劉如明， 邊 鑫， 龍加福， 周 穎， 繳 莉

（南開大學生命科學學院，天津 300071）

0 引言

當今世界科技的發(fā)展日新月異，創(chuàng)新型科研人才在我國科技發(fā)展中起著關鍵作用［1-2］。高等院校承擔著培養(yǎng)高素質研究人才的重任，對培養(yǎng)課程不斷探索和創(chuàng)新改革才能緊跟時代發(fā)展的變化。而生命科學作為一門實驗科學，先進的科學實驗技術對培養(yǎng)創(chuàng)新型人才的科研能力尤其重要［3-4］。激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）是生命科學研究中使用最為廣泛的成像儀器，它在細胞生物學、遺傳學、生物化學與分子生物學、生物醫(yī)學、藥學等學科研究領域起到不可或缺的作用，主要用于觀察組織、細胞和亞細胞的微觀結構，監(jiān)測細胞生理活動、生物大分子間相互作用等。

LSCM實驗教學課程有別于以操作為主的常規(guī)儀器培訓，其目的在于幫助學生學習生物成像知識，掌握生物成像應用的實驗方法，建立完善的生命科學研究體系。近年來，隨著國家對生命科學研究的重視和經費投入的不斷提高，越來越多的科研機構、高等院校和科技公司購置了LSCM。LSCM 技術作為普通光學顯微鏡技術的延伸，已成為生命科學相關學科學生們常用的實驗技能之一，LSCM 實驗課程的開設對學生實驗教學特別是研究生的實驗教學尤其重要［5-6］。自2012 年以來，本學院為研究生開設了LSCM 技術的實驗教學課程“激光掃描共聚焦顯微鏡技術及應用”。結合本學院的科研情況和大型儀器教學特點，經過不斷實踐和優(yōu)化，該教學課程將理論教學與實驗教學相結合，并融合免疫熒光技術，構建了實驗教學方案，這為提高學生們的科研素質和實驗技能，對教學改革和學科建設都有著深遠意義。

1 LSCM實驗教學內容的構建

“激光掃描共聚焦顯微鏡技術及應用”依托于本學院研究生的必修課“現代生物學技術”，課程分為LSCM的理論課教學和實驗課教學。理論課為大班集體教學，內容包括LSCM的發(fā)展前沿、技術原理、結構、高級熒光實驗應用、顯微鏡發(fā)展前沿等；實驗課分組循環(huán)教學，保證每位同學能夠上機操作，在短時間內掌握儀器的基本操作和LSCM應用里的關鍵技術——免疫熒光實驗技術，切身體會儀器的功能和應用。

1.1 多樣化的展示技術構建理論教學課程

本課程面向生命科學專業(yè)的學生，在理論課程設計上，緊跟時代發(fā)展，探索性地引入多種先進技術，用多樣化的教學方式使理論課程變得更加生動，更能調動和激發(fā)學生的學習興趣［7-9］。在教學中將動畫，視頻，圖片合理的融合在一起，兼顧了科學性和趣味性。比如，用虛擬全景技術制作了顯微成像儀器室的VR介紹，給學生帶來全新的真實現場和交互式的體驗感受。同時，開展了網絡教學內容制作工作。目前，網絡教學成為信息化教學的重要組成部分。網絡教學可以打破時間和空間的制約，使教學工作更加靈活。

理論課教學主要分四部分講解。首先，帶領學生認識LSCM，闡述LSCM發(fā)展前沿和光學原理，并通過與熒光顯微鏡成像原理的比較幫助學生們深刻地認識LSCM 的成像特點和優(yōu)勢。其次，以學院平臺現有儀器為例，向學生介紹儀器的構造組成、儀器參數和功能。LSCM 主要用于觀察熒光標記的樣品，樣品制備直接影響成像的質量。所以，之后的教學內容包括熒光成像基礎和樣品制備方法及注意事項。最后，給學生展示多種類型的應用實例，包括細胞、組織切片和植物樣品的成像實驗，活細胞實時觀測實驗，高級熒光實驗（包括熒光共振能力轉移和熒光漂白后恢復實驗）等。由于LSCM 結果多以絢麗的圖像和視頻生動展示，配以數據分析，可以極大地提高學生探索的興趣。

1.2 LSCM實驗教學方式探索

LSCM屬于使用率高的大型貴重精密儀器，和其他常規(guī)的生物學實驗相比，在實驗教學中存在以下問題：①儀器價格高，維修費用高昂，在教學實踐中需要要做好儀器的維護工作；②儀器數量少，在有限的實驗課時里無法保證每個人都上機操作；③儀器室空間有限，每次實驗必須控制人數；④儀器操作比較復雜，短時間內沒有辦法掌握儀器的操作［10］。

針對以上問題，我們在多年組織課程實踐中，及時總結經驗，優(yōu)化課程組織，遵循“專業(yè)教學-靈活參與-加強交流”的方式組織課程。

專業(yè)教師護航大型精密儀器LSCM的教學。實驗課程授課教師為一線儀器管理教師，對儀器應用、管理有豐富的經驗，在實驗課程中能夠保證學生正確使用儀器，并在課后對儀器進行維護，不額外增加儀器的維修費用。另外，顯微鏡管理教師掌握LSCM 的常規(guī)應用和高階實驗方法，不但能給學生講透LSCM 的基本操作和應用，也能解答學生在顯微鏡應用中的各種疑難問題。

對于儀器數量少和場地有限的問題，實驗課程“現代生物學技術”和其他實驗課程一起，組織8 周的平行課程。每周4 學時，每次參加課程的學生為10 ～12 人。學院平臺有兩臺LSCM可以提供給學生使用，并且有兩名教師和一個助管老師帶領學生進行實驗。同學們根據課題研究需求和自己學業(yè)、職業(yè)的規(guī)劃，通過選修靈活參加實驗課程。

每一次實驗課程先講解基本操作，學生再分小組輪流上機操作。上機時學生可以自由組建互助小組，在老師的指導下進行操作。4 學時的實驗課程對于部分初學者可能沒有辦法完全掌握LSCM的使用的。大型儀器實驗課的目的不僅僅教給學生儀器技術和實驗方法，也是學生和儀器教學老師交流聯系的紐帶。如果學生有更多關于儀器應用的需求可以隨時到儀器平臺進行學習，師生可以自由地交流儀器功能和實驗方案。這對儀器平臺來說也起到提高儀器使用率的作用。

1.3 間接免疫熒光實驗與共聚焦技術結合教學

為了實驗課的完整性，增加了間接免疫熒光制樣的實驗內容。免疫熒光技術是研究蛋白定位、蛋白間相互作用的重要研究方法［11-13］。對于生命科學類專業(yè)的學生而言，學習掌握免疫熒光技術及結果觀察能夠更順利地開展相關科學研究工作。雖然實驗課由于增加的內容變得緊湊，但是這部分課程對于學生能夠完整的學習并掌握共聚焦顯微鏡實技術，切實參與到實驗中，增強動手能力非常重要。

根據LSCM的使用特點，設計了實驗教學內容，選用免疫熒光技術標記微管，DAPI 標記細胞核制備樣品，然后利用共聚焦顯微鏡進行二維、三維圖像采集。免疫熒光標記的樣品具有存放一段時間再觀察也不會淬滅的特點，因此可以提前制備好標準片供學生觀察。在實際的實驗教學中由兩名教師帶隊，一邊組織學生進行樣品制備；一邊有序地輪流觀察前期制備好的標準片。這樣既完善了實驗教學內容，又解決儀器臺數少的問題。此外，微管抗體是一款特異性好的商品化抗體，信噪比好，實驗成功率高。選擇標記微管作為實驗內容，能夠保證得到穩(wěn)定清晰的實驗結果，從而保證實驗課程的效率［14］。

通過前期大量預實驗，摸索出成熟實驗流程和條件，保證同學們在4 學時內能夠完成整個實驗。教學實踐中，免疫熒光實驗和LSCM 上機可以交叉進行。先簡單地向學生介紹實驗方法和流程，儀器基本操作；接著，同學們開始按照實驗方法進行免疫熒光實驗。等待反應的間隙，同學們分組輪流進行成像采集和圖像數據分析。

（1）實驗材料和試劑。細胞：HUVEC細胞系。試劑：RPMI1640 培養(yǎng)基，胎牛血清，0.3%胰酶，Hank’s液，PBS，4%多聚甲醛溶液，Triton-100，牛血清白蛋白（BSA），單克隆小鼠抗Tubulin α抗體，標記FITC熒光素的山羊抗小鼠抗體（二抗），熒光防淬滅封片劑（含DAPI）。

（2）實驗方法。貼壁的細胞直接培養(yǎng)在蓋玻片上，培養(yǎng)1 d 后使細胞密度達到70%左右；取出蓋玻片，輕輕地用PBS 浸洗2 次，勿振蕩；將蓋玻片取出浸沒在新鮮配置的4%多聚甲醛溶液中，室溫2 min固定細胞；吸去多聚甲醛溶液，PBS浸洗2 次后，吸去PBS，浸沒在0.05%的TritonX-100/PBS 中透化5 min；吸去TritonX-100，PBS浸洗2 次，吸去PBS，用1%的牛血清白蛋白（BSA）/PBS，室溫在濕盒中孵育30 ～45 min；吸去牛寫清白蛋白，PBS 浸洗2 次，吸去PBS，用濾紙從玻片邊緣吸去多余液體，滴加20 μL：100 稀釋于1%BSA/PBS中的單克隆小鼠抗Tubulin α 抗體，放置于在濕盒中室溫孵育2 h；PBS 浸洗3 次，每次5 min；吸去多余PBS，滴加20 μL 以1∶50 稀釋于1%BSA/PBS中標記FITC熒光素的羊抗鼠抗體，孵育37 ℃45 min。PBS緩慢振蕩浸洗3 次，每次10 min；取出蓋玻片，吸去多余的PBS，在干凈的載玻片上滴加5 μL 含DAPI的防熒光淬滅劑封片，然后用指甲油將蓋玻片固定；使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察采圖，或者置-20℃冷凍保存。

（3）實驗結果。HUVEC細胞，間接免疫熒光方法FITC標記微管，DAPI標記細胞核，使用激光掃描共聚焦顯微鏡ZEISS LSM710 觀察，設置FITC通道，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光495 ～550 nm，DAPI通道，激發(fā)光405 nm，發(fā)射光410 ～450 nm，63x 物鏡，zoom3x，結果見圖1。根據樣品厚度進行層掃，掃描厚度4.6 μm，每層0.67 μm進行采圖，見圖2。結果通過軟件ZEN 2011 BLACK進行投影重建，見圖3。

圖1 HUVEC細胞雙重免疫熒光2D圖像

圖2 HUVEC細胞雙重免疫熒光3D逐層掃描圖像藍色：DAPI標記的細胞核，綠色：FITC標記的微管蛋白

圖3 HUVEC細胞雙重免疫熒光3D投影重建藍色：DAPI標記的細胞核，綠色：FITC標記的微管蛋白

2 實驗課程的教學實踐與思考

LSCM技術與應用課程的結合，打破以往單一演示儀器的教學方式，通過理論與實踐有機結合［15］，樣品制備與儀器應用聯動的方式教學，使學生在學習儀器使用的同時，掌握顯微鏡樣品的制作方法，充分認識到樣品制備對成像結果的重要性。課程實踐中，以學生為主體，老師為輔進行引導式教學。老師的職責在于啟發(fā)學生遵循從“認知”到“實踐”的學習規(guī)律，主動將理論應用到實際。學生在制樣過程中親自動手，逐步理解實驗目的和成像原理，通過儀器成像的結果反過來分析和總結樣品制備的細節(jié)和注意事項，兩項技術有機結合分析，討論和分析儀器參數和實驗結果的相關性。

學生在進入實驗室接受正式科研訓練之前，提前掌握了大型成像儀器的基本操作和研究思路，可以幫助他們在研究生期間的科研訓練中，發(fā)揮主觀能動性，應用大型儀器開發(fā)新的研究，提高學生的實驗素養(yǎng)和綜合創(chuàng)新能力。

目前我們針對LSCM技術開設的這門實驗課程主要作為子課程參加研究生必修課“現代生物學技術”，另外也參與本科生開放課“生物科學綜合實驗”實驗教學（見表1）。隨著共聚焦顯微鏡技術的成熟和廣泛應用，課程也可以參與到細胞生物學實驗課、免疫學實驗課、生物化學和分子生物學實驗課等課程的成像教學中，這對提升大型儀器使用率，培養(yǎng)學生科研創(chuàng)新思維，提高學科教學水平都具有重要意義。

表1 共聚焦顯微鏡在實驗教學中的應用

3 結語

綜上所述，筆者根據多年來共聚焦顯微鏡實驗教學的經驗，融合多種技術進行教學，將間接免疫熒光技術和共聚焦顯微鏡成像技術相結合，不斷實踐和優(yōu)化，探索大型成像儀器行之有效的實驗教學模式。共聚焦顯微鏡實驗教學旨在助力學科高水平創(chuàng)新型人才培養(yǎng)，促進實驗教學改革，提高大型儀器使用效率，服務學科建設。希望這一探索能夠給大型儀器特別是貴重成像儀器實驗教學帶來新的啟示，推動高校里的大型精密儀器應用教學。

·名人名言·

天才的最基本的特性之一——是獨創(chuàng)性或獨立性，其次是它具有的思想的普遍性和深度，最后是這思想與理想對當代歷史的影響，天才永遠以其創(chuàng)造開拓新的、未之前聞，或無人預料的現實世界。

——別林斯基