劉郁夫,林曉慧,郝文茜,馮夏寧,歐陽征亮,陳瑞愛, *

(1. 肇慶學院生命科學學院,廣東肇慶 526060;2. 嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室肇慶分中心,廣東肇慶 526238;3. 農業(yè)農村部動物疫病防控生物技術與制品創(chuàng)制重點實驗室/廣東省獸用生物制品技術研究與應用企業(yè)重點實驗室/肇慶大華農生物藥品有限公司,廣東肇慶 526238)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種重要豬傳染病,以發(fā)病急、病死率高為主要特征,豬是ASFV唯一天然宿主[1-2],自ASFV傳入以來,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經濟損失。目前市場上尚沒有特效藥物和有效疫苗可用于治療和預防非洲豬瘟,完善的生物安全防護措施和快速檢測技術是該病主要防控的手段[3],且非洲豬瘟臨床發(fā)病癥狀與經典豬瘟相似,開發(fā)特異敏感的血清學檢測技術具有廣闊的應用價值,有助于非洲豬瘟的鑒別診斷和防控凈化工作[4]。

ASFV是一種有囊膜的、雙股線性DNA病毒,病毒基因組結構復雜,編碼151～167個開放閱讀框[5]。其中已報道的P72、P54、P30、pp62、CD2v、B602L等蛋白具有較強的免疫原性,是亞單位疫苗和血清學檢測技術研發(fā)的主要靶點[6]。而其中非結構蛋白B602L在感染晚期高效表達于細胞質中,一般認為是P72蛋白分子伴侶,在病毒核衣殼組裝過程中發(fā)揮重要作用。王鵬飛[7]利用pGEX-6P-1原核表達載體,原核表達B602L蛋白,并建立了基于B602L重組蛋白的間接ELISA檢測方法。經比對,該方法與基于p72蛋白的阻斷ELISA試劑盒檢測結果的符合率為95%,提示B602L是ASFV主要的抗原性蛋白之一,但原核表達系統(tǒng)缺乏翻譯后修飾機制,往往不能形成完整的三維構象[8]。

為真核表達AFSV B602L重組蛋白,制備相應的多克隆抗體。本實驗利用昆蟲細胞真核表達系統(tǒng),表達B602L重組蛋白,通過間接免疫熒光、SDS-PAGE和western blots試驗鑒定重組蛋白,再以純化的B602L蛋白免疫小鼠,制備B602L多克隆抗體血清,最后通過間接ELISA試驗和western blots試驗對多克隆抗體的反應性進行鑒定。本試驗可為后續(xù)ASFV血清學檢測方法的建立、B602L單克隆抗體的制備提供前期基礎和和生物材料儲備。

1 材料與方法

1.1 樣品及主要試劑 非洲豬瘟標準陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(202101批);pFastBac1質粒和Sf9昆蟲細胞由嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室肇慶分中心保存;根據(jù)草地貪夜蛾卵巢細胞的密碼子偏嗜性,對ASFVB602L基因(MK333180)進行密碼子優(yōu)化,由蘇州金唯智生物科技有限公司進行基因合成;PrimeSTAR MAX DNA聚合酶、限制性內切酶EcoR I、SalI購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司;BAC/PAC DNA小量提取試劑盒購自OMEGA公司;Anti-His鼠源單抗、羊抗鼠酶標二抗、FITC標記的羊抗鼠二抗、DH10BAC感受態(tài)細胞購自北京索萊寶科技有限公司;Sf-900 III昆蟲細胞培養(yǎng)基、脂質體轉染試劑Cellfectin II購自Gibco公司;弗氏佐劑購自Sigma公司;SPF級BALB/c小鼠購自肇慶瑞思元生物科技有限公司。

1.2 B602L桿狀病毒轉移載體的構建 從NCBI網(wǎng)站上下載ASFV Pig/HLJ/2018株(MK333180)的B602L基因序列,利用網(wǎng)絡在線工具(https:∥services.healthtech.dtu.dk)分析其信號肽序列,并在B602L蛋白的N端設計kozac序列(GCCACC)和蜂毒素信號肽序列(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA),在B602L蛋白的C端設計6×His標簽,并以柔性linker(G4S)3與目的基因相連?；蛐蛄杏商K州金唯智生物科技有限公司進行密碼子優(yōu)化和合成。以合成基因為模板,設計引物進行PCR擴增,引物序列見表1,并將B602L基因克隆至桿狀病毒轉移質粒pFastBac1的EcoR I和SalI限制性內切酶中間。經測序驗證沒有移碼和突變,命名為pFastBac1-B602L。

表1 引物信息Tab 1 Primer information

1.3 重組桿狀病毒的拯救 將構建好的桿狀病毒供體質粒pFastBac-B602L轉化進DH10Bac感受態(tài)細胞中,并在含卡那霉素50 μg/mL、四環(huán)素10 μg/mL、慶大霉素7 μg/mL、IPTG 125 μg/mL、X-gal 100 μg/mL的抗生素平板中進行藍白斑篩選,利用B602L-F/B602L-R引物對顯白色的單菌落進行PCR鑒定。依據(jù)BAC/PAC DNA小量提取試劑盒說明書抽提重組桿粒Bacmid-B602L,測定核酸濃度后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將處于生長對數(shù)期的Sf9昆蟲細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板,靜置4 h后進行桿粒轉染,步驟如下:將5 μg的Bacmid-B602L桿粒與8 μL Cellfectin II轉染試劑分別加入125 μL的Opti培養(yǎng)基中,室溫預混5分鐘;再將兩者混勻后置于室溫靜置5分鐘;隨后緩慢滴加到Sf9細胞中。在Sf9細胞中連續(xù)盲傳3代,直至出現(xiàn)明顯細胞病變。

1.4 B602L重組蛋白的表達鑒定 通過間接免疫熒光和western blots試驗,檢測Sf9細胞中是否表達外源蛋白B602L。間接免疫熒光試驗方法簡要如下:將B602L病毒液接種至Sf9培養(yǎng)基,置于27 ℃溫箱培養(yǎng)72 h后,經4%多聚甲醛固定處理、0.1% Triton X-100細胞透化,以His標簽抗體(1∶1000倍稀釋)為一抗孵育1 h,用PBS洗滌3次,再用FITC標記的羊抗鼠二抗(1∶500倍稀釋)孵育1 h,PBS洗滌3次后置于熒光顯微鏡下觀察。western blots試驗方法簡要如下:收獲病變明顯的Sf9細胞,凍融3次后,離心分離上清和細胞沉淀樣品,進行12% SDS-PAGE電泳,經NC膜轉印后,分別以anti-His單抗(1∶5000倍稀釋)和ASFV標準陽性血清(1∶500倍稀釋)為一抗4 ℃孵育過夜,PBST清洗3次后,再分別以HPR標記羊抗鼠IgG二抗(1∶10000倍稀釋)和HPR標記兔抗豬IgG二抗(1∶10000倍稀釋)室溫孵育1 h,PBST清洗掉殘留的二抗,用Azure Biosystems C600多功能分子成像系統(tǒng)成像。

1.5 B602L重組蛋白的純化 將western blots鑒定正確的B602L桿狀病毒液,按1∶10的比例接種Sf9細胞培養(yǎng)液,27 ℃溫箱孵育72 h,凍融3次后進行超聲破碎,功率35 W,工作時間5 min、間歇時間2 min,全部時間為10 min。以7000 g的轉速室溫離心10 min,收集上清。利用His鎳株親和層析的方式純化B602L重組蛋白。

1.6 B602L多克隆抗體的制備 將純化后的B602L蛋白以PBS稀釋成濃度為1 μg/mL,與弗氏佐劑等體積混合,充分乳化后,以背部皮下多點注射的方式免疫BALB/c小鼠,每只小鼠免疫0.2 mL,每隔14 d進行二免和三免。三免過后14 d以眼眶采血處死小鼠,并分離血清,分裝后置于-20 ℃冰箱保存。

1.7 B602L多克隆抗體的驗證 為驗證B602L小鼠多抗的效價,通過間接ELISA方法檢測B602L小鼠多克隆抗體的效價。將純化的B602L蛋白以50 ng/孔的濃度,4 ℃過夜包被96孔酶標板,用含5%脫脂牛奶的PBST于37 ℃溫箱封閉1 h,加入1000倍稀釋的B602L小鼠多抗,再進行2倍倍比稀釋,經HRP標記羊抗鼠IgG二抗(1∶10000倍稀釋)孵育,最后顯色檢測450 nm吸光度值。

為驗證B602L小鼠多抗的反應性,通過western blots試驗檢測多抗與重組蛋白B602L的反應性。western blots試驗方法簡要如下:將純化的B602L蛋白經SDS-PAGE電泳、NC膜轉印后,先后以B602L小鼠多抗(1∶250倍稀釋)為一抗,HPR酶標記的羊抗鼠IgG(1∶10000倍稀釋)為二抗孵育,PBST清洗3次后通過化學發(fā)光顯色。

2 結果與分析

2.1 桿狀病毒穿梭質粒的構建及鑒定 以合成的B602L基因為模板,用B602L-F/B602L-R為引物進行PCR擴增,結果如圖1所示,可擴增出1700 bp左右的目的條帶,與預期相符。將目的條帶切膠回收后,以酶切連接的方式克隆至桿狀病毒穿梭質粒pFastBac1,并測序驗證,將驗證正確的重組質粒命名為pFastBac-B602L。

2.2 重組桿狀病毒的拯救 將桿狀病毒穿梭質粒pFastBac-B602L轉化至DH10Bac感受態(tài)細胞中,經轉座、抗生素篩選和藍白斑篩選,挑取白色單菌落進行PCR鑒定,然后擴大培養(yǎng),根據(jù)BAC/PAC DNA小量提取試劑盒制備桿狀病毒重組質粒,命名為Bacmid-B602L。將Bacmid-B602L轉染到Sf9細胞中,盲傳3代,直至細胞出現(xiàn)變大、變圓、死亡、脫落等典型病變(圖2)。

A: rBaculovirus-B602L感染組;B: 正常Sf9細胞A: rBaculovirus-B602L infection group; B: Normal Sf9 cells圖2 桿狀病毒感染引起的Sf9細胞病變(白光,100×)Fig 2 Sf9 cytopathy caused by baculovirus infection (White light, 100×)

將His單抗作為一抗(1∶1000倍稀釋),FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗(1∶1000倍稀釋),依次孵育接種過重組桿狀病毒48 h的Sf9細胞,仍可在熒光顯微鏡下觀察到特異性結合的綠色熒光(圖3),說明B602L重組蛋白Sf9細胞內成功表達。

2.3 B602L重組蛋白的表達鑒定 收獲病變明顯的Sf9細胞,凍融3次后,離心分離上清和細胞沉淀樣品,經western blots檢測,以anti-His鼠源單抗孵育,結果如圖4所示,Sf9細胞沉淀和上清均可顯色出特異性結合條帶,說明B602L重組蛋白可在昆蟲細胞中表達,并可分泌到細胞上清中。取Sf9細胞破碎裂解后上清樣品,進行western blots鑒定,以非洲豬瘟標準陽性血清為一抗(1∶500倍稀釋),仍可顯色出特異性結合條帶,說明昆蟲細胞表達的B602L重組蛋白抗原性良好,可被非洲豬瘟陽性血清識別。

M: 蛋白分子量標準;1: Sf9細胞沉淀,以His單抗為一抗孵育;2: Sf9細胞上清,以His單抗為一抗孵育;3: Sf9細胞上清,以非洲豬瘟陽性血清為一抗孵育M: Protein molecular weight standard; 1: Sf9 cell precipitation, incubated with His monoclonal antibody as primary antibody; 2: Sf9 cell supernatant, incubated with His monoclonal antibody as primary antibody;3: Sf9 cell supernatant, incubated with African swine fever positive serum as primary antibody圖4 Western blots試驗鑒定B602L重組蛋白Fig 4 Identification of B602L recombinant protein by western blots assay

2.4 B602L重組蛋白的純化 將接種B602L桿狀病毒病毒液的Sf9細胞超聲破碎裂解之后,離心收集細胞上清,采用親和層析的方法純化B602L重組蛋白,經SDS-PAGE鑒定,如圖5所示,經His鎳株純化的B602L重組蛋白大小約70 ku左右,BCA法測定B602L純化后蛋白濃度為0.456 mg/mL。

M: 蛋白分子量標準;1: 純化的B602L重組蛋白M: Protein molecular weight standard; 1: Purified B602L recombinant protein圖5 SDS-PAGE鑒定B602L重組蛋白Fig 5 Identification of B602L recombinant protein by SDS-PAGE

2.5 B602L多克隆抗體的制備及驗證 將純化的B602L的蛋白于佐劑充分乳化后,免疫BALB/c小鼠,三免免疫過后同通過小鼠眼眶采血收集血清,并通過間接ELISA試驗和western blots試驗分析B602L小鼠多抗的反應性和效價。間接ELISA結果顯示,B602L小鼠多抗血清的ELISA效價為1∶512000;通過western blots鑒定B602L小鼠多抗與純化后B602L蛋白的反應性,結果顯示1∶250倍稀釋的多抗血清可與純化后B602L蛋白反應(圖6),表明本試驗制備的B602L多克隆抗體與B602L蛋白反應性良好。

3 討論與結論

非洲豬瘟是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要豬傳染病,臨床感染導致豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、高熱、出血等癥狀,疾病病程短死亡率高,高毒力毒株短期內可導致病豬死亡率90%以上。且ASFV的病毒粒子呈正二十面體結構[9-10],因病毒基因組結構龐大,致病機制復雜,目前尚沒有特效藥物和商品化疫苗上市,非洲豬瘟在我國流行早期,快速抗原檢測技術是防控非洲豬瘟的主要防控手段[4,11],但隨著非洲豬瘟在我國進入常態(tài)化防控狀態(tài),弱毒株、亞急性病例不斷增多,病豬排毒不規(guī)律、不明顯,常導致錯誤診斷,因此需要通過血清學診斷技術對ASFV進行輔助診斷[12]。ASFV重組蛋白制備可為血清學診斷技術開發(fā)、亞單位疫苗研發(fā)提供豐富的蛋白原料。

B602L蛋白是ASFV感染晚期表達的一種非結構蛋白,被認為參與P72蛋白折疊修飾過程,是P72蛋白獲得正確構象的分子伴侶,但具體作用以及工作機制尚未明確[9]。前期試驗已證明B602L是ASFV主要抗原性蛋白之一,可被ASFV陽性血清識別[13-14],本實驗室也以B602L原核表達蛋白為抗原包被ELISA板,建立的間接ELISA檢測方法可敏感特異地檢出ASFV臨床陽性樣品,與商品化ASFV ELISA檢測方法的符合率為90%以上(文章未發(fā)表),結果表明B602L蛋白可作為診斷試劑和亞單位疫苗研發(fā)的靶標。

重組蛋白表達是非洲豬瘟研究的熱點,當前常用的技術路線有大腸桿菌原核表達系統(tǒng)[15-16]、昆蟲細胞真核表達系統(tǒng)[17]和哺乳動物細胞真核表達系統(tǒng)[18-19]。如蔣亞君等[20]利用pET-28a系列原核表達載體,成功實現(xiàn)ASFV A104R蛋白在大腸桿菌上清中表達;張凱等[15]利用原核表達的P22蛋白,建立間接ELISA檢測方法,與商品化ASFV抗體檢測試劑盒的符合率為97.7%;王鵬飛[7]建立的基于B602L原核表達蛋白的間接ELISA方法與基于P72的阻斷法ELISA方法符合率為95%,表明以ASFV抗原蛋白為基礎建立血清學檢測方法,操作方便,技術可行。但原核表達蛋白通常只含有蛋白的線性結構[21],缺乏翻譯后修飾過程,在區(qū)分弱陽性血清樣品能力中仍有缺陷,而昆蟲細胞真核表達系統(tǒng)具有表達成功率高、可對蛋白進行部分糖基化修飾、便于懸浮擴大培養(yǎng)的優(yōu)點,受到研究人員的關注。楊揚等[22]利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)實現(xiàn)B602L重組蛋白的表達,但并未分析表達的形式,筆者通過生物軟件分析B602L的信號肽序列,發(fā)現(xiàn)B602L蛋白自身不含信號肽,因此在序列5’端設計蜂毒素信號肽,以提高B602L蛋白的分泌表達水平,有利于后期純化。

為制備B602L真核表達蛋白,本研究以桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達B602L蛋白,并以純化的蛋白免疫小鼠,制備相應的多克隆抗體。結果顯示,通過間接免疫熒光試驗證明B602L蛋白表達成功,western blots結果表明B602L重組蛋白可被標簽抗體和ASFV陽性血清識別,并以細胞分泌上清的形式表達。制備的B602L多克隆抗體通過間接ELISA鑒定,效價為1∶512000,并且western blots結果表明B602L多抗與重組蛋白具有反應性。本研究可為接下來ASFV血清學檢測方法的研發(fā)提供前期基礎。