù)標準曲線計算所測細胞因子的含量。

1.3.5 FACS檢測DC表面分子表型:DC培養(yǎng)第7天,分別收集3組成熟的DC,將細胞懸液濃度調(diào)至1× 106/ml,PBS洗滌2遍后,100 μl PBS重懸細胞,分別加入CD80、CD83、CD86熒光標記的單克隆抗體及同型對照抗體,混勻后4℃避光孵育30 min,PBS 緩沖液洗滌后,用流式細胞儀檢測DC表面分子表型的表達情況。

1.3.6 成熟DC誘導細胞毒性T細胞(CTL)和IFN-γ含量測定:在6孔板內(nèi),按DC∶T細胞=1∶20的比例混合細胞,在含GM-CSF(800 U/ml)、IL-2(20 U/ml)、IL-7(20 ng/ml)的 AIM-V 培養(yǎng)基中培養(yǎng),隔天半量換液,共培養(yǎng)7 d,收獲活化的細胞毒性T細胞(CTL)。收集DC與T細胞共育第7天的上清液,用ELISA試劑盒檢測上清液中IFN-γ的含量。

1.3.7 FACS分析CTL細胞的免疫表型:3組DC與T淋巴細胞混合反應后,分別收集各組CTL細胞,經(jīng)處理后置于流式細胞儀專用測試管中,分別加入熒光素標記的鼠源性單抗及同型對照抗體,4℃避光孵育30 min,用PBS溶液洗滌2次,流式細胞儀分析CTL細胞的免疫表型CD4+、CD8+、CD8+CD69+和CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達情況。

1.3.8 LDH 法檢測CTL對PSA陽性靶細胞的殺傷效應:CD8+細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)反應采用 LDH 法檢測。收集3組DC誘導的CTL作為效應細胞,收獲對數(shù)生長期的PSA陽性前列腺癌細胞株LNCaP作為靶細胞,按效靶比 20∶1 的比例分別加入96孔板中,置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。同時設(shè)4個對照:靶細胞最大釋放組、體積校正對照組、背景對照組和自然釋放組。按LDH-Cytotoxicity 試劑盒說明書操作。 細胞殺傷率=[(實驗組釋放-效應細胞自發(fā)釋放-靶細胞自發(fā)釋放)/(靶細胞最大釋放-靶細胞自發(fā)釋放)]×100%。同時取PSA陰性的K562、SW480細胞為靶細胞進行細胞毒實驗以分析CTL的非特異殺傷活性。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測DC的SOCS1基因沉默效果 Western blot檢測重組腺相關(guān)病毒感染DC 96 h后各組DC細胞SOCS1蛋白的表達情況,結(jié)果為RNA干擾組SOCS1蛋白的表達較陰性對照組和空白對照組顯著下降(P<0.05)。陰性對照組與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1,表1。

表1 Western blot 檢測DC的SOCS1蛋白表達 n=3,

圖1 Western blot 檢測DC的SOCS1蛋白表達;1空白對照組;2陰性對照組;3RNA干擾組

2.2 DC分泌細胞因子IL-10、IL-12 p70的水平 ELISA檢測顯示,與Control-DC組和rAAV/PSA-DC組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC培養(yǎng)上清液中IL-12 p70的分泌水平顯著升高,而IL-10的分泌水平顯著下降,3組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組DC分泌細胞因子IL-12 p70、IL-10水平比較 n=3,%,

2.3 DC表面分子表型的表達 FACS 檢測顯示:3組成熟 DC均高表達 CD80、CD83和CD86;SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組各表面分子表型標志的表達水平最高,與Control-DC組和rAAV/PSA-DC組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 3組DC表面分子表型的表達水平 n=3,%,

2.4 CTL細胞釋放IFN-γ水平檢測 ELISA檢測顯示,與Control-DC組和rAAV/PSA-DC組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC誘導的CTL釋放IFN-γ的水平顯著升高,3組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組CTL細胞釋放IFN-γ水平比較 n=3,%,

2.5 FACS分析CTL細胞的免疫表型 FACS檢測結(jié)果顯示:與Control-DC組和rAAV/PSA-DC組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC誘導的CTL細胞免疫表型中,CD8+、CD8+CD69+T細胞的比例均明顯增高;而CD4+、CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞的比例均顯著降低,3組間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 3組CTL細胞的免疫表型 n=3,%,

2.6 3組DC誘導的 CTL細胞對靶細胞的殺傷活性和抗原特異性 與Control-DC組和rAAV/PSA-DC組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC誘導的CTL細胞對PSA陽性前列腺癌細胞株LNCaP有明顯的殺傷作用,Control-DC組對LNCaP細胞無明顯殺傷作用,3組間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而以上3組CTL細胞對PSA陰性的K562、SW480細胞均無明顯殺傷作用。見表6。

表6 3組CTL細胞對靶細胞的殺傷活性 n=3,%,

3 討論

DC是體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細胞,在誘導特異性抗腫瘤細胞免疫中起關(guān)鍵作用,DC疫苗被認為是一種最具潛能的腫瘤免疫治療手段[9]。在DC腫瘤疫苗制備過程中,如何激發(fā)高效、強大的自身腫瘤相關(guān)抗原特異性細胞免疫反應是實驗的關(guān)鍵之一,研究證實,采用AAV載體攜帶抗原基因轉(zhuǎn)染DC可使抗原基因在DC內(nèi)穩(wěn)定表達,在體外誘導特異性抗腫瘤免疫反應[10,11]。然而,由于DC自身存在免疫負反饋調(diào)節(jié)機制,限制了DC的能力,使DC腫瘤疫苗的臨床療效不能有效發(fā)揮,如何突破宿主水平的自身免疫耐受亦是實驗的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn),SOCS1 是多種細胞因子如 IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-7及IL-12 P70的負調(diào)控信號,是 DC內(nèi)存在的免疫負反饋調(diào)節(jié)點[12,13], SOCS1的表達使成熟的DC能誘導免疫耐受[14]。沉默SOCS1可以顯著促進DC成熟、提呈抗原、啟動T 細胞免疫的能力,有效增強DC的抗腫瘤免疫反應[15]。Shen等[16]采用RNAi技術(shù)抑制DC的SOCS1表達,提高DC的抗原提呈能力及抗原特異性抗腫瘤免疫反應。在一項動物實驗中證實,SOCS1雜合性缺失的小鼠幾乎不出現(xiàn)自身免疫現(xiàn)象,而SOCS1 純合性缺失的小鼠會發(fā)生嚴重的自身免疫現(xiàn)象[17]。由此可得出結(jié)論,應用 RNAi技術(shù)部分沉默 DC 的SOCS1基因表達,一方面可以抑制其負反饋調(diào)節(jié),另一方面又不會引起自身免疫疾病。

基于以上研究,為研發(fā)新型DC腫瘤疫苗提供了一個新的思路,我們采用RNAi技術(shù)沉默DC的SOCS1的表達,提高DC提呈抗原的能力,再負載PSA抗原基因,從而有效激發(fā)針對前列腺癌的特異性免疫應答。本研究中采用rAAV-shRNA-SOCS1可高效感染DC,行Western blot檢測,DC的SOCS1蛋白的表達水平明顯降低,基因沉默效率達82.5%。這表明rAAV-shRNA-SOCS1可有效沉默人DC的SOCS1的表達。我們進一步研究觀察SOCS1基因沉默DC的生物學特性和免疫功能。為了驗證沉默SOCS1基因?qū)C成熟的影響,我們檢測了DC分子表型的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,SOCS1基因沉默的成熟DC高表達CD80、CD83和CD86,表面共刺激分子(CD80、CD83及CD86)是DC功能成熟的表面標志,隨著DC成熟這些分子表達水平會隨之增高。

DC 在成熟過程表達并分泌大量的IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α等多種炎性細胞因子,這類細胞因子能有效誘導并增強免疫反應,在機體免疫反應過程中發(fā)揮了重要作用。與對照組比較,SOCS1基因沉默的DC可以促進炎性細胞因子IL-12 p70的釋放,減少抑制性細胞因子IL-10的釋放,從而減弱抑制因子信號,可以進一步促進DC成熟,提高DC的抗原提呈能力,從而參與免疫調(diào)控,增強DC的免疫功能。本研究中,與對照組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC誘導的CTL可顯著促進Th1類細胞因子IFN-γ的釋放,高表達CD8(殺傷型T細胞標志)、CD69 (T細胞早期活化的標志),而低表達CD4(輔助型T細胞標志)、CD25、 FoxP3(抑制性T細胞標志)。以上結(jié)果表明,沉默SOCS1聯(lián)合rAAV/PSA感染的DC能夠明顯促進T細胞的增殖和活化,促進Th1型免疫反應發(fā)生,減少Treg細胞的生成,有助于突破腫瘤免疫耐受,抑制腫瘤免疫逃逸,其抗原遞呈途徑主要為MHCⅠ類途徑,識別CD8+T細胞并活化,從而誘發(fā)更強烈的細胞免疫反應。

制備DC腫瘤疫苗的核心是所誘導CTL能特異識別并殺傷抗原陽性的靶細胞,本研究中,與對照組比較,SOCS1(-)+rAAV/PSA-DC組成熟DC所誘導CTL對PSA陽性LNCaP靶細胞具有明顯的殺傷活性,殺傷活性明顯優(yōu)于單純rAAV/PSA-DC所誘導的CTL,并且此殺傷活性具有抗原特異性。這與國內(nèi)外的研究結(jié)論[18,19]相似。

綜上所述,rAAV/PSA感染DC,能夠誘導針對PSA抗原的特異性免疫反應,而沉默SOCS1基因進一步增強了DC的免疫功能,兩種方法聯(lián)合制備的新型前列腺癌DC疫苗能夠進一步增強其免疫活性,產(chǎn)生高效而特異性的抗前列腺癌免疫效應,為臨床制備更高效、更特異前列腺癌DC疫苗奠定基礎(chǔ)。