王一帆 張喆 田財(cái)軍

摘要：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討三黃瀉心湯治療阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease， AD）的作用機(jī)制。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺檢索并篩選出三黃瀉心湯的有效成分及作用靶點(diǎn)。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索并篩選出AD相關(guān)靶點(diǎn)，維恩圖獲取藥物與疾病交集靶點(diǎn)。使用STRING數(shù)據(jù)庫得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（ protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)信息。使用Cytoscape構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)與PPI網(wǎng)絡(luò)圖，通過DAVID數(shù)據(jù)庫對共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO（ gene ontology）和KEGG （ Kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析。使用SYBYL-X 2.1.1軟件進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。篩選出三黃瀉心湯47個有效成分，71個藥物與疾病交集靶點(diǎn)，主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、漢黃芩黃素、黃芩新素、半枝蓮種素、蘇薺苧黃酮，核心靶點(diǎn)為IL-6、TNF、IL-1β、VEGFA、TP53。GO功能分析主要涉及藥物反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控等生物過程，KEGG分析主要涉及癌癥通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等通路。分子對接結(jié)果顯示，β-谷甾醇、半枝蓮種素等核心成分，與TP53、IL-6等核心靶點(diǎn)之間有著較強(qiáng)的結(jié)合能力。初步闡釋了三黃瀉心湯可通過調(diào)節(jié)HIF-1、TNF等信號通路，從而抑制Aβ聚集與tau磷酸化、阻斷乙酰膽堿酯酶活化、抑制炎癥進(jìn)而干預(yù)阿爾茨海默病。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；阿爾茨海默?。蝗S瀉心湯

中圖分類號：R285?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號：1002-4026（2023）05-0019-08

Mechanism of Sanhuang Xiexin decoction in treatment of Alzheimer′s disease based on network pharmacology and molecular docking method

WANG Yifana，ZHANG Zheb，TIAN Caijunc*

（a. School of Traditional Chinese Medicine; b. School of Foreign Languages; c. School of The First Clinical Medical， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250013， China）

Abstract∶The aim of this study was to investigate the mechanism of action of Sanhuang Xiexin Decoction in the treatment of Alzheimer′s disease （AD） using a network pharmacology approach. The active ingredients and targets of the Sanhuang Xiexin decoction were examined and screened using the systematic pharmacology database and the analysis platform of traditional Chinese medicine. AD-related targets were retrieved and screened through Gene Cards database， and drug and disease intersection targets were obtained through through Venn diagram.The STRING database was used to obtain the network information of protein-protein interaction （PPI）. The Cytoscape was used to construct drugs-active ingredients-target-disease network and PPI，and DAVID database was used to analyze common targets in gene ontology （GO） and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG）. Furthermore， the Sybyl-x 2.1.1 software was used for molecular docking validation. The screening yielded 47 active ingredients and 71 related targets. Herein，the main active ingredients were quercetin， β-sitosterol， wogonin， baicalein， rivularin， and moslosooflavone; and the core targets were IL-6，TNF，IL-1β，VEGFA，TP53.The GO function enrichment analysis predominantly involved biological processes including drug response， hypoxia response， positive regulation of cell migration，and positive regulation of nitric oxide biosynthesis.KEGG analysis mainly involved pathways such as cancer pathways， HIF-1 signaling pathways， and TNF signaling pathways.Molecular docking results showed the presence of a relatively strong binding ability between the core target and the core compounds， such as β-sitosterol and rivularin.This study preliminarily explained that the Sanhuang Xiexin Decoction can interfere with AD by modulating HIF-1， TNF， and other signaling pathways， thereby inhibiting Aβ aggregation and tau phosphorylation， blocking acetylcholinesterase activation， and suppressing inflammation.

Key words∶network pharmacology;molecular docking；Alzheimer′s disease;Sanhuang Xiexin decoction

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease， AD），又稱原發(fā)性老年癡呆，以認(rèn)知記憶障礙為特點(diǎn)，是一種具有不可逆性和致死性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。AD病理特征包括β-淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積、微管蛋白（tau）的異常磷酸化、突觸損傷和神經(jīng)功能障礙等[1-2]，在疾病過程中，患者逐漸喪失記憶及思考能力，最終失去自主行為能力[3]，是全世界老年人（年齡≥ 65歲）認(rèn)知障礙和癡呆的主要原因[4]，且AD的發(fā)病率、治療和護(hù)理費(fèi)用正在逐年快速增長，為國家醫(yī)療體系以及患者的家庭帶來了沉重的壓力[5]。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)治療AD藥物包括膽堿酯酶抑制劑與NMDA受體拮抗劑兩類，而自2003年以來，只有阿杜那單抗（aducanumab）被FDA批準(zhǔn)用于治療AD[6]，且單純采用西藥治療AD，作用靶點(diǎn)單一、不良反應(yīng)較多，治療效果并不理想。

中醫(yī)理論認(rèn)為，“毒損腦絡(luò)”與“瘀血阻滯”在AD的發(fā)生過程中起著重要作用，因此清熱解毒、活血逐瘀可作為治療AD的原則[7-8]。三黃瀉心湯出自東漢名醫(yī)張仲景的《金匱要略》，由大黃、黃連、黃芩組成，具有清熱解毒、活血逐瘀的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，大黃中的大黃酚、大黃素具有清除自由基、抗氧化的作用[9]，而黃連素、黃芩苷可以減少Aβ的生成并加速Aβ的降解[10-11]，臨床上在AD等疾病的治療中效果明顯。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測三黃瀉心湯治療AD的活性化合物、潛在的靶點(diǎn)蛋白與信號通路，并通過分子對接進(jìn)一步從受體與配體方面驗(yàn)證三黃瀉心湯活性成分干預(yù)AD關(guān)鍵靶點(diǎn)的有效性，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 三黃瀉心湯有效成分與作用靶點(diǎn)的獲取

以黃連、黃芩、大黃為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com）上檢索三黃瀉心湯中3味中藥所含的化學(xué)成分。篩選條件為類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18且口服生物利用度（Oralbioavailability，OB）≥30%[12]，[JP]初步篩選出三黃瀉心湯有效化學(xué)成分及靶點(diǎn)，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）查詢出靶點(diǎn)蛋白對應(yīng)的基因名稱。

1.2 AD靶點(diǎn)的收集

使用Gene Cards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）與Drug Bank數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com/），以Alzheimer′s disease為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，收集AD的作用靶點(diǎn)，對檢索出疾病靶點(diǎn)的相關(guān)分?jǐn)?shù)（Relevance score）取3倍中位數(shù)[13]，將相關(guān)分?jǐn)?shù)大于等于3倍中位數(shù)評分的靶點(diǎn)作為AD疾病靶點(diǎn)。

1.3 疾病與藥物共同靶點(diǎn)的篩選

將篩選出的三黃瀉心湯有效成分靶點(diǎn)與AD疾病靶點(diǎn)，通過Venny在線繪制平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn）繪制維恩圖，并獲取三黃瀉心湯有效成分靶點(diǎn)與AD疾病靶點(diǎn)的交集。

1.4 藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物、有效成分、有效成分與疾病交集靶點(diǎn)、疾病名稱導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的構(gòu)建與可視化分析。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將三黃瀉心湯與AD交集靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING 11.5（https：//www.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白質(zhì)-[JP]蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建，將物種類別選擇“Homo sapiens”， 設(shè)置“置信分?jǐn)?shù)≥0.4”[14]，并將獲得的蛋白交互信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析。

1.6 通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對三黃瀉心湯與AD交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology， GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書 （ Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路分析，設(shè)置物種為“Home sapiens”，GO分析選擇生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecullar fuction，MF），使用R studio ggplot 2軟件包根據(jù)-lg P對BP、CC、MF排名前10與KEGG排名前20的條目進(jìn)行GO與KEGG分析的可視化處理。

1.7 分子對接

通過PubChem（http：//www.pdb.org/）平臺獲取三黃瀉心湯活性成分的SDF格式文件，使用Chem3D Pro 14.0將SDF格式文件轉(zhuǎn)換mol2格式文件，使用RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲取核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的 PDB 格式文件，使用SYBYL-X 2.1.1進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 三黃瀉心湯活性成分及作用靶點(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以DL≥0.18，OB≥30%為條件篩選后，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)名稱規(guī)范化，剔除有效成分重復(fù)值后，共得到47個有效成分，其中黃連有效成分11個，大黃有效成分7個，黃芩效成分32個，主要有效成分見表1，全表見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。

2.2 AD靶點(diǎn)

使用GeneCards數(shù)據(jù)庫得到AD相關(guān)基因靶點(diǎn)共9 599個，Relevance score取3次中位數(shù)后的數(shù)值為11.283 7，故設(shè)定Relevance score≥11.283 7的靶點(diǎn)為AD的潛在靶點(diǎn)，共篩選得到1 200個靶點(diǎn)。

2.3 三黃瀉心湯與AD靶點(diǎn)的交集

通過Venny在線制圖工具平臺，繪制三黃瀉心湯有效成分靶點(diǎn)與AD潛在靶點(diǎn)的維恩圖，得到71個交集靶點(diǎn)，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。

2.4 三黃瀉心湯藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖顯示，圖中包含122個節(jié)點(diǎn)，498條邊。圖中節(jié)點(diǎn)越大，則代表其連接度（degree）越高，連接度排名前6名的化合物分別為槲皮素、β-谷甾醇、漢黃芩素、黃芩新素、半枝蓮種素、蘇薺苧黃酮，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的建立

AD與三黃瀉心湯交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示，圖中共有71個靶點(diǎn)蛋白與1 468條相互作用的邊，連接度前5的核心靶點(diǎn)蛋白為IL-6、TNF、ATK1、PTGS2、VEGFA，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3。

2.6 GO與KEGG富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫v6.8對三黃瀉心湯與AD的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG通路富集分析，并根據(jù)P<0.01、FDR<0.05為條件進(jìn)行篩選，共得到143條GO條目與79條KEGG條目。OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4顯示，BP主要涉及藥物反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控；CC主要涉及細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、小窩、薄膜筏等；MF主要涉及絲氨酸內(nèi)肽酶活性、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性、相同蛋白質(zhì)結(jié)合等。OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖5顯示KEGG富集分析主要涉癌癥通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。

2.7 分子對接

選取AD關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白IL-6、TNF、IL-1β、VEGFA、TP53分別與三黃瀉心湯活性成分槲皮素、β-谷甾醇、漢黃芩黃素、黃芩新素、半枝蓮種素、蘇薺苧黃酮進(jìn)行分子對接并得到對接分?jǐn)?shù)，見表2，通過R studio ggpubr軟件包繪制對接分?jǐn)?shù)氣泡圖，見圖1，同時得到分子對接結(jié)果示意圖，部分示意圖見圖2，對接分?jǐn)?shù)≥5代表活性成分與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合作用[15]。本次分子對接結(jié)果顯示活性最強(qiáng)的對接組合為IL-6與β-谷甾醇、TP53與半枝蓮種素、TNF與黃芩新素、TP53與黃芩新素、IL-6與蘇薺苧黃酮。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為“諸熱瞀瘛，皆屬于火”“其人喜忘者，必有蓄血”，因此在AD的治療中不應(yīng)忽略熱毒與瘀血這兩種致病因素。三黃瀉心湯中黃連、黃芩具有清熱解毒之效，大黃具有瀉下攻積、逐瘀通經(jīng)之效，三藥合用，清熱解毒、活血逐瘀之功甚強(qiáng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，大黃、黃連、黃芩可以通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制疾病特異性淀粉樣蛋白的聚集，降低β-淀粉樣蛋白與tau磷酸化水平、提高蛋白磷酸酶2A活性等方式改善AD臨床癥狀[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，三黃瀉心湯治療AD的核心成分主要包括槲皮素、β-谷甾醇、漢黃芩黃素等。Aβ瀑布學(xué)說、膽堿能缺陷假學(xué)說、神經(jīng)炎癥假說等是解釋AD產(chǎn)生的重要理論，槲皮素是一種黃酮類化合物，可以通過抑制Aβ聚集與tau磷酸化、抑制乙酰膽堿酯酶水解乙酰膽堿、減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)、減輕神經(jīng)炎癥等方式達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞從而防治AD的功效[17]。β-谷甾醇具有很強(qiáng)的抗膽堿酯酶作用，并具有清除自由基的功效，能夠預(yù)防由自由基引起的神經(jīng)退行性病變，同時β-谷甾醇可較為容易地穿過血腦屏障，對于AD的治療具有很高的生物利用度[18]。漢黃芩素可以干預(yù)Aβ聚集并顯著抑制SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的膽堿酯酶活性，阻斷Aβ42誘導(dǎo)的乙酰膽堿酯酶活化[19]，減少BACE1細(xì)胞中Aβ的分泌，并且可以通過mTOR抑制作用抑制GSK3β活性，從而減少tau磷酸化達(dá)到保護(hù)、營養(yǎng)神經(jīng)的作用[20]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF、IL-1β、VEGFA、TP53是三黃瀉心湯治療AD的核心靶點(diǎn)。有越來越多的研究表明，炎癥反應(yīng)在AD病理過程中尤其是疾病的早期階段有著重要的參與[21]，炎性因子IL-6與認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可以加速神經(jīng)退行性過程，并且與Aβ沉積、脫髓鞘、白質(zhì)高信號和神經(jīng)變性過程相關(guān)[22-23]。TNF是炎癥的主要調(diào)節(jié)因子之一，具有協(xié)調(diào)促炎細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)的作用，由TNF介導(dǎo)的炎癥可能導(dǎo)致Aβ斑塊和tau過度磷酸化[24]。葡萄糖代謝降低是AD的特征之一，己糖激酶是葡萄糖代謝的關(guān)鍵酶之一，IL-1β表達(dá)的減少可以使己糖激酶表達(dá)增加，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)、增加葡萄糖代謝，促進(jìn)AD的恢復(fù)[25]。VEGFA與血管生成、毛細(xì)血管血流量有關(guān)，抑制VEGF信號可以減少白細(xì)胞黏附在腦微血管內(nèi)皮，改善AD患者腦微血管血流[26]。TP53活性的失調(diào)會導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)變性[27]，因此有效地干預(yù)TP53的表達(dá)可以起到改善腦損傷的作用。

GO富集分析顯示三黃瀉心湯治療AD主要集中在藥物反應(yīng)、缺氧的反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、絲氨酸內(nèi)肽酶活性、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性等方面。KEGG分析說明三黃瀉心湯治療AD與多條通路相關(guān)，包括癌癥通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。腦缺血缺氧是AD發(fā)病的重要環(huán)境因素，HIF-1信號通路與細(xì)胞低氧應(yīng)激密切相關(guān)，缺氧誘導(dǎo)因子也會對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響，AD患者會出現(xiàn)大量小膠質(zhì)細(xì)胞圍繞Aβ斑塊周圍大量增加的特征[28]，而小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的產(chǎn)生，會伴隨著氧化磷酸化到糖酵解的代謝重編程，這一代謝重編程則依賴于HIF通路[29]，所以HIF-1信號通路與AD的病理改變可能有著緊密的聯(lián)系。系統(tǒng)性感染是產(chǎn)生認(rèn)知障礙的原因之一[30]，TNF信號通路參與多系統(tǒng)的慢性炎癥與變性疾病，是神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)之一[31]，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變有著密切聯(lián)系，同時在AD病理過程中，TNFR信號還參與APP（淀粉樣蛋白前體蛋白）加工，影響Aβ斑塊產(chǎn)生[32]。

我們將篩選出的三黃瀉心湯的核心成分與AD的核心靶點(diǎn)分別進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果顯示IL-6與β-谷甾醇、TP53與半枝蓮種素，TNF與黃芩新素、TP53黃芩新素、IL-6與蘇薺苧黃酮，有著較強(qiáng)的結(jié)合能力。因此我們推測三黃瀉心湯可能是通過這些化合物作用于多個靶點(diǎn)從而達(dá)到治療AD的效果。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的方法得出，三黃瀉心湯可以通過多活性成分、多靶點(diǎn)、多通路抑制Aβ聚集與tau磷酸化、阻斷乙酰膽堿酯酶活化、抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而達(dá)到治療AD的臨床療效。

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