李小杰，邱 睿，劉 暢，姚晨虓，白靜科，陳玉國(guó)，李淑君

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所/煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲(chóng)害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，許昌 461000）

芽胞桿菌Bacillusspp.是一種嗜溫、好氧、產(chǎn)芽胞的桿狀細(xì)菌，能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子、多種抗菌素和酶，具有廣譜抑菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力[1,2]。貝萊斯芽胞桿菌是芽胞桿菌中新發(fā)現(xiàn)的1 個(gè)種，普遍存在于自然界植物組織、土壤、河水以及海洋中[3-5]。有研究表明，貝萊斯芽胞桿菌具有防治多種植物病害的潛力，同時(shí)具有促生、固氮和抗逆境等多種優(yōu)良功能，是重要的生防資源。郗良卿等[6]從健康甜櫻桃中篩選出優(yōu)質(zhì)拮抗菌株——貝萊斯芽胞桿菌，能夠抑制匍枝根霉Rhizopusstolonifer的生長(zhǎng)，對(duì)櫻桃軟腐病也有良好的防治效果；沙月霞等[7]明確了水稻內(nèi)生菌貝萊斯芽胞桿菌B.velezensisE69是一種潛在的、預(yù)防效果明顯的生防菌株，具有預(yù)防稻瘟病兼防紋枯病等多種真菌病害的應(yīng)用潛力；夏明聰?shù)萚8]明確了貝萊斯芽胞桿菌YB-145 是一株具有生防潛力的菌株，可用于小麥紋枯病的防控，同時(shí)能提高小麥根鮮質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量和地上部高度。

芽胞桿菌主要通過(guò)兩種途徑產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，一是通過(guò)核糖體途徑合成小分子物質(zhì)如肽類(lèi)物質(zhì)、細(xì)菌素、硫肽類(lèi)物質(zhì)（thiopeptide）、萜烯類(lèi)物質(zhì)（terpene）等[9,10]，二是通過(guò)非核糖體途徑合成的脂肽類(lèi)化合物、聚酮類(lèi)化合物和多肽類(lèi)化合物等[11,12]。芽胞桿菌分泌的有益次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁多，但傳統(tǒng)的試驗(yàn)分析和鑒定方法很難全面地分析其中的抑菌活性物質(zhì)且耗時(shí)耗力，同時(shí)難以充分挖掘其相關(guān)基因，揭示其生防作用機(jī)制。全基因組測(cè)序?yàn)檫M(jìn)一步認(rèn)識(shí)和利用生防菌株提供了重要基礎(chǔ)，尤其是隨著測(cè)序技術(shù)的不斷革新以及費(fèi)用的大大降低，越來(lái)越多的芽胞桿菌基因組序列被公布。通過(guò)全基因組信息挖掘，研究者發(fā)現(xiàn)了大量已知或未知的抑菌物質(zhì)合成基因簇。戴利銘等[13]對(duì)一株具有較強(qiáng)抑菌活性的內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌BS-3 進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，預(yù)測(cè)得到10 個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，其中包括6 類(lèi)已知的具有抑菌活性的物質(zhì)和4種功能未知的基因簇；高圣風(fēng)等[14]從生防菌株B.velezensisZ 全基因組信息中發(fā)現(xiàn)編碼次生代謝產(chǎn)物合成的基因簇13 個(gè)，其中有5 個(gè)未知功能基因簇。這些研究結(jié)果不僅有助于解析芽胞桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑，同時(shí)能挖掘新的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為新型生物藥物的開(kāi)發(fā)提供重要資源。

本課題組前期在健康煙株根際土壤中篩選到一株高效生防貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321，本研究測(cè)定了菌株Ba-0321 無(wú)菌濾液對(duì)尖孢鐮刀菌、疫霉菌等煙草主要病原真菌的抑制效果，同時(shí)利用第二代 illumina與第三代Nanopore 相結(jié)合的測(cè)序技術(shù)對(duì)該菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過(guò)GO、COG、KEGG 和antiSMASH等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋和次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇分析，并進(jìn)行相關(guān)功能驗(yàn)證，以期為全面深入解析其抑菌機(jī)制、挖掘次級(jí)代謝產(chǎn)物基因資源和菌株的高效開(kāi)發(fā)利用提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 分離自河南省許昌市煙田健康煙株根際土壤，現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號(hào)CCTCCM2020440）。

植物病原真菌：煙草尖孢鐮刀菌F.oxysporum、煙草疫霉菌P.nicotianae均分離自河南煙田發(fā)病煙株并保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑和儀器 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，布魯克(北京)科技有限公司；DL2000 DNA Marker，北京天根生化科技有限公司。PCR 儀，Applied Biosystems 公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；NanoDrop 2000，賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 所用培養(yǎng)基 貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 培養(yǎng)用LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1000 mL；尖孢鐮刀菌培養(yǎng)用PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g，蒸餾水1000 mL；疫霉菌培養(yǎng)用OA 培養(yǎng)基：燕麥片30 g，蒸餾水1000 mL。固體培養(yǎng)基均添加瓊脂粉15 g/L。121 ℃高壓滅菌20 min。

酪蛋白培養(yǎng)基：干酪素10.0 g，瓊脂20.0 g，pH 7.2；纖維素水解培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，KH2PO41.0 g，酵母浸粉10.0 g，NaCl 5.0 g，羧甲基纖維素鈉 10.0 g，瓊脂15.0 g，pH 7.2；幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：膠體狀幾丁質(zhì)10.0 g，KCl 0.2 g，NH4H2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，瓊脂 20.0 g，超純水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株Ba-0321 無(wú)菌濾液的抑菌能力測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法，將菌株Ba-0321 接種于LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，5000 r/mim 離心10 min，取上清液用0.22 μmol/L 過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌。分別按1%、5%和10%的比例將發(fā)酵濾液加入PDA 或OA 培養(yǎng)基后倒平板，將直徑為5 mm 的尖孢鐮刀菌和疫霉菌菌塊分別置于上述含有不同發(fā)酵濾液的平板中間，以不加濾液處理為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑并拍照，計(jì)算抑菌率，抑菌率（%）=（對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑-處理組菌落生長(zhǎng)直徑）/對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑×100。

1.2.2 菌株Ba-0321 全基因組測(cè)序 采用SDS 提取結(jié)合純化柱（OMEGA）法，提取基因組DNA。利用Nanodrop、Qubit 和0.35%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度、濃度和完整性質(zhì)檢，然后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。采用二代illumina 與三代Nanopore 相結(jié)合的測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。本次測(cè)序委托北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2.3 基因功能注釋 將預(yù)測(cè)得到的基因序列與GO（Gene Ontology）、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）等數(shù)據(jù)庫(kù)做 BLAST+(2.9.0+)比對(duì)，得到基因功能注釋結(jié)果。

1.2.4 抑菌代謝產(chǎn)物分析 采用antiSMASH 程序（version 5.2.0）對(duì)菌株Ba-0321 中次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)合基因注釋結(jié)果和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST 比對(duì)分析結(jié)果，挖掘菌株Ba-0321 可能具有抑菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物及編碼基因簇。

1.2.5 抗菌脂肽合成基因及防御機(jī)制相關(guān)基因的PCR 擴(kuò)增 根據(jù)相似度高的已知芽胞桿菌基因組中Surfactin、Macrolactin、Fengycin、Difficidin、Bacillibactin、Bacillaene 和Bacilysin 脂肽抗生素合成基因（表1）及Ba-0321 菌株基因組中預(yù)測(cè)的防御機(jī)制相關(guān)基因（表2）設(shè)計(jì)引物，以Ba-0321 基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，10 μmol/L 正、反向引物各1 μL，基因組DNA 1 μL（50 ng）為模板，超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 45 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，在BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照。將獲得預(yù)期大小的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序所獲得的序列在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析。

表1 抗菌脂肽合成基因的引物序列Table 1 Primer sequence of antibacterial lipopeptide synthesis gene

表2 防御機(jī)制相關(guān)基因的引物序列Table 2 Primer sequences of resistance related genes

1.2.6 菌株Ba-0321 產(chǎn)酶能力測(cè)定 將菌株Ba-0321 在LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行活化并劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600≈1.0，吸取5 μL 菌液分別點(diǎn)接于酪蛋白培養(yǎng)基、纖維素水解培養(yǎng)基和幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，觀察上述培養(yǎng)基是否產(chǎn)生水解圈，以檢測(cè)菌株是否具有蛋白酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶活性。對(duì)照滴加等量LB 培養(yǎng)液，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 無(wú)菌濾液對(duì)煙草尖孢鐮刀菌和疫霉菌的抑菌能力

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株Ba-0321 無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮刀菌和疫霉菌均具有抑制效果，但不同添加量對(duì)病原菌的抑制效果不同。在相同體積的培養(yǎng)基中，無(wú)菌濾液所占比例越高，抑菌效果越明顯。其中10%無(wú)菌濾液處理對(duì)兩種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率較高，分別可達(dá)57.38%和34.30%，極顯著高于1%和5%無(wú)菌濾液處理。5%無(wú)菌濾液處理對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率極顯著高于1%無(wú)菌濾液的抑菌率；而5%無(wú)菌濾液處理對(duì)疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率與1%無(wú)菌濾液處理無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，菌株Ba-0321 能夠產(chǎn)生具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物，且抑菌活性與代謝產(chǎn)物的含量呈正相關(guān)（圖1）。

圖1 菌株Ba-0321 無(wú)菌濾液不同添加量對(duì)煙草疫霉菌和尖孢鐮刀菌的抑制效果Fig.1 Antifungal effects of strain Ba-0321 against P.nicotianae and F.oxysporum

2.2 貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 全基因組組成

菌株Ba-0321 全基因組大小為4099109 bp，平均GC 含量為46.31%；含有基因4103 個(gè)，其中編碼基因3897 個(gè)，平均長(zhǎng)度932 bp；含有tRNA 基因86 個(gè)，23S rRNA、16S rRNA 和5S rRNA 各9 個(gè)，tmRNA基因1 個(gè)，miscRNA 92 個(gè)。預(yù)測(cè)出基因島10 個(gè)；前噬菌體2 個(gè)；重復(fù)序列202 個(gè)，覆蓋率為0.45%。Ba-0321基因組測(cè)序數(shù)據(jù)提交至GenBank，登錄號(hào)為CP101904，基因組圈圖見(jiàn)圖2。

圖2 貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 基因組圈圖Fig.2 Genome circle map of B.velezensis Ba-0321

2.3 菌株Ba-0321 基因組的GO 功能注釋

將菌株Ba-0321 氨基酸序列與GO 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共得到2992 個(gè)注釋編碼基因，占基因總數(shù)的72.92%，分別按照生物學(xué)過(guò)程（Biological Process）、細(xì)胞組分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）3 個(gè)方面進(jìn)行注釋?zhuān)▓D3）。分類(lèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在生物學(xué)過(guò)程方面，其中有56 個(gè)基因被注釋到抗生素生物合成過(guò)程分類(lèi)中；在分子功能方面，其中有68 個(gè)基因被注釋到水解酶活性分類(lèi)中。另外，菌株Ba-0321 含有纖維素酶、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白等拮抗活性相關(guān)基因和脂多糖生物合成、水楊酸生物合成、乙酰乳酸脫羧酶、乙酰乳酸合酶等誘導(dǎo)抗病性相關(guān)基因。以上結(jié)果表明，菌株Ba-0321 可通過(guò)產(chǎn)抗生素、酶類(lèi)和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等途徑起作用。

圖3 GO 功能分類(lèi)Fig.3 Gene ontology classification

2.4 菌株Ba-0321 基因組的COG 功能注釋

對(duì)菌株Ba-0321 基因組中具有生物學(xué)功能的蛋白編碼基因進(jìn)行COG 注釋?zhuān)Y(jié)果發(fā)現(xiàn)共有2540 個(gè)蛋白編碼基因被注釋?zhuān)▓D4），占基因總數(shù)的61.91%，可分為A～Z 共24 類(lèi)。其中注釋到氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝（Amino Acid Transport and Metabolism）的基因最多，共306 個(gè)，占總注釋基因數(shù)的12.04%；其次為翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成的注釋基因數(shù)為204 個(gè)，占比為8.03%；碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、轉(zhuǎn)錄及未知功能基因分別有191 個(gè)、188 個(gè)和185 個(gè)。值得注意的是，有62 個(gè)參與防御機(jī)制（defence machainsm）的基因被注釋?zhuān)渲芯幋aABC 型多藥轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因最多，有21 個(gè)；其次，編碼多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因6 個(gè)，編碼ABC 型抗菌肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因和肽酶基因各5 個(gè)；編碼焦磷酸酶水解酶基因3 個(gè)，編碼參與碲酸鹽抗性的非特征性保守蛋白基因2 個(gè)。推測(cè)這些基因可能參與了菌株Ba-0321 的抑菌功能。

圖4 COG 結(jié)果分類(lèi)圖Fig.4 Classification diagram of COG results

2.5 菌株Ba-0321 基因組的KEGG 功能注釋

將菌株Ba-0321 與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，對(duì)應(yīng)到KEGG Pathway 的基因有1168 個(gè)，占基因總數(shù)的28.47%，參與28 條代謝通路，其中基因數(shù)超過(guò)50 的代謝通路有15 條（圖5）。KEGG 富集分析結(jié)果表明，碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、Global and overview maps 和氨基酸代謝（Amino acid metabolism）是最主要的3 種代謝通路，分別有377、289 和289 個(gè)基因被注釋。另外，有35 個(gè)基因被注釋到其他次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成途徑，有56 個(gè)基因被注釋到萜類(lèi)化合物和聚酮化合物代謝途徑，推測(cè)這些基因與Ba-0321 抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生具有密切關(guān)系。

圖5 KEGG pathway 結(jié)果分類(lèi)圖Fig.5 Classification diagram of KEGG pathway results

2.6 次級(jí)代謝產(chǎn)物預(yù)測(cè)分析

利用anti-SMASH 對(duì)菌株Ba-0321 基因組進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株共編碼13 個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，其中能夠找到完全相同或相似度達(dá)90%以上的已知基因簇7 個(gè)，相似度在20%以下的有2 個(gè)基因簇，另外有4 個(gè)基因簇未能找到與之相似的已知基因簇（表3）。發(fā)現(xiàn)有7 種抗菌活性物質(zhì)，分別為表面活性素（Surfactin）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素（Macrolactin H）、多烯類(lèi)（Bacillaene）、豐原素（Fengycin）、聚酮類(lèi)化合物difficidin、兒茶酚型嗜鐵素（Bacillibactin）和溶桿菌素（Bacilysin），除Surfactin 與已知菌株BGC0000433 來(lái)源的Surfactin 合成基因簇相似性為91%，其他6 種抗菌素合成基因簇與已知菌株來(lái)源的與之對(duì)應(yīng)的基因簇相似性均達(dá)100%。Cluster 1 與已知菌株BGC0000926 來(lái)源的rhizocticin A 合成基因簇相似性較小，為22%，Cluster 3 與已知菌株BGC0000693 來(lái)源的butirosin A/B 合成基因簇相似性最小，僅為7%。比對(duì)還發(fā)現(xiàn)該菌基因組中存在4 種未知功能的基因簇（Cluster 4、8、9、12），其中萜類(lèi)（Terpene）2 種，T3PKS（Type III PKS）類(lèi)1 種、非核糖體肽合成酶（NRPS）1 種。以上結(jié)果表明，菌株Ba-0321中存在多種產(chǎn)生抑菌次生代謝產(chǎn)物的基因簇，同時(shí)也存在合成新抑菌物質(zhì)的基因簇，具有較大的生防應(yīng)用潛力。

表3 菌株Ba-0321 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇Table 3 Gene clusters of secondary metabolite of Ba-0321

2.7 菌株Ba-0321 基因組中抗菌脂肽合成基因和防御機(jī)制相關(guān)基因的擴(kuò)增

根據(jù)菌株Ba-0321 全基因組序列中編碼Surfactin、Macrolactin、Fengycin、Difficidin、Bacillibactin、Bacillaene 和Bacilysin 脂肽合成酶基因（表1）及防御機(jī)制相關(guān)基因（表2）所設(shè)計(jì)的特異引物，以Ba-0321基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出明亮且單一的條帶，且片段大小與預(yù)期一致（圖6）。序列分析結(jié)果表明，擴(kuò)增獲得的PCR 產(chǎn)物序列與設(shè)計(jì)的目標(biāo)基因片段序列同源性均為100%，與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他B.velezensis菌株基因組中相對(duì)應(yīng)的基因序列同源性在91%～100%，進(jìn)一步證實(shí)了菌株Ba-0321 基因組中確實(shí)存在抑菌活性物質(zhì)合成基因簇及防御機(jī)制相關(guān)基因。

圖6 抗菌脂肽和抗性相關(guān)基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR amplification results of antimicrobial lipopeptide and resistance related genes

2.8 菌株Ba-0321 產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶的能力

酶活性測(cè)定結(jié)果表明，菌株Ba-0321 可使酪蛋白培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基產(chǎn)生水解圈，顯色反應(yīng)中使纖維素剛果紅培養(yǎng)基紅色消失，產(chǎn)生透明圈，說(shuō)明該菌株具有產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和纖維素酶的能力（圖7）。

圖7 蛋白酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定Fig.7 Determination of protease, cellulase and chitinase activities

3 討論

貝萊斯芽胞桿菌能分泌產(chǎn)生酶、抗菌蛋白、脂肽類(lèi)抗生素、聚酮類(lèi)抗生素、植物激素等多種生物活性物質(zhì)，對(duì)抑制病原菌起著重要作用[9,15]。本研究通過(guò)共培養(yǎng)的方法明確了貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 無(wú)菌濾液對(duì)尖孢鐮刀菌和疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，說(shuō)明該菌株可分泌胞外抑菌代謝產(chǎn)物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其胞外代謝產(chǎn)物的含量與抑制率的正相關(guān)性，但未明確其抑菌物質(zhì)的種類(lèi)。進(jìn)一步通過(guò)全基因組測(cè)序及基因功能注釋?zhuān)瑥姆肿由飳W(xué)的角度推測(cè)出一些與其抑菌功能相關(guān)的基因，如編碼肽酶、水解酶、多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、纖維素酶、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、抗生素生物合成等基因，以及參與萜類(lèi)化合物、聚酮化合物代謝途徑的基因等，同時(shí)推測(cè)出菌株Ba-0321 基因組中還含有誘導(dǎo)抗病性相關(guān)基因，表明菌株Ba-0321 可能通過(guò)多種途徑抑制病原菌的生長(zhǎng)，這與前人的研究[9,15]基本一致。通過(guò)對(duì)該菌株基因組中抑菌相關(guān)基因的分子驗(yàn)證和抗性相關(guān)酶活力測(cè)定[16]，進(jìn)一步證實(shí)了該基因組測(cè)序結(jié)果的可靠性，初步明確了該菌株的抑菌機(jī)制。下一步將進(jìn)行抑菌相關(guān)基因挖掘、胞外抑菌活性物質(zhì)的分離提取及微生物農(nóng)藥的研發(fā)與利用。

本研究采用antiSMASH 工具預(yù)測(cè)菌株Ba-0321 的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，得到脂肽類(lèi)和聚酮類(lèi)抗生素合成基因簇13 個(gè)，其中有7 個(gè)相似性很高的抗生素合成基因簇，如Surfactin、Macrolactin、Bacillaene、Fengycin、difficidin、Bacillibactin 和Bacilysin，這與前人研究基本一致[17-20]。其中，Macrolactin 是一類(lèi)由聚酮鏈環(huán)化而成的新型化合物，到目前為止，一共鑒定出26 種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物Macrolactin A-Z 及其衍生物，且大部分是從海洋芽胞桿菌中獲得[21,22]，多項(xiàng)研究證明大環(huán)內(nèi)酯Macrolactin 對(duì)多種植物病原菌具有顯著的抑制作用[23-25]。本研究從貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 中預(yù)測(cè)出Macrolactin H 合成基因簇，并通過(guò)分子驗(yàn)證了該抗生素合成基因簇確實(shí)存在于Ba-0321 基因組中，進(jìn)一步豐富并證實(shí)了該物質(zhì)可存在于多種芽胞桿菌中，但該物質(zhì)是否對(duì)煙草尖孢鐮刀菌和疫霉菌等病原真菌具有抑制效果還需進(jìn)一步研究。目前關(guān)于Rhizocticins和Butirosin 抗生素相關(guān)的研究還較少[26,27]。本研究中發(fā)現(xiàn)的Rhizocticin A 抗生素合成基因簇與BGC0000926來(lái)源的相似度僅為22%，Butirosin 抗生素合成基因簇與BGC0000693 來(lái)源的相似度僅為7%，說(shuō)明這些基因簇可能合成了新的抑菌物質(zhì)。菌株Ba-0321 基因組中還存在4 種未知的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，有待于今后進(jìn)一步挖掘研究。該研究為新型微生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供了很好的資源。