王 歡，陳煜民，李 凱，張微微*，鄧建玲*

（1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)系，上海 201699；2.東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海 201620）

Kr-h1（Krüppel-homolog 1）是一種含有C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子[1]，協(xié)同Met 基因與E93 基因，由這三者作為關(guān)鍵因子共同組成了MEKRE93 通路，并控制著變態(tài)[2]。Met 基因協(xié)同保幼激素通過結(jié)合Kr-h1基因上游應(yīng)答原件來激活Kr-h1[3]，Broad 復(fù)合體作為蛻皮激素信號(hào)通路的重要節(jié)點(diǎn)，E93 轉(zhuǎn)錄因子作為觸發(fā)成蟲特征出現(xiàn)的關(guān)鍵因子，均受到Kr-h1 基因的調(diào)控[4]。Kr-h1 作為昆蟲變態(tài)發(fā)育重要因子，主要參與保幼激素對(duì)于昆蟲變態(tài)發(fā)育的調(diào)控[5]，在昆蟲翅型分化[6]、社會(huì)化分工[7]、神經(jīng)系統(tǒng)形成[8]與卵巢發(fā)育[9,10]等生理過程中都發(fā)揮著重要的作用，是近年來研究昆蟲變態(tài)發(fā)育與害蟲生物防治的重要靶標(biāo)分子。

鑒于Kr-h1 在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中的重要性，無論是Kr-h1 抑或C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)均已發(fā)現(xiàn)在昆蟲中相當(dāng)保守[11]，而Kr-h1 本身的磷酸化位點(diǎn)及其激素調(diào)控[12]，也已證明在昆蟲中是進(jìn)化保守的。但對(duì)Kr-h1 進(jìn)化的研究尚不充分，其在不同昆蟲中表達(dá)模式的共性尚未明確，因此，全面分析Kr-h1 在不同目昆蟲中的蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與基因表達(dá)模式及其進(jìn)化特征，或可用于限制Kr-h1 在昆蟲化蛹或者蛹期變態(tài)時(shí)的表達(dá)、阻斷保幼激素代謝通路，進(jìn)而起到阻礙有害昆蟲正常變態(tài)發(fā)育的目的，這可能成為菜粉蝶等農(nóng)業(yè)害蟲生物防治的新策略。

本研究基于菜粉蝶Kr-h1 基因與NCBI 序列數(shù)據(jù)，解析了昆蟲Kr-h1 基因結(jié)構(gòu)、序列比對(duì)、保守結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)與表達(dá)模式分析，并重構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹。以期從基因結(jié)構(gòu)、蛋白特性、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式四個(gè)角度對(duì)不同昆蟲Kr-h1 基因進(jìn)行分析，進(jìn)一步揭示該基因保守結(jié)構(gòu)特征及表達(dá)模式，為研究Kr-h1 在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮的生物學(xué)功能與害蟲的生物防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

菜粉蝶1 齡幼蟲、3 齡幼蟲、5 齡幼蟲、蛹期與成蟲期5 個(gè)不同生長發(fā)育時(shí)期Kr-h1 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與成蟲基因組數(shù)據(jù)為本實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)序拼接而成。本研究中涉及到的其他昆蟲的相關(guān)Kr-h1 序列均下載自NCBI數(shù)據(jù)庫（表1）。使用課題組提供的菜粉蝶Kr-h1 基因序列以及在NCBI 網(wǎng)站上檢索并下載目前已確定的昆蟲Kr-h1 序列及其注釋文件。利用GSDS 在線工具（http://gsds.gao-lab.org/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖，分析基因結(jié)構(gòu)，明確Kr-h1 基因在不同昆蟲中外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量與位置。

表1 NCBI 下載的昆蟲Kr-h1 蛋白序列Table 1 Insect Kr-h1 sequences downloaded from NCBI

1.2 昆蟲Kr-h1 蛋白的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析

利用ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）得到Kr-h1 蛋白理化性質(zhì)和氨基酸組成。利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)Kr-h1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組成；使用SWISS-MODEL 在線網(wǎng)站（https://swissmodel.expasy.org/），預(yù)測(cè)Kr-h1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用NetPhos-3.1Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)；通過CBS 網(wǎng)站( http:∥www.cbs.dtu.dk/) 預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)。使用SMART 在線軟件（http://smart.emblheidelberg.de/）對(duì)不同昆蟲的Kr-h1 蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用MEME（https://prosite.expasy.org/scanprosite/）在線工具分析不同目昆蟲Kr-h1 蛋白的保守基序?qū)EME 預(yù)測(cè)得到的文件儲(chǔ)存為XML 格式，導(dǎo)入Tbtool軟件中，繪制保守基序圖。

1.3 昆蟲Kr-h1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGAX 軟件（http://www.megasoftware.net/）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并分析其保守結(jié)構(gòu)域氨基酸位點(diǎn)的特征。使用MEGAX 軟件，構(gòu)建昆蟲Kr-h1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析昆蟲Kr-h1 的進(jìn)化特征。

1.4 昆蟲Kr-h1 基因的表達(dá)模式分析

本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的菜粉蝶1 齡幼蟲、3 齡幼蟲、5 齡幼蟲、蛹期及成蟲期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并根據(jù)文獻(xiàn)篩選出本次研究相關(guān)的Kr-h1 蛋白基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)[13-19]。通過相對(duì)蛹期或最后幼蟲期作歸一化處理，并構(gòu)建熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲Kr-h1 的基因結(jié)構(gòu)

Kr-h1 基因包含2～4 個(gè)外顯子，以2 個(gè)外顯子組成為主。故種間內(nèi)含子數(shù)目差異較小，但種間內(nèi)含子距離相差較大，范圍涵蓋100 bp 至4 kb。斷裂最明顯的是蚤目的貓?jiān)榕c雙翅目的黑腹果蠅，其Kr-h1 基因由4個(gè)外顯子與3 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。通過序列觀察可知，昆蟲Kr-h1 基因內(nèi)含子剪切位點(diǎn)滿足GT-AG 規(guī)則（圖1）。

2.2 昆蟲Kr-h1 蛋白氨基酸組成分析

序列相似性分析結(jié)果顯示，菜粉蝶Kr-h1 蛋白與除了與同為鱗翅目的家蠶相似度較高外，與其他目昆蟲的相似度都在60%上下（表2）。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，昆蟲Kr-h1 蛋白均含8 個(gè)保守的C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)，且所有鋅指結(jié)構(gòu)攜有共同序列：賴氨酸-X2～4-賴氨酸-X8～9-亮氨酸-X2-組氨酸-X3-組氨酸（圖2），提示該基因在進(jìn)化中功能保守性較好。

Kr-h1 蛋白在不同目昆蟲中差異較大，分子量在39 K～91 K，等電點(diǎn)PI 在9.15～6.84。Kr-h1 中含量最豐富的氨基酸都是絲氨酸，其次為脯氨酸，通過對(duì)保守結(jié)構(gòu)域的分析發(fā)現(xiàn)這可能與其鋅指結(jié)構(gòu)組成有關(guān)。

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)

Kr-h1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果表明：多數(shù)昆蟲Kr-h1 約20%為α-螺旋，無規(guī)卷曲占約60%，延伸鏈約15%。菜粉蝶α-螺旋占比只有9.63%，同時(shí)無規(guī)卷曲的占比卻高達(dá)72.24%，表現(xiàn)出與其他昆蟲不同的結(jié)構(gòu)特性（表3）。

昆蟲Kr-h1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)表明，昆蟲Kr-h1 蛋白都具有8 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，而每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)又由一個(gè)α-螺旋與一個(gè)β-折疊構(gòu)成（圖3），使得Kr-h1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組成相對(duì)穩(wěn)定。通過圖中可以看出，雖然菜粉蝶Kr-h1 蛋白具有較多的無規(guī)卷曲比例，其Kr-h1 蛋白與其他昆蟲在保守結(jié)構(gòu)上無明顯差異。

圖3 四種昆蟲Kr-h1 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Tertiary structure prediction of four insect Kr-h1 protein

2.4 保守基序與結(jié)構(gòu)域

昆蟲中的Kr-h1 蛋白大部分含有相同的基序構(gòu)成（圖4）。Motif 1～8 為所有Kr-h1 蛋白的共有結(jié)構(gòu)域，但是其中motif 1～6 共同構(gòu)成Kr-h18 個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)（圖5），motif 9 與motif 10 保守性較差，結(jié)合進(jìn)化樹分析（圖6）發(fā)現(xiàn)，motif 9 僅存在于進(jìn)化樹的下半部分，motif 10 只在鱗翅目的菜粉蝶、家蠶、草地貪夜蛾和玉帶鳳蝶中存在，與之類似的Motif15 同樣只存在于鞘翅目昆蟲中，體現(xiàn)出在長期進(jìn)化過程中鱗翅目昆蟲與鞘翅目昆蟲獨(dú)特的進(jìn)化選擇。

圖4 昆蟲Kr-h1 蛋白保守基序分析Fig.4 Conserved motifs in insect Kr-h1 protein

圖5 昆蟲Kr-h1 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.5 Conserved domain prediction of insect Kr-h1 protein

圖6 昆蟲Kr-h1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on insect Kr-h1 protein

2.5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

昆蟲綱9 個(gè)目計(jì)40 種昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖6 所示，Kr-h1 蛋白在進(jìn)化樹分支上存在明顯種屬特征，同目昆蟲多為單系群存在，表明Kr-h1 蛋白為直系同源，分化晚于目分化，如菜粉蝶Kr-h1 與同目的家蠶Kr-h1 最為接近。但半翅目為非單系群，有待進(jìn)一步研究。

分別重構(gòu)Zn1～Zn8 的鋅指蛋白基因進(jìn)化樹圖。結(jié)果如圖7 所示，Zn1-8，不同昆蟲的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不一，表明不同鋅指結(jié)構(gòu)基因進(jìn)化存在差異。Zn1 與Zn8 進(jìn)化樹中不同昆蟲間較為分散，相互之間遺傳距離較遠(yuǎn)，序列差異度大，即Zn1 與Zn8 保守性不足（圖7A，圖7H）。在Zn2 中可明顯發(fā)現(xiàn)部分昆蟲序列差異較小，這說明在昆蟲長期進(jìn)化過程中Zn2 的保守性較好（圖7B），其余鋅指結(jié)構(gòu)亦呈現(xiàn)類似Zn2 特征。

圖7 昆蟲Kr-h1 蛋白Zn1～Zn8 的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.7 Phylogenetic analysis based on Zn1―Zn8 of insect Kr-h1 protein

2.6 昆蟲Kr-h1 基因的表達(dá)模式分析

從圖8 中可知，Kr-h1 在幼蟲階段的表達(dá)明顯高于蛹期。在幼蟲早期階段Kr-h1 的明顯高表達(dá)，特別是果蠅中幼蟲早期階段的表達(dá)量數(shù)據(jù)達(dá)到了蛹期表達(dá)量的4 倍以上，在鱗翅目梨小食心蟲中也有著相似的表達(dá)趨勢(shì)。發(fā)育中期大部分昆蟲Kr-h1 的表達(dá)量都有所回落，其中屬于鱗翅目的梨小食心蟲與鞘翅目的赤擬谷盜中這一趨勢(shì)較為明顯，提示與迅速生長與頻繁蛻皮有關(guān)。在黑腹果蠅與梨小食心蟲中，幼蟲末期Kr-h1 的表達(dá)量與蛹期差距不大，但是在赤擬谷盜與桔小實(shí)蠅中卻出現(xiàn)明顯差距。在成蟲階段可見Kr-h1的表達(dá)有部分回升，例如黑腹果蠅與梨小食心蟲。

圖8 昆蟲Kr-h1 基因表達(dá)模式Fig.8 Insect Kr-h1 gene express pattern

在不完全變態(tài)昆蟲中，同樣體現(xiàn)出了與完全變態(tài)昆蟲類似的表達(dá)模式，都與昆蟲的發(fā)育階段高度相關(guān)。例如在幼蟲早期中高表達(dá)，幼蟲中期表達(dá)下降，幼蟲后期有所回升。由于不完全變態(tài)昆蟲并沒有蛹期，最后一個(gè)幼蟲期Kr-h1 同樣會(huì)出現(xiàn)低表達(dá)，這與完全變態(tài)昆蟲中Kr-h1 在蛹期的表達(dá)趨勢(shì)一致，體現(xiàn)出Kr-h1在完全變態(tài)昆蟲或者不完全變態(tài)昆蟲中表達(dá)模式高度相似。

3 討論

本研究結(jié)果表明，Kr-h1 外顯子數(shù)量保守，內(nèi)含子長度變異較大。Kr-h1 蛋白二維與三維結(jié)構(gòu)的保守性與8 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的保守性，共同促進(jìn)了Kr-h1 蛋白功能的穩(wěn)定性。系統(tǒng)發(fā)育分析昆蟲Kr-h1 為直系同源，親緣關(guān)系與物種進(jìn)化相吻合，基于鋅指結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育則表現(xiàn)Kr-h1 不同模塊進(jìn)化中的差異。

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明在長期進(jìn)化過程中Kr-h1 基因較為保守，斷裂程度不高，由此推測(cè)其編碼蛋白在不同昆蟲中的結(jié)構(gòu)變化不大且作用相似。結(jié)合進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)Kr-h1 基因結(jié)構(gòu)的變化與昆蟲的生活習(xí)性呈現(xiàn)一定關(guān)聯(lián)性，在進(jìn)化樹中同屬于一個(gè)單系群，同時(shí)基因結(jié)構(gòu)也更為相似，這暗示著Kr-h1 的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化伴隨著昆蟲生活習(xí)性演化。此外，可變剪切如在果蠅體內(nèi)存在著Kr-h1 的三種剪切亞型α、β與λ[16]，亦有可能是進(jìn)化的形式。

通過對(duì)于Kr-h1 蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Kr-h1 蛋白在不同昆蟲中理化性質(zhì)并沒有體現(xiàn)出明顯規(guī)律，但在大多數(shù)昆蟲中都具有明顯的絲氨酸偏好性，進(jìn)一步通過磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，這種絲氨酸偏好性與絲氨酸磷酸化調(diào)控Kr-h1 生物學(xué)活性有關(guān)[20]。二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組成分析發(fā)現(xiàn)Kr-h1 蛋白在不同昆蟲中各二級(jí)結(jié)構(gòu)比例較為穩(wěn)定。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、保守結(jié)構(gòu)域及氨基酸序列分析顯示，Kr-h1 蛋白在不同昆蟲中具有8 個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)，其共有序列特征為：賴氨酸-X2～4-賴氨酸-X8～9-亮氨酸-X2-組氨酸-X3-組氨酸。進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，這8 個(gè)鋅指的保守性存在差異，處于首尾位置的Zn1 和Zn8 保守性較低，Zn2～Zn7 的保守性較高。推測(cè)這與不同物種間Kr-h1 的功能差異有關(guān)。同時(shí)，在少數(shù)昆蟲中，亦發(fā)現(xiàn)可能存在Zn1 確實(shí)的情況[21]，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在表達(dá)模式分析中發(fā)現(xiàn)，Kr-h1 表達(dá)水平顯示出了與發(fā)育階段高度的相關(guān)性。在在幼蟲早期高表達(dá)，不同物種幼蟲期高低各異，但總體上幼蟲中后期有所回落，蛹期（完全變態(tài)）或末齡若蟲階段（不完全變態(tài)）維持低水平表達(dá)，在成蟲期又出現(xiàn)明顯回升。成蟲期Kr-h1 表達(dá)量的回升，考慮到Kr-h1 有著調(diào)控生殖行為，影響果蠅產(chǎn)卵的作用，推測(cè)昆蟲在Kr-h1 在成蟲階段參與調(diào)控昆蟲繁殖過程調(diào)控。同時(shí)，卵巢成熟與Kr-h1 蛋白表達(dá)的相關(guān)性，進(jìn)一步提示Kr-h1 作為藥物靶點(diǎn)的可行性[22]。此外不同組織內(nèi)Kr-h1 的表達(dá)變化還有待探索，后續(xù)可以探索使用多種昆蟲原始測(cè)序數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探究Kr-h1 的功能表達(dá)特征。

正如Gilbert[23]所述，昆蟲發(fā)育的研究對(duì)于防治具有無可估量的價(jià)值，通過挖掘發(fā)育中的關(guān)鍵基因，既可直接采用RNA 干擾等措施直接防治，亦可為害蟲防控策略的探索提供重要參考。因此，從發(fā)育分子生物學(xué)視角挖掘昆蟲變態(tài)分子機(jī)制，可為菜青蟲等害蟲生物防治提供更多的防治策略與手段。通過菜粉蝶Kr-h1 基因及其編碼蛋白的鑒定、相關(guān)保守結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化分析和不同昆蟲的表達(dá)模式分析，豐富了我們對(duì)昆蟲Kr-h1 蛋白的認(rèn)識(shí)，但是對(duì)于昆蟲Kr-h1 蛋白功能方面的研究尚未完全清晰，而上述研究也為今后進(jìn)一步研究昆蟲Kr-h1 的功能以及其在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。Kr-h1 蛋白在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中起到的作用不言而喻，因此上述對(duì)昆蟲Kr-h1 基因及其編碼蛋白的研究為尋找新型生物農(nóng)藥靶點(diǎn)提供了有利參考，為菜粉蝶等農(nóng)業(yè)害蟲的防治策略開辟了新思路，其實(shí)踐意義重大。