吳雙慧，牛 茵，何濟(jì)坤，刀筱芳，唐俊妮，陳 娟*

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

羊肉是蛋白質(zhì)含量高、脂肪和膽固醇含量都比較低的一種食物，是比豬肉更優(yōu)良的畜肉[1]。簡州大耳羊的肉品質(zhì)優(yōu)良，含粗蛋白21.08%、粗脂肪1.22%、膽固醇47.62 mg/100 g，富含人體所必需的各種脂肪酸和氨基酸[2]。羊肉發(fā)酵香腸是用羊肉制成的香腸，是香腸中的新品種，因其加工技術(shù)成熟、方便食用和耐貯存等特點備受關(guān)注。國內(nèi)外關(guān)于羊肉香腸的研究并不多，主要集中于加工工藝及其參數(shù)優(yōu)化[3-4]、發(fā)酵劑或工藝對其理化性質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)的影響[5-6]、發(fā)酵劑或香料對產(chǎn)品生物胺的影響[7-8]等方面，而對產(chǎn)品生物胺與發(fā)酵微生物相關(guān)性這方面研究較少。

生物胺是一種分子質(zhì)量低、難揮發(fā)的堿性物質(zhì)，攝入的食物中如果生物胺含量較高可能會中毒，導(dǎo)致頭痛、嘔吐或者腹瀉等不良癥狀出現(xiàn)[9-10]。此外，在亞硝酸鹽存在的環(huán)境下生物胺容易形成致癌性的亞硝基胺[11]。生物胺通常存在于具有高含量蛋白的食品中，如奶酪、臘腸和干香腸[12]。Kamil等[13]測定了市售的10 個不同品牌的120 個香腸樣品中的生物胺，發(fā)現(xiàn)樣本中尸胺含量高達(dá)1 148.75 mg/kg，組胺最高為469.375 mg/kg，酪胺為438.125 mg/kg。Li Lu等[14]在16 個市售香腸中檢測到8 種生物胺，有的樣品生物胺總含量高達(dá)1 417.57 mg/kg。歐盟規(guī)定食品中組胺含量不得超過100 mg/kg，酪胺含量范圍為100～800 mg/kg[15-16]。食用總生物胺含量超過1 000 mg/kg的食品將會對人體健康產(chǎn)生危害[17]。

自然發(fā)酵香腸的發(fā)酵過程屬于開放式多菌種混合發(fā)酵體系，其中具有氨基酸脫羧酶活性的微生物產(chǎn)生氨基酸脫羧酶將游離氨基酸脫羧生成相應(yīng)的生物胺。因此，研究生物胺與微生物的相關(guān)性，有助于了解生物胺的形成機(jī)理。李曉宏[18]研究了發(fā)酵香腸中生物胺與微生物的相關(guān)性，結(jié)果表明組胺與菌落總數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，苯乙胺和大腸桿菌呈顯著性負(fù)相關(guān)，酪胺與菌落總數(shù)、葡萄球菌、乳酸菌都呈負(fù)相關(guān)。張雅琳[19]對川味香腸中細(xì)菌和真菌菌群和組胺的生成進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌屬、腸球菌屬、沙雷氏菌、庫特氏菌屬、賴氨酸桿菌屬等對組胺的生成有關(guān)系。Dabadé等[20]測定了比利時市售食品中的多種生物胺，發(fā)現(xiàn)尸胺含量與乳酸菌、腐胺與總需氧菌數(shù)、苯乙胺與腸球菌呈顯著正相關(guān)。這些研究都是關(guān)于以豬肉為原料的發(fā)酵香腸，對于羊肉發(fā)酵香腸中生物胺的研究目前主要集中在溫度、發(fā)酵劑[21-22]和香辛料[8,23]等因素對其含量的影響，關(guān)于自然發(fā)酵羊肉香腸中微生物與生物胺的關(guān)聯(lián)性分析、生物胺的代謝研究至今鮮見報道。

因此，本研究以不同發(fā)酵階段的羊肉香腸為實驗對象，采用高效液相色譜方法測定樣品中的生物胺含量，采用宏基因組技術(shù)分析樣品中的微生物組成及變化，對生物胺和微生物多樣性進(jìn)行相關(guān)性分析，并結(jié)合非冗余（Non-Redundant，NR）蛋白質(zhì)序列、直系同源蛋白分組比對（evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups，eggNOG）數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對微生物和酶的豐度與功能進(jìn)行注釋，探究生物胺與微生物菌群的相關(guān)性，以及生物胺代謝與微生物和酶的關(guān)系，旨在為探究自然發(fā)酵羊肉香腸中生物胺的代謝機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉（簡州大耳羊） 四川天地羊生物工程有限責(zé)任公司；豬腸衣 成都市當(dāng)?shù)厥袌?；食鹽、白糖為超市購買。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 賽默飛世爾科技公司；乙酸銨（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、三氯乙酸、正丁醇、正己烷、三氯甲烷、乙醚、碳酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純），乙酸（色譜純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；谷氨酸鈉（分析純） 索萊寶生物科技有限公司；丹磺酰氯（分析純）、腐胺、色胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺、1,7-二氨基庚烷等標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；尸胺、2-苯乙胺等標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehenstorfer有限公司；TruSeq Nano DNA LT Sample Prepararion Kit（F C-1 2 1-4 0 0 1） 美國I l l u m i n a 公司；AgencourtAMPure XP（A63881） 美國Beckman Coulter公司；KAPA Library Quantification Kits（KK4824） 美國Kapa Biosystems公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D高速分散器 寧波新芝生物有限公司；1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Kromasil C18液相色譜柱 瑞典Akzo Nobel公司；5409HJ507060冷凍離心機(jī)、Centrifuge 5418R臺式離心機(jī) 德國Eppendorf公司；N-20多功能氮吹儀 山東云網(wǎng)數(shù)據(jù)科技有限公司；有機(jī)尼龍過濾膜（0.22 μm） 日本津騰公司；MyCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Covaris S220超聲打斷儀 基因技術(shù)（Gene）有限公司；LC 480定量PCR儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肉發(fā)酵香腸的制備與取樣

根據(jù)胡冠華等[24]的方法，將去皮后的羊瘦肉絞碎與丁狀脂肪按照4∶1的比例混勻，加入2.5%食鹽、1%白糖、各70 mg/kg的亞硝酸鈉和硝酸鈉、500 mg/kg抗壞血酸，充分混勻后在0～4 ℃腌制24 h。將腌制完成的肉丁灌入清洗干凈的豬腸衣中，垂直晾曬于通風(fēng)處，自然發(fā)酵26 d，在0、5、14 d和26 d取樣測定生物胺含量，同時送樣進(jìn)行宏基因組技術(shù)分析。

在相同條件下分別發(fā)酵3 批羊肉香腸，每批每個時間點各取2 份樣品，每個時間點共6 份樣品，貯藏于-80 ℃，用于測定生物胺；每批每個時間點各取1 份樣品，每個時間點共3 份樣品，由于操作失誤，14 d丟失1 份樣品，貯藏于-80 ℃，用于宏基因組技術(shù)分析。

1.3.2 生物胺的含量測定

西門慶毫無疑問是金瓶梅里當(dāng)之無愧的男一號，對他的研究也是頗為深入。西門慶的形象內(nèi)涵十分豐富，他既耽于女色，又善于經(jīng)營；既天真多情，又精于謀算。其人生哲學(xué)就是賺錢與縱欲。以西門慶為核心，小說也設(shè)置了一系列影身人物。

采用高效液相色譜法測定羊肉香腸樣品中的生物胺含量，參考GB/T 5009.208—2016《食品中生物胺的測定》[25]的方法進(jìn)行樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的衍生以及測定。

1.3.3 宏基因組技術(shù)分析

樣品送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行宏基因組技術(shù)分析。在Illumina平臺得到原始數(shù)據(jù)后，首先用Trimmomatic[26]軟件對其進(jìn)行拆分、質(zhì)量剪切、去除宿主污染等操作。得到的序列使用拼接軟件對優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行拼接組裝，并進(jìn)行基因預(yù)測。對預(yù)測出的基因進(jìn)行物種以及功能上的注釋分類，包括NR、eggNOG和KEGG等。同時得到各樣本中物種的相對豐度，接著進(jìn)行樣本相似性聚類、排序檢驗以及差異統(tǒng)計比較等分析，使用R軟件完成統(tǒng)計分析和作圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019、Origin 2022 64bit和IBM SPSS Statistics 22軟件對生物胺測定結(jié)果進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用±s表示。使用上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供的在線微生物分析平臺（https://cloud.oebiotech.cn/task/）進(jìn)行微生物與生物胺的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肉香腸的生物胺測定結(jié)果

利用高效液相色譜分別確定了色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的保留時間。以這8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品制作不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以峰面積比作為因變量，不同質(zhì)量濃度（mg/L）作為自變量，繪制并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程，分別為y=0.034 9x＋0.004 3（R2=0.999 7）、y=0.693 2x-0.001 2（R2=0.999 9）、y=1.352 1x＋0.017 3（R2=0.999 8）、y=1.786 3x＋0.009 8（R2=0.999 9）、y=1.830 6x-0.002 0（R2=0.999 6）、y=1.520 2x＋0.009 0（R2=0.999 9）、y=1.755 7x-0.115 2（R2=0.999 2）和y=1.278 5x-0.088 4（R2=0.999 1）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算出不同發(fā)酵階段羊肉香腸樣品中各種生物胺含量，結(jié)果如表1所示。

表1 不同發(fā)酵階段羊肉香腸的生物胺含量變化Table 1 Changes in contents of biogenic amines in fermented mutton sausage during different fermentation stages mg/kg

表1顯示，色胺、苯乙胺和腐胺在羊肉香腸發(fā)酵過程中差異不顯著（P＞0.05）。尸胺和組胺含量變化沒有明顯的規(guī)律，而酪胺、亞精胺和精胺均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，只是酪胺的最大值出現(xiàn)在第5天，而亞精胺和精胺最大值則是在第14天。其中，組胺最終含量為1.26 mg/kg，酪胺最終為5.07 mg/kg，總生物胺為80.42 mg/kg，自制羊肉香腸的生物胺符合報道要求組胺、酪胺和總生物胺含量的規(guī)定，香腸的安全性符合要求[15-17]。在8 種生物胺中，精胺含量最高，為羊肉香腸發(fā)酵過程中的主要生物胺，14 d達(dá)到最高值97.70 mg/kg，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；0 d與26 d的精胺含量與14 d呈顯著差異；亞精胺和精胺一般與原料肉的品質(zhì)、部位以及生理狀況有關(guān)，是生物體內(nèi)的生理多胺，雖然研究表明這兩種胺對人體健康沒有直接的不良影響，但可能與亞硝酸鹽反應(yīng)形成致癌的亞硝胺，因此，也需要控制其含量。

2.2 羊肉香腸中微生物的群落結(jié)構(gòu)

提取羊肉香腸樣品基因組，經(jīng)宏基因組測序和去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，得到62 106 208 bp，包含67 377 條序列。對羊肉香腸樣品進(jìn)行物種注釋，共鑒定出43 個門、60 個綱、112 個目、201 個科、465 個屬和2 156 個種的微生物。

在細(xì)菌的屬水平，豐度排名前30的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖1 所示，較直觀地展示了不同發(fā)酵階段羊肉香腸中細(xì)菌群落構(gòu)成的異同。第0 天，嗜血桿菌屬（Haemophilus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、酒球菌屬（Oenococcus）、李斯特菌屬（Listeria）和弓形菌屬（Arcobacter）相對豐度較高，分別為20.39%、18.82%、10.02%、5.24%和5.20%；第5天時，樣品中相對豐度較高的細(xì)菌屬為弧菌屬（Vibrio）、葡萄球菌屬、嗜血桿菌屬、酒球菌屬和明串珠菌屬（Leuconostoc），其相對豐度分別為21.16%、17.79%、13.86%、6.50%和3.83%；到第14天時，葡萄球菌屬相對豐度達(dá)到4 組樣品的最高值，為43.95%，其次分別是嗜血桿菌屬，相對豐度為11.73%，為4 個時間點的最低值，弧菌屬的相對豐度為7.64%，酒球菌屬和李斯特菌屬的相對豐度也變?yōu)榱? 個時期的最低值，分別為6.03%和3.15%；直到第26天，與第14天相比，相對豐度較大的細(xì)菌屬類別不變，但相對豐度發(fā)生了改變，葡萄球菌屬為25.39%、嗜血桿菌屬為18.63%、酒球菌屬為8.89%、弧菌屬為4.79%、李斯特菌屬為4.70%。說明發(fā)酵羊肉香腸中的細(xì)菌構(gòu)成較為復(fù)雜，不同發(fā)酵階段的樣品中的優(yōu)勢菌屬不同，這可能是由于自然發(fā)酵這一生產(chǎn)方式導(dǎo)致?？傮w來講，在自然發(fā)酵羊肉香腸樣品中葡萄球菌屬的占比較大，這是一類常見于發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢菌，葡萄球菌可以快速還原硝酸鹽，使降解產(chǎn)物與肌紅蛋白結(jié)合形成亞硝基紅蛋白，賦予肉制品紅潤的色澤，同時還能夠防止脂肪氧化[27]。樣品中具有相對豐度較高的嗜血桿菌屬，這可能與原材料有關(guān)，羊肉或者豬腸衣自身攜帶有嗜血桿菌屬，導(dǎo)致樣品中這種微生物相對豐度較高，可能會引發(fā)食源性疾病，因此在選擇原材料時應(yīng)注意原料的品質(zhì)，保證食品安全。

圖1 不同發(fā)酵階段羊肉香腸中細(xì)菌屬水平的相對豐度Fig.1 Relative abundance of bacteria in mutton sausage during different fermentation stages

真菌在羊肉香腸樣品中占比較小，相對豐度排名前3 0 的真菌屬中，最大的是德巴利酵母菌屬（Debaryomyces），其相對豐度僅為0.206%，在第14天時出現(xiàn)，其余的真菌屬相比較細(xì)菌屬而言，對生物胺的作用可以忽略不計。

2.3 羊肉香腸中細(xì)菌屬水平結(jié)構(gòu)與生物胺的相關(guān)性分析

圖2 細(xì)菌屬水平結(jié)構(gòu)與生物胺的相關(guān)性分析Fig.2 Analysis of the correlation between bacterial community and biogenic amines

2.4 數(shù)據(jù)庫注釋分析

2.4.1 eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋分析

將11 份樣品測序得到的數(shù)據(jù)與eggNOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得了每個基因?qū)?yīng)的直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）注釋情況（圖3），共鑒定出36 935 個COG功能單元，這些功能單元分屬于23 個主要的功能大類。其中，基因數(shù)排名前3的主要是未知功能類9 190 個基因，氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝3 242 個基因，復(fù)制、重組和修復(fù)2 936 個基因。

圖3 羊肉香腸基因的eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋統(tǒng)計圖Fig.3 Statistics of gene annotation in eggNOG database

2.4.2 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析

將NR基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋，結(jié)果如圖4所示。11 份樣品中共有39 319 個NR基因注釋到KEGG的34 條代謝通路中，在第1水平的通路中，注釋到新陳代謝通路的數(shù)量最多，共有26 273 條；其次是環(huán)境信息處理，共6 041 條；遺傳信息處理，共3 795 條；細(xì)胞過程，共2 335 條；生命系統(tǒng)最少，僅有875 條。在新陳代謝通路的第2水平中，除4 203 條NR基因被注釋到全局和總覽圖外，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔酶因子和維生素的代謝是被注釋最多的途徑。KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果揭示了羊肉香腸中微生物主要通過調(diào)控碳水化合物代謝和氨基酸代謝過程影響香腸的品質(zhì)，其中，與生物胺產(chǎn)生相關(guān)的代謝為氨基酸代謝。

圖4 羊肉香腸基因的KEGG代謝通路統(tǒng)計Fig.4 Statistics of gene annotation in KEGG metabolic pathways

2.4.2.1 不同發(fā)酵階段羊肉香腸的KEGG代謝分析

將不同發(fā)酵階段香腸樣品的KEGG數(shù)據(jù)庫中第1水平的豐富度進(jìn)行繪圖后發(fā)現(xiàn)（圖5），在羊肉香腸中，共有5 大類代謝通路，不同時間的微生物基因在同一類中注釋結(jié)果存在差異，但無論在哪大類代謝通路中，第14天所比對的基因在同一類別中比例都最高，而第0天所注釋的結(jié)果比例都最低，說明第14天的5大功能最旺盛。其中，新陳代謝功能尤其突出，表明14 d是自然發(fā)酵羊肉香腸中微生物代謝活動最為旺盛的時間。

圖5 不同發(fā)酵階段羊肉香腸的KEGG第1水平豐富度Fig.5 First level abundance of KEGG for fermented mutton sausage during different fermentation stages

2.4.2.2 不同發(fā)酵階段羊肉香腸的新陳代謝類型分析

由圖6可知，在新陳代謝通路的第2水平中，每個階段注釋到的第2水平所含有豐度各不相同。第0天各種代謝的豐度均低于第14天，在第0天各種代謝中能量代謝最為旺盛；在第5、14、26天時，除去NR基因被注釋到的全局和總覽圖外，碳水化合物代謝最旺盛，其次是氨基酸代謝和能量代謝。11 份樣品中共有13 條代謝通路中出現(xiàn)生物胺，從KEGG數(shù)據(jù)庫的第2水平來講屬于其中的5 類，分別為氨基酸代謝6 條，其他氨基酸代謝的代謝有2 條，能量代謝1 條，輔酶因子和維生素的代謝1 條，其他次生代謝物的生物合成有3 條。

圖6 不同發(fā)酵階段羊肉香腸的新陳代謝類型豐富度Fig.6 Abundance of metabolism types in mutton sausage during different fermentation stages

2.5 與生物胺代謝相關(guān)的通路分析

圖7為羊肉香腸樣品分別結(jié)合KEGG Pathway中ko00380、ko00360、ko00350和ko00950注釋的色胺、苯乙胺和酪胺代謝通路圖。色胺、苯乙胺和酪胺都在單胺氧化酶（EC: 1.4.3.4）的作用下被降解，通過在KEGG數(shù)據(jù)庫中對酶的來源進(jìn)行追蹤發(fā)現(xiàn)，單胺氧化酶主要由3 種菌產(chǎn)生，分別為嗜冷桿菌屬（Psychrobactersp.）YP14、假單胞菌屬OV144和嗜冷桿菌屬YGAH215。樣品去宿主基因后，與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，沒有注釋到合成這3 種胺的微生物，推測樣品中色胺、苯乙胺和酪胺的形成可能是由于原料肉中內(nèi)源酶的催化作用。

圖7 羊肉香腸的色胺、苯乙胺和酪胺代謝路徑Fig.7 Metabolic pathways of tryptamine, phenylethylamine and tyramine in fermented mutton sausage

圖8 為羊肉香腸樣品結(jié)合K E G G P a t h w a y 中ko00310、ko00480注釋的尸胺代謝通路圖。尸胺只由微生物通過賴氨酸脫羧酶（EC: 4.1.1.18）作用于賴氨酸脫羧形成，樣品中具有這種能力的微生物只有1 種菌，為Photobacterium piscicola。尸胺降解的途徑只有1 條，涉及到的微生物有2 種（假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonassp.）JB197、半透明假交替單胞菌（Pseudoalteromonas translucida）），都是通過亞精胺合酶（EC: 2.5.1.16）降解尸胺。

圖8 羊肉香腸的尸胺代謝路徑Fig.8 Metabolic pathway of cadaverine in fermented mutton sausage

圖9為結(jié)合KEGG Pathway中ko00330、ko00480注釋的腐胺代謝通路圖。合成腐胺的路徑有2 條，一條為胍基丁胺在胍基丁酶（EC: 3.5.3.11）的作用下合成腐胺，產(chǎn)生這種酶的微生物有3 種，分別為木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、Vibrio rumoiensis、馬葡萄球菌（Staphylococcus equorum）；另一條合成途徑是鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶（EC: 4.1.1.17）作用下脫羧形成腐胺，涉及的微生物有熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）、嗜冷桿菌屬YGAH215和嗜冷桿菌屬1501（2011）。腐胺的降解途徑有氧化、轉(zhuǎn)移等方式，其中產(chǎn)生carboxynorspermidine synthase（EC: 1.5.1.43）的微生物有Vibriosp.、V.rumoiensis、噬海藻弧菌（V.algivorus），產(chǎn)生亞精胺合酶（EC: 2.5.1.16）的微生物有假交替單胞菌屬JB197和半透明假交替單胞菌，產(chǎn)生二胺N-乙?；D(zhuǎn)移酶（EC: 2.3.1.57）的微生物有Vibriosp.、Leuconostoc suionicum、V.aphrogenes、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、葡萄球菌屬OJ82和木糖葡萄球菌。

圖9 羊肉香腸的腐胺代謝路徑Fig.9 Metabolic pathway of putrescine in fermented mutton sausage

圖10為結(jié)合KEGG Pathway中ko00330、ko00410和ko00480注釋的亞精胺和精胺代謝通路圖。可以看出，亞精胺的合成有3 條途徑，第1條是腐胺在亞精胺合酶（EC: 2.5.1.16）的作用下生成亞精胺，涉及到的微生物有假交替單胞菌屬JB197和半透明假交替單胞菌；另外一條途徑是羧基亞精胺在羧基精胺脫羧酶（EC: 4.1.1.96）作用下生成亞精胺，產(chǎn)生這種酶的微生物是Vibriosp.和V.aphrogenes；第3條途徑則是谷胱甘肽亞精胺在谷胱甘肽亞精胺酰胺酶（EC: 3.5.1.78）的作用下合成亞精胺，樣品中產(chǎn)生這種酶的微生物只有發(fā)光桿菌屬（Photobacteriumsp.）NCIMB 13483。對于亞精胺的降解有2 條途徑，一條途徑是亞精胺在谷胱甘肽亞精胺合酶（EC: 6.3.1.8）作用下轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽亞精胺，產(chǎn)生這種酶的微生物只有發(fā)光桿菌屬NCIMB 13483；另一條途徑則是在精胺合酶（EC: 2.5.1.22）作用下降解為精胺，樣品中產(chǎn)生這種酶的微生物只有硝化螺旋細(xì)菌（Nitrospirae bacterium）。

組胺可以通過組氨酸脫羧形成，同時可以通過基團(tuán)轉(zhuǎn)移、酶氧化、化學(xué)合成等途徑被降解[28]，樣品去宿主基因后，與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，沒有注釋到代謝組胺的微生物，推測樣品中組胺的代謝可能是由于原料肉中內(nèi)源酶的作用，導(dǎo)致樣品中檢測出低含量的組胺。

3 討 論

李苗云等[29]的研究表明，與發(fā)酵香腸中生物胺形成相關(guān)的細(xì)菌主要有腸桿菌、微球菌、芽孢桿菌、假單胞菌以及發(fā)光桿菌等的一些種類，與本研究結(jié)果相符。許多微生物屬的物種都能同時代謝一種或多種生物胺[30]。本研究發(fā)現(xiàn)Vibriosp.和V.aphrogenes兩種弧菌既能合成腐胺又能降解腐胺，同時還可以降解亞精胺；嗜冷桿菌屬YGAH215不僅降解色胺、苯乙胺和酪胺，還能合成腐胺；假交替單胞菌屬JB197不僅能降解尸胺和腐胺，同時能合成亞精胺；木糖葡萄球菌不僅能產(chǎn)生合成腐胺的酶，還可以產(chǎn)生降解腐胺的酶。唐小曼等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，有6 種微生物，如阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）、unclassified_g_Enterobacter、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、催產(chǎn)克雷伯氏菌（Klebsiella oxytocin）、漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）與油桃千酵母菌（Millerozyma arinosa）同時與腐胺、尸胺的代謝相關(guān)。張鵬飛[32]的研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬（Enterobactersp.）638同時與尸胺、腐胺、亞精胺與精胺的代謝相關(guān)，熒光假單胞菌與酪胺和組胺的合成相關(guān)。

大部分研究人員認(rèn)為，生物胺產(chǎn)生能力不能歸屬到分類種，只能歸屬到菌株[33]。張鵬飛[32]、Anderegg[34]、Hu Min[35]等的研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌與酪胺和組胺的合成有關(guān)，木糖葡萄球菌是酪胺的主要產(chǎn)生菌，腸球菌屬、乳桿菌屬（Lactobacillus）和乳球菌屬（Lactococcus）是組胺的主要產(chǎn)生菌。但本研究卻發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌不參與酪胺和組胺的代謝，只與腐胺的合成有關(guān)；木糖葡萄球菌不參與組胺和酪胺的代謝，只與腐胺的代謝有關(guān)；腸球菌屬、乳桿菌屬和乳球菌屬不代謝組胺。已有報道和本研究結(jié)果不一致，可能是由于生物胺的形成應(yīng)該歸屬于細(xì)菌菌株而不是微生物的分類種或者屬。

4 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)羊肉香腸中微生物多樣性豐富，葡萄球菌屬、弧菌屬、酒球菌屬和嗜血桿菌屬是主要優(yōu)勢細(xì)菌屬；檢測出8 種生物胺，其中精胺含量最高。相關(guān)性分析表明尸胺與明串珠菌屬和假交替單胞菌屬等5 種細(xì)菌屬呈極顯著正相關(guān)；精胺與酒球菌屬和芽孢桿菌屬等15 種細(xì)菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)；亞精胺與酒球菌屬和弓形菌屬等4 種菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)；酪胺與酒球菌屬和泛菌屬等5 種菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)，而與假交替單胞菌屬和發(fā)光桿菌屬呈顯著正相關(guān)；色胺與葡萄球菌屬和鏈球菌屬呈顯著正相關(guān)；不存在與組胺、腐胺和苯乙胺顯著相關(guān)的細(xì)菌屬。經(jīng)過eggNOG、KEGG數(shù)據(jù)庫比對，分別注釋到36 935、39 319 個基因，主要為碳水化合物代謝和氨基酸代謝。經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋后，發(fā)現(xiàn)有代謝尸胺、腐胺、精胺和亞精胺的細(xì)菌和酶，有降解色胺、苯乙胺和酪胺的細(xì)菌和酶，沒有代謝組胺的細(xì)菌和酶，色胺、苯乙胺、酪胺和組胺的合成可能由于內(nèi)源酶的作用。本研究揭示了羊肉香腸中微生物多樣性、生物胺代謝及其與關(guān)聯(lián)微生物、酶的關(guān)系，確定了自然發(fā)酵羊肉香腸中生物胺代謝的路徑，對解析羊肉香腸中微生物的動態(tài)變化以及生物胺的監(jiān)測具有重要意義和應(yīng)用價值。