劉佳順，安會敏，陳 圓，李 適,3,4，黃怡雯，陳金亨，張章漢，黃建安,3,4,*，劉仲華,3,4,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南省植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評價利用重點實驗室，湖南 長沙 410128；5.湖南中茶茶業(yè)有限公司，湖南 長沙 410200）

黑茶是我國特有的茶類，以其獨特的風(fēng)味和健康功效[1]深受消費者喜愛。香氣是決定茶葉品質(zhì)的重要因素[2-4]，不同類型的黑茶特征香氣存在較大差異，如茯磚茶有特殊的“菌花香”；天尖茶香氣純濃、帶松煙香；六堡茶則有“檳榔香”等[5]。已有研究表明，醇類、醛類、酮類、酯類、酚類、碳?xì)漕悺⒑?、雜氧類物質(zhì)等揮發(fā)性成分是黑茶的主要呈香成分[6]。

窨制是加工茉莉花茶的關(guān)鍵工序，是指將茶坯與茉莉鮮花拼合，使得“茶引花香，增益茶味”的過程。已有研究表明，窨制工藝能夠在一定程度上協(xié)調(diào)并豐富茶坯香氣，賦予茶坯鮮靈的茉莉花香[7]。但是以往關(guān)于茉莉花茶的研究一般以茉莉綠茶、茉莉紅茶為研究對象[8-10]，且以多窨次、多配花量的窨制技術(shù)為優(yōu)。而以黑茶為茶坯窨制成茉莉黑茶，同時研究窨制工藝對黑茶香氣成分及品質(zhì)的影響鮮有報道。

綜上所述，本研究以茯磚茶、天尖茶和龍珠茶（龍珠茶為由天尖原料經(jīng)蒸氣蒸壓、干燥等工藝加工成的形似龍珠的黑茶）共3 種類型的黑茶為茶坯原料窨制成茉莉黑茶，并采用固相微萃取技術(shù)結(jié)合全二維氣相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-Q-TOF-MS）技術(shù)對這3 種黑茶及茉莉黑茶樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行系統(tǒng)解析，旨在探究窨制對黑茶香氣成分及品質(zhì)的影響，為茉莉黑茶加工技術(shù)及品質(zhì)提升提供理論基礎(chǔ)，激發(fā)茉莉黑茶市場潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯磚黑茶（FZ）、天尖黑茶（TJ）、龍珠黑茶（LZ）由湖南安化六步七步茶業(yè)有限公司加工并提供。

癸酸乙酯 美國Sigma-Aldrich公司；C5～C25正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 美國Organic Standards Solutions International公司；乙醇（色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯型磁力加熱攪拌器 美國Talboys公司；8890氣相色譜儀、7250四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；SSM1800調(diào)制器 雪景電子科技（上海）有限公司；固相微萃取手動進(jìn)樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品加工

參考An Huimin等[11]的加工技術(shù)（圖1）分別對茯磚、天尖、龍珠進(jìn)行窨制，按照茶花比1∶1的比例，茉莉鮮花與黑茶茶坯拼合窨制，當(dāng)窨制的茉莉花呈略萎蔫狀態(tài)時，將花與茶葉分離，然后在約40 ℃干燥4～5 h，即得茉莉茯磚（JFZ）、茉莉天尖（JTJ）、茉莉龍珠（JLZ）。

圖1 茉莉黑茶（JFZ、JTJ、JLZ）加工流程Fig.1 Processing flow chart of jasmine dark tea (JFZ, JTJ and JLZ)

1.3.2 頂空固相微萃取條件

優(yōu)化An Huimin等[11]萃取茉莉花茶揮發(fā)性成分的方法。稱取樣品磨碎茶樣1 g，放入15 mL頂空瓶中。加入磁力轉(zhuǎn)子與溶有5 μL癸酸乙酯溶液（10 mg/L）的5 mL沸水后，迅速擰緊瓶蓋，置于磁力攪拌加熱臺上，以80 ℃、600 r/min加熱攪拌10 min后，將已老化（250 ℃老化30 min）的萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）插入樣品瓶的頂空部分，推出萃取頭離液面1 cm處。在80 ℃、600 r/min攪拌加熱條件下，吸附40 min，使樣品瓶中的香氣物質(zhì)達(dá)到氣-液和氣-固平衡。然后將萃取頭插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口，250 ℃熱解吸5 min，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。所有樣品重復(fù)3 次。

1.3.3 GC×GC-Q-TOF條件

G C 條件：第1 根色譜柱為H P-5 M S（3 0 m×0.25 mm，0.25 μm）；第2根色譜柱為DB-17MS（2.89 m×0.18 mm，0.18 μm）；調(diào)制柱為C5～C30的HV系列。升溫程序：初溫40 ℃保持0 min，以6 ℃/min升到90 ℃，保持0 min，以5 ℃/min升至120 ℃，再以6 ℃/min升至230 ℃，保持2 min；調(diào)制器：進(jìn)口熱區(qū)溫度為初溫110 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min升到300 ℃，保持10 min；出口熱區(qū)為170 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min升至320 ℃，保持15 min；冷區(qū)溫度為-50 ℃；調(diào)制周期為4 s。載氣（He，99.999%）流速3.0 mL/min，分流比50∶1。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度200 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z45～450。

1.3.4 揮發(fā)性成分定性定量分析

定性方法：采用全二維數(shù)據(jù)處理工作站軟件Canvas載入數(shù)據(jù)，自動繪制全二維TIC輪廓圖，并對圖中信噪比大于10的峰自動識別，標(biāo)識出的每一個峰點即代表一種化合物，進(jìn)一步采用NIST20譜庫檢索（匹配度大于800）和保留指數(shù)對標(biāo)識出的化合物進(jìn)行定性分析。

保留指數(shù)（retention index，RI）定性[12]：在相同色譜條件下，分別將樣品與正構(gòu)烷烴（C5～C25）前后進(jìn)樣進(jìn)行分析，RI按式（1）計算，并與數(shù)據(jù)庫中報道的RI對比，將絕對值相差10以內(nèi)的確定為同一化合物。

式中：n為該化合物前一碳標(biāo)的原子數(shù)；tx為該化合物的保留時間/min；tn為該化合物前一碳標(biāo)的保留時間/min；tn＋1為該化合物后一碳標(biāo)的保留時間/min。

定量方法：以癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法對揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定量，按式（2）計算：

式中：Ci為待測組分i的含量/（ng/g）；Ws為加入內(nèi)標(biāo)s的質(zhì)量/ng；Ai和As分別為待測組分i和內(nèi)標(biāo)化合物s的峰面積；m為待測樣品的質(zhì)量/g；fi為待測組分i對內(nèi)標(biāo)s的相對質(zhì)量校正因子；本實驗中各待測組分i的相對校正因子均為1[13]。

1.3.5 感官審評

由高級評茶師、評茶師、高級評茶員組成的7 人審評小組，參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[14]中黑茶與茉莉花茶的審評方法對黑茶及茉莉黑茶樣品進(jìn)行密碼審評并分別評價樣品中木香、茉莉花香、陳香、松煙香和菌花香的強(qiáng)度，“0=沒有”，“5=非常強(qiáng)烈”，最終用7 人的平均分?jǐn)?shù)代表樣品中各香氣屬性的強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型黑茶窨制前后香氣品質(zhì)分析

圖2顯示了3 種類型的黑茶窨制前后的香氣特性，包括5 個屬性（木香、茉莉花香、陳香、松煙香和菌花香）。不同樣品的香氣屬性不同，說明不同類型的黑茶香氣不同，且窨制后的茉莉黑茶香氣與窨制前黑茶的香氣有明顯差異。

圖2 3 種類型黑茶及茉莉黑茶的感官評價圖Fig.2 Sensory evaluation of three types of dark tea and jasmine dark tea

茯磚的陳香（4）和木香（3）得分較高，且有特殊的菌花香（1），窨制后的茉莉茯磚陳香（1）和木香（2）強(qiáng)度降低，但出現(xiàn)較強(qiáng)的茉莉花香（4）；天尖的陳香（3）得分較高，且?guī)в兴蔁熛悖?），窨制后的茉莉天尖陳香（1）和松煙香（1）強(qiáng)度降低，有濃郁的茉莉花香（5）；龍珠的陳香（3）和木香（3）得分較高，窨制后的茉莉龍珠陳香（1）和木香（2）強(qiáng)度較低，有明顯的茉莉花香（3）。供試茶葉窨制后均提升茉莉花香，且原有香氣強(qiáng)度降低。

綜上所述，窨制工藝不僅使黑茶吸附茉莉花釋放的花香，同時，隨著茶坯中水分、溫度等因子的綜合作用，黑茶原有的陳香、木香、松煙香強(qiáng)度和比例也發(fā)生了改變。

2.2 不同類型黑茶窨制前后揮發(fā)性成分分析

對3 種類型的黑茶及茉莉黑茶樣品進(jìn)行揮發(fā)性成分檢測，共定性定量了366 種揮發(fā)性成分，如表1所示。其中醇類38 種、醛類36 種、酮類53 種、酯類57 種、酚類17 種、雜環(huán)類24 種、其他10 種，烴類種類最多，有131 種。

表1 3 種黑茶窨制前后揮發(fā)性成分及含量Table 1 Contents of volatile components in three types of black tea before and after scenting

進(jìn)一步結(jié)合表1與圖3可知，黑茶中苯甲醛、2-戊基呋喃、甲基庚烯酮等一些揮發(fā)性成分含量較高（圖3A），窨制后的茉莉黑茶中苯甲醇、芳樟醇、α-法呢烯、吲哚等存在于茉莉花中的揮發(fā)性成分含量顯著升高（圖3B），且窨制后的3 種茉莉黑茶中酯類物質(zhì)總量較高，這可能是由于窨制過程中黑茶吸附了茉莉鮮花中的酯類物質(zhì)[15]。

圖3 3 種類型黑茶窨制前后揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatograms of volatile components in three types of dark tea and jasmine dark tea

2.3 不同類型黑茶窨制前后特征揮發(fā)性成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）法和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）能全面的歸納、整理和統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，可以較為客觀地反映樣品的變化、分類以及變化趨勢等[16]。為進(jìn)一步探究窨制對黑茶揮發(fā)性成分的影響，明確茉莉黑茶特征香氣成分，本研究采用PCA和OPLS-DA對3 種黑茶及茉莉黑茶進(jìn)行差異性分析。

如圖4A所示，LZ、FZ、TJ樣品分布在Y軸左側(cè)，JLZ、JFZ、JTJ樣品分布在Y軸右側(cè)，進(jìn)一步將LZ、FZ、TJ設(shè)為黑茶組，JLZ、JFZ、JTJ設(shè)為茉莉黑茶組進(jìn)行OPLS-DA如圖4B所示，R2Y=0.99，Q2=0.984，黑茶組樣品與茉莉黑茶組樣品分別分布于縱坐標(biāo)軸的兩側(cè)，表明兩組間差異明顯。圖5是該模型的質(zhì)量交叉驗證檢驗結(jié)果，R2=0.198，Q2=-0.721，表明該OPLS-DA模型不存在過擬合現(xiàn)象。

圖4 窨制前后黑茶揮發(fā)性成分PCA得分圖及OPLS-DA得分圖Fig.4 PCA score and OPLS-DA score plots of volatile components in black tea before and after scenting

圖5 置換檢驗圖Fig.5 Permutation test plot

基于OPLS-DA模型繪制載荷散點圖（圖6A），并根據(jù)變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值大于1可認(rèn)為該變量為該判別模型的潛在差異物質(zhì)（圖6B）[17]，可知窨制后的茉莉黑茶中順-3-己烯醇、苯甲醇、芳樟醇、反式-2,4-庚二烯醛、月桂烯、反式-β-羅勒烯、α-法呢烯、姜烯、α-杜松烯、4-己烯-1-醇乙酸酯、苯甲酸甲酯、乙酸芐酯、丁酸葉醇酯、水楊酸甲酯、二甲基丁酸葉醇酯、順-3-己烯基巴豆酸酯、2-甲基-2-丁烯酸葉醇酯、鄰氨基苯甲酸甲酯、苯甲酸丁酯、順式-3-己烯酸順式-3-己烯酯、鄰甲氨基苯甲酸甲酯、順式-3-己烯基苯甲酸酯、3-己烯基苯甲酸酯、苯甲酸乙酯、甲基庚烯酮、反式-香葉基丙酮、順反-β-紫羅蘭酮和吲哚的含量較未窨制的黑茶高；而黑茶中順式-氧化芳樟醇、反式-芳樟醇氧化物、正己醛、苯甲醛、壬醛、甲苯、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、反,反-3,5-辛二烯-2-酮、2-甲氧基-4-甲基苯酚和2-戊基呋喃的含量較窨制后的茉莉黑茶高。綜上所述，以上38 種揮發(fā)性成分是區(qū)別黑茶窨制前后香氣品質(zhì)的特征揮發(fā)性成分。

圖6 VIP值大于1的揮發(fā)性物質(zhì)Fig.6 Volatile substances with VIP > 1

2.4 特征揮發(fā)性成分與不同類型黑茶窨制前后香氣屬性的關(guān)聯(lián)

為進(jìn)一步探究特征揮發(fā)性成分與黑茶窨制前后香氣變化的聯(lián)系，對38 種特征揮發(fā)性成分（表2）與各樣品陳香、茉莉花香、木香、松煙香和菌花香的香氣強(qiáng)度進(jìn)行偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析（圖7）。

表2 38 種特征揮發(fā)性成分的香氣描述Table 2 Aroma description of 38 characteristic volatile components

圖7 不同香氣類型與特征揮發(fā)性成分的PLSR分析圖Fig.7 PLSR analysis of different types of aroma components and characteristic volatile components of jasmine dark tea

結(jié)果顯示，順式-氧化芳樟醇、壬醛、甲苯、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、反,反-3,5-辛二烯-2-酮、2-戊基呋喃與“陳香”強(qiáng)度呈顯著或極顯著正相關(guān)；反式-2,4-庚二烯醛、甲基庚烯酮、順-3-己烯醇、苯甲醇、芳樟醇、月桂烯、反式-β-羅勒烯、α-法呢烯、姜烯、α-杜松烯、4-己烯-1-醇乙酸酯、苯甲酸甲酯、乙酸芐酯、丁酸葉醇酯、水楊酸甲酯、二甲基丁酸葉醇酯、順-3-己烯基巴豆酸酯、2-甲基-2-丁烯酸葉醇酯、鄰氨基苯甲酸甲酯、苯甲酸丁酯、順式-3-己烯酸順式-3-己烯酯、鄰甲氨基苯甲酸甲酯、順式-3-己烯基苯甲酸酯、3-己烯基苯甲酸酯、苯甲酸乙酯和吲哚與“茉莉花香”強(qiáng)度呈顯著或極顯著正相關(guān)，但其中烴類化合物和酯類化合物與“陳香”強(qiáng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)，且這26 種揮發(fā)性成分多呈青香、花香和果香；2,2,6-三甲基環(huán)己酮、2-甲氧基-4-甲基苯酚和壬醛與“木香”強(qiáng)度呈顯著或極顯著正相關(guān)；甲苯和2-甲氧基-4-甲基苯酚分別與“松煙香”強(qiáng)度呈極顯著正相關(guān)、顯著正相關(guān)；順式-氧化芳樟醇、反式-芳樟醇氧化物、正己醛、苯甲醛、反式-2,4-庚二烯醛、水楊酸甲酯、甲基庚烯酮、反,反-3,5-辛二烯-2-酮和反式-香葉基丙酮與“菌花香”強(qiáng)度呈顯著或極顯著正相關(guān)。

這38 種特征揮發(fā)性成分相互協(xié)同或拮抗共同影響了黑茶及茉莉黑茶的香氣特征，其中大多數(shù)特征揮發(fā)性成分與茉莉花香和菌花香正相關(guān)，與陳香、木香和松煙香負(fù)相關(guān)。其中，烴類化合物和酯類化合物是影響茶葉“茉莉花香”強(qiáng)度最主要的揮發(fā)性成分，茉莉黑茶中特征揮發(fā)性成分含量的增加主要來源于窨制過程黑茶吸收的茉莉花香。同時，受窨制溫度和濕度的影響，黑茶中原有的一些特征揮發(fā)性成分含量降低，如壬醛、甲苯等，并與其他揮發(fā)性成分相協(xié)調(diào)，構(gòu)成了茉莉黑茶將黑茶原有香氣與茉莉花香相融合的特點。

3 結(jié)論與討論

以3 種類型的黑茶（茯磚、天尖、龍珠）及其窨制后的茉莉黑茶（茉莉茯磚、茉莉天尖、茉莉龍珠）為實驗樣品，采用固相微萃取技術(shù)結(jié)合GC×GC-Q-TOF-MS技術(shù)分析樣品中的揮發(fā)性成分。從6 個樣品中共定量定性出了366 種物質(zhì)，其中烴類化合物的種類最多。在此基礎(chǔ)上，采用PCA和OPLS-DA法對黑茶及茉莉黑茶中定性定量的366 種揮發(fā)性成分進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，乙酸芐酯、芳樟醇、3-己烯基苯甲酸酯、苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、吲哚、鄰氨基苯甲酸甲酯、α-法呢烯、4-己烯-1-醇乙酸酯、順式-3-己烯酸順式-3-己烯酯、苯甲醇、苯甲酸乙酯、丁酸葉醇酯、甲基庚烯酮、α-杜松烯、姜烯、順-3-己烯醇、二甲基丁酸葉醇酯、鄰甲氨基苯甲酸甲酯、壬醛、順-3-己烯基巴豆酸酯、苯甲醛、順反-β-紫羅蘭酮、反式-芳樟醇氧化物、2-戊基呋喃、順式-3-己烯基苯甲酸酯、順式-氧化芳樟醇、甲苯、正己醛、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、反式-香葉基丙酮、月桂烯、2-甲基-2-丁烯酸葉醇酯、苯甲酸丁酯、反式-2,4-庚二烯醛、反式-β-羅勒烯和反,反-3,5-辛二烯-2-酮共38 種物質(zhì)是區(qū)別黑茶窨制前后香氣變化的特征揮發(fā)性成分。其中，芳樟醇、乙酸芐酯、順-3-己烯醇、水楊酸甲酯、苯甲醇、吲哚、α-法呢烯、苯甲酸甲酯等揮發(fā)性成分既是茉莉鮮花呈香的主要成分[21-23]，也是影響茉莉花茶香氣品質(zhì)的關(guān)鍵揮發(fā)性成分[24-30]。

根據(jù)眾多學(xué)者的研究結(jié)果，黑茶“木香”特征與醛類和酮類物質(zhì)相關(guān)[31]，而本研究中黑茶的醛類和酮類物質(zhì)總量在窨制后均有不同程度的減少；“陳香”特征通常與雜氧化合物中的甲氧基苯類化合物相關(guān)[32-33]，黑茶中的甲氧基苯類物質(zhì)含量在窨制前后有所差異，大部分甲氧基苯類物質(zhì)的含量在窨制后降低，如1,2,3-三甲氧基苯、1,2-二甲氧基苯等；有研究表明“煙香”屬性可能與具有烘烤香氣特征的含氮化合物有關(guān)[34]，而黑茶中雜環(huán)類化合物中的含氮化合物在窨制后不僅含量降低甚至未檢測到；茯磚茶特征香氣成分中的1-辛烯-3-醇具有蘑菇香屬性[35]，而1-辛烯-3-醇在茉莉茯磚里的含量遠(yuǎn)低于窨制前的茯磚。這表明窨制改變了黑茶中木香、陳香、松煙香和菌花香的呈香程度，因此窨制后茉莉黑茶中的木香、陳香、松煙香和菌花香均有不同程度的減弱。

本研究進(jìn)一步分析黑茶窨制前后的38 種特征揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)，其中26 種特征揮發(fā)性成分與茉莉黑茶的“茉莉花香”強(qiáng)度顯著或極顯著正相關(guān)，且大多數(shù)特征揮發(fā)性成分為酯類物質(zhì)，說明這些揮發(fā)性成分的增加主要來源于窨制過程中黑茶吸收的茉莉花香。因此窨制后的茉莉黑茶中的茉莉花香明顯增加。

綜上所述，窨制技術(shù)雖然減弱了黑茶的不同香氣屬性甚至改變了其特征香氣成分，但增加了茉莉花的香氣。而這兩者一減一增，相互協(xié)調(diào)形成了茉莉黑茶“花香鮮靈、茶香純正”的香氣品質(zhì)特點。

另外，本研究中茉莉黑茶的窨制工藝和鮮花質(zhì)量相對一致，不同茉莉黑茶的品質(zhì)差異主要來源于黑茶茶坯。已有研究表明，茶坯的類型、含水量、疏松度、干燥方式等均不同程度影響其吸附茉莉花香[30,36]。本研究中選用的天尖黑茶原料較嫩、外形松散，易吸附茉莉花香；茯磚黑茶為磚塊狀，本研究將其分解成小塊，利于吸附茉莉花香；龍珠黑茶則為壓制較緊的圓球形，不易吸附茉莉花香。因此，有必要進(jìn)一步進(jìn)行黑茶原料廣泛選擇、窨制技術(shù)精準(zhǔn)優(yōu)化、茉莉黑茶香氣特征深入分析等系統(tǒng)研究，為茉莉黑茶加工技術(shù)及品質(zhì)提升提供科學(xué)支撐，激發(fā)茉莉黑茶市場潛力。