任引剛 張瑩 白莉敏 高硯麗 祝松濤

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,陜西 西安 710038)

哮喘的特點(diǎn)是呼吸道癥狀和氣流受限,其發(fā)病機(jī)制通常與氣道炎癥和氣道重塑相關(guān)[1-2]。雖然短效β2-受體激動(dòng)劑、皮質(zhì)類固醇等藥物可以較好地控制哮喘,但是仍有許多的哮喘患者對(duì)常用藥物無反應(yīng),氣道功能無法改善。此外,長期使用這些藥物會(huì)導(dǎo)致如口咽部疼痛、口瘡、牙齒問題、體重異?；蚓駟栴}等各種副作用[3]。脂質(zhì)代謝在哮喘的各種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用,脂質(zhì)代謝紊亂可引起多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生并促進(jìn)哮喘的發(fā)生[4]。因此,控制哮喘中脂質(zhì)代謝的異?？赡苁侵委熛闹匾较蛑籟4]。α-亞麻酸(Alpha-linolenic acid, ALA)是一種ω-3多不飽和脂肪酸,也是一種人體不能合成的必需脂肪酸。α-亞麻酸具有降壓、降血脂、抗炎、改善脂質(zhì)代謝等功能[5]。有研究[6]報(bào)道,α-亞麻酸具有抑制炎癥和氧化應(yīng)激的作用,是治療支氣管哮喘等氣道炎癥性疾病的潛在候選藥物,但具體的作用機(jī)制尚不明確。

成纖維細(xì)胞生長因子23(Fibroblast growth factors 23,FGF23)是一種重要的骨源性調(diào)磷激素,其主要受體為成纖維細(xì)胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptors,FGFR)/Klotho復(fù)合物[7]。FGF23具有調(diào)控機(jī)體膽汁酸平衡、維持全身穩(wěn)態(tài)等作用。另外,FGF23在糖脂代謝中具有重要作用,代謝綜合征患者血清FGF23水平更高,且與甘油三酯呈正相關(guān),與高密度脂蛋白、膽固醇和載脂蛋白A呈負(fù)相關(guān)[8]。本研究假設(shè)α-亞麻酸可能通過改善脂代謝引起的炎癥和氧化應(yīng)激來抑制哮喘。FGF23是一種與調(diào)節(jié)炎癥和脂代謝的生長因子[8-9],Klotho(FGF23的共同受體)基因敲除的慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)模型小鼠氣道炎癥加劇,FGFR4表達(dá)增加[9]。本研究探討α-亞麻酸對(duì)哮喘動(dòng)物模型的治療作用和FGF23表達(dá)的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)購自美國Sigma Aldrich公司;地塞米松磷酸鈉注射液購自鄭州卓峰制藥有限公司;干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-17和IL-10 ELISA試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司;HE染色和Masson三色染色試劑、RIPA購自北京索萊寶科技有限公司;免疫組化及Western blot中所用的一抗及二抗均購自英國Abcam公司;BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒、TRIzol試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所;MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司;SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只體質(zhì)量為180～220 g的SPF級(jí)6周齡雄性SD大鼠由空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室提供[許可證號(hào):SYXK(陜)2020-007]。大鼠飼養(yǎng)條件為25 ℃、55%相對(duì)濕度、12 h光暗循環(huán)照明,不限制食物和水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.3 動(dòng)物分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為5組(n=10):對(duì)照組、OVA組、OVA+40 mg/kg ALA組、OVA+80 mg/kg ALA組和OVA+Dex組。參考文獻(xiàn)[10]方法建立哮喘大鼠模型。含有100 mg OVA和100 mg氫氧化鋁的1 mL 0.9%生理鹽水作為致敏液。OVA組、OVA+40 mg/kg ALA組、OVA+80 mg/kg ALA組和OVA+Dex組大鼠分別于第0、7、14 d腹腔注射1 mL致敏液。使用0.9%生理鹽水配置1% OVA溶液。從第21 d開始,用50 μL的1% OVA溶液滴鼻激發(fā),連續(xù)7 d。使用0.01%酒精溶解α-亞麻酸和地塞米松。從第21 d開始,在激發(fā)前2 h對(duì)OVA+40 mg/kg ALA組和OVA+80 mg/kg ALA組大鼠分別灌胃40和80 mg/kg的α-亞麻酸,對(duì)OVA+Dex組大鼠灌胃0.25 mg/kg的地塞米松。對(duì)照組大鼠使用0.9%生理鹽水致敏和激發(fā),用0.01%酒精灌胃,OVA組大鼠采用0.01%酒精灌胃。

1.4 組織學(xué)染色 最后一次激發(fā)24 h后,處死大鼠分離獲取大鼠左肺,并用10%多聚甲醛固定大鼠左肺,制作肺組織石蠟切片,然后進(jìn)行HE染色。

1.5 BALF收集和計(jì)數(shù)細(xì)胞 最后一次激發(fā)24 h后,大鼠左側(cè)主支氣管插管,采用3 mL PBS溶液沖洗肺并收集BALF,重復(fù)3次。將BALF在4 ℃下1000 r/min離心10 min,然后重懸于1 mL生理鹽水中。對(duì)BALF中的白細(xì)胞進(jìn)行Wright-Giemsa染色并計(jì)數(shù)。

1.6 BALF中炎癥因子的檢測(cè) 按照ELISA試劑盒說明書方法檢測(cè)BALF中IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平。

1.7 免疫組化檢測(cè)肺組織E-cadherin和α-SMA 將大鼠肺組織用4%的多聚甲醛固定48 h,脫水包埋,制成厚度為4 μm的組織切片。肺組織常規(guī)抗原修復(fù)后,用山羊血清室溫封閉30 min。將切片與E-cadherin和α-SMA一抗4 ℃過夜孵育,然后與生物素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育30 min。一抗和二抗稀釋度均為1∶500。最后使用DAB顯色,蘇木素復(fù)染。參考文獻(xiàn)[11]方法對(duì)E-cadherin和α-SMA進(jìn)行陽性染色評(píng)分。

1.8 脂代謝指標(biāo)的檢測(cè) 采用貝克曼庫爾特AU680自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清TC、TG、LDL和HDL。

1.9 Western blot檢測(cè)大鼠肺組織中FGF23、FGFR4、Klotho、E-cadherin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平 將各組大鼠肺組織分離,剪碎,加入含有PMSF(1 mM)的RIPA裂解緩沖液中裂解并勻漿。使用BCA法測(cè)定蛋白含量,使用SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜。5%脫脂牛奶封閉2 h后,將膜與FGF23(1∶1000稀釋)、FGFR4(1∶1000稀釋)、Klotho(1∶1000稀釋)、E-cadherin(1∶3000稀釋)、α-SMA(1∶3000稀釋)和β-actin(1∶5000稀釋,內(nèi)參蛋白)的一抗4 ℃過夜孵育。然后與HRP偶聯(lián)的IgG二抗(1∶2000稀釋)室溫孵育2 h。使用ECL顯影。

1.10 qRT-PCR檢測(cè)大鼠肺組織中FGF23、FGFR4和Klotho的mRNA表達(dá)水平 使用TRIzol試劑從大鼠肺組織中提取總RNA。使用分光光度計(jì)檢測(cè)260 nm和280 nm處的光密度比,并使用隨機(jī)引物和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)和SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒對(duì)FGF23、FGFR4和Klotho引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。β-actin作為內(nèi)參,通過2-ΔΔCT確定目標(biāo)mRNA水平。引物序列如下:FGF23正向:5’-GGCCTGATCCACCTGTACACA-3’和反向:5’-ACCACAAAGCCAGCATCCTCT-3’;FGFR4正向:5’- GTGCTGCCAGAGGAAGACCT-3’和反向:5’-CAGGAGCACAAGCAGAACCA-3’;Klotho正向:5’- TGTGACAGCCAATGGAATCG-3’和反向:5’- GGTTGATGTCGTCCAACACG-3’;β-actin正向:5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3’和反向:5’-CTGGGTCATCTTTTCACGGT-3’。

2 結(jié)果

2.1 α-亞麻酸對(duì)哮喘大鼠肺組織形態(tài)的影響 各組大鼠肺組織切片HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠肺組織形態(tài)正常,支氣管上皮完好,未見明顯炎癥反應(yīng)。與對(duì)照組比較,OVA組大鼠氣道壁和氣道平滑肌明顯增厚,上皮丟失,支氣管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(以白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主)。OVA+40 mg/kg ALA組、OVA+80 mg/kg ALA組和OVA+Dex組上述病理改變均明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織切片HE染色(200×)

2.2 α-亞麻酸對(duì)哮喘大鼠BALF中炎癥因子的影響 與對(duì)照組比較,OVA組大鼠BALF中IFN-γ的水平顯著降低,IL-4、IL-17和IL-10的水平均顯著升高(P<0.05)。與OVA組相比,OVA+40 mg/kg ALA組、OVA+80 mg/kg ALA組和OVA+Dex組大鼠BALF中IFN-γ和IL-10的水平均顯著升高,IL-4和IL-17的水平均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平

2.3 α-亞麻酸對(duì)哮喘大鼠肺組織E-cadherin和α-SMA表達(dá)的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示各組大鼠肺組織E-cadherin和α-SMA的染色評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(E-cadherin:F=23.971,P<0.001;α-SMA:F=32.360,P<0.001)。與對(duì)照組比較,OVA組大鼠肺組織E-cadherin染色評(píng)分顯著降低,α-SMA染色評(píng)分顯著升高(P<0.05)。與OVA組相比,OVA+40 mg/kg ALA組、OVA+80 mg/kg ALA組和OVA+Dex組大鼠肺組織E-cadherin染色評(píng)分顯著升高,α-SMA染色評(píng)分顯著降低(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示各組大鼠肺組織中E-cadherin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=261.042,P<0.001;F=235.229,P<0.001)。與對(duì)照組比較,OVA組大鼠肺組織E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著降低,而α-SMA顯著升高(P<0.05)。與OVA組相比,OVA+40 mg/kg ALA組、OVA+80 mg/kg ALA組和OVA+Dex組大鼠肺組織E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著升高,而α-SMA顯著降低(P<0.05)。見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠肺組織中E-cadherin和α-SMA的免疫組化染色

圖3 各組大鼠肺組織中E-cadherin和α-SMA的蛋白表達(dá)

2.4 α-亞麻酸對(duì)哮喘大鼠血清脂代謝指標(biāo)的影響 與對(duì)照組比較,OVA組大鼠血清TC、TG和LDL水平顯著升高,HDL顯著降低(均P<0.05)。與OVA組相比,OVA+40 mg/kg ALA組、OVA+80 mg/kg ALA組和OVA+Dex組大鼠血清TC、TG和LDL水平顯著降低,HDL顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TC、TG、LDL和HDL水平

2.5 α-亞麻酸對(duì)哮喘大鼠肺組織中FGF23-Klotho-FGFR4信號(hào)的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示各組大鼠肺組織中FGF23、Klotho、FGFR4的mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1396.740,P<0.001;F=759.126,P<0.001;F=1649.811,P<0.001)。與對(duì)照組比較,OVA組大鼠肺組織中FGF23和FGFR4的mRNA表達(dá)水平顯著升高,Klotho的mRNA表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。與OVA組相比,OVA+40 mg/kg ALA組、OVA+80 mg/kg ALA組和OVA+Dex組大鼠肺組織中FGF23和FGFR4的mRNA表達(dá)水平均顯著降低,Klotho的mRNA表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示各組大鼠肺組織中FGF23、Klotho、FGFR4的蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=803.488,P<0.001;F=825.512,P<0.001;F=496.199,P<0.001)。與對(duì)照組比較,OVA組大鼠肺組織中FGF23和FGFR4的蛋白表達(dá)水平顯著升高,Klotho蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。與OVA組相比,OVA+40 mg/kg ALA組、OVA+80 mg/kg ALA組和OVA+Dex組大鼠肺組織中FGF23和FGFR4的蛋白表達(dá)水平均顯著降低,Klotho蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。見圖4、圖5。

圖4 qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠肺組織中FGF23、Klotho和FGFR4的mRNA水平

3 討論

α-亞麻酸具有降壓、降血脂、抗炎、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善血管內(nèi)皮功能異常等功能。炎癥是哮喘的一種主要病理表現(xiàn)。據(jù)報(bào)道[12],ω-3脂肪酸能夠降低炎癥反應(yīng)。Ferrucci等[13]報(bào)道,血液中α-亞麻酸水平較高與促炎標(biāo)志物水平較低相關(guān)。Zhao等[14]表明,攝入α-亞麻酸通過抑制高膽固醇血癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-1β和TNF-α而起到抗炎作用。Boskabady等[6]研究發(fā)現(xiàn)α-亞麻酸改善了OVA誘導(dǎo)的哮喘大鼠炎癥、氧化/抗氧化失衡,并且減輕了哮喘大鼠間質(zhì)纖維化、炎癥和肺氣腫。本研究HE染色結(jié)果顯示,α-亞麻酸明顯減輕了OVA誘導(dǎo)的哮喘大鼠氣道壁和氣道平滑肌增厚、上皮丟失、炎性細(xì)胞浸潤等病理改變,療效與陽性對(duì)照藥物地塞米松相近。進(jìn)一步證實(shí)了α-亞麻酸在哮喘治療中的潛在價(jià)值。

輔助性T(Helper T,Th)細(xì)胞相關(guān)免疫功能紊亂在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Th細(xì)胞分為四種亞型:分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞,分泌IL-4的Th2細(xì)胞,分泌IL-17的Th17細(xì)胞,以及分泌IL-10的Treg細(xì)胞[15]。學(xué)者普遍認(rèn)為Th1/Th2和Treg/Th17的失衡可能是導(dǎo)致哮喘嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素。Th2型細(xì)胞因子阻止Th1細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。此外,Th1細(xì)胞可以抑制肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和EOS的分化和增殖,這些細(xì)胞的活性受Th2細(xì)胞因子的控制[16]。IFN-γ可促進(jìn)Th0向Th1分化,而IL-4可誘導(dǎo)Th2分化并推動(dòng)嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophil,EOS)在哮喘患者肺部的聚集[17]。IL-17和IL-10在功能上相互拮抗,IL-17可招募中性粒細(xì)胞并間接吸引EOS,進(jìn)一步加劇哮喘發(fā)作[18]。據(jù)報(bào)道[19],哮喘患者血清IL-4和IL-17水平升高,而IFN-γ和IL-10降低。Li等[20]表明,哮喘大鼠血漿和BALF中IL-4、IL-17水平升高,IFN-γ水平降低。α-亞麻酸給藥后哮喘大鼠BALF中IFN-γ和IL-10的水平顯著升高,而IL-4和IL-17顯著降低,這些結(jié)果表明α-亞麻酸可能通過改善哮喘大鼠的Th1/Th2和Treg/Th17失衡來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫,從而抑制過度的炎癥。

氣道重塑是哮喘的關(guān)鍵病理特征,在氣道重塑過程中,氣道上皮屏障受損、上皮細(xì)胞黏附減少、上皮標(biāo)志物減少以及間質(zhì)標(biāo)志物增多,氣道上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)[21]。在哮喘患者氣道中上皮細(xì)胞形態(tài)由鶴卵石變?yōu)樗笮?通過轉(zhuǎn)化失去細(xì)胞極性,可進(jìn)一步分化為合成活性的肌成纖維細(xì)胞,發(fā)生EMT,從而促進(jìn)哮喘的氣道重構(gòu)[22]。本研究顯示α-亞麻酸升高了哮喘大鼠肺組織上皮標(biāo)志物E-cadherin的蛋白表達(dá),而抑制了間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA,從而抑制了EMT及氣道重塑。

脂質(zhì)代謝在哮喘的各種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。肥胖導(dǎo)致低度全身炎癥的途徑之一是通過脂肪酸激活巨噬細(xì)胞,從而導(dǎo)致多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,包括IL-1β、IL-6和TNF-α。這些細(xì)胞因子通過體循環(huán)影響肺部并導(dǎo)致哮喘[4]。脂質(zhì)分子調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過程[23],如Th2細(xì)胞的分化,嗜酸性粒細(xì)胞向肺部的遷移,以及B細(xì)胞產(chǎn)生IgE,這反過來可以影響過敏性哮喘。本研究發(fā)現(xiàn),OVA誘導(dǎo)的哮喘大鼠血清脂代謝指標(biāo)發(fā)生異常,經(jīng)α-亞麻酸給藥后,血清TC、TG和LDL水平降低,而HDL升高,均說明α-亞麻酸改善了哮喘大鼠的脂代謝,這可能也是α-亞麻酸抗炎作用的一種途徑。

FGF23是FGFs超家族成員,主要以Klotho(FGF23的共同受體)依賴性的方式調(diào)節(jié)生物學(xué)效應(yīng)[24]。已有研究[25]表明,COPD患者氣道中Klotho的表達(dá)減少。Klotho作為協(xié)同子與FGFR結(jié)合形成FGFR-Klotho復(fù)合物,啟動(dòng)FGF23信號(hào)下游分子,其中包括FGF23的受體FGFR4。在缺少Klotho的情況下,FGF23可以激活FGFR4并誘導(dǎo)隨后的磷脂酶Cγ/活化T細(xì)胞核因子(Nuclear factor of activated T-cells,NFAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這一機(jī)制介導(dǎo)了FGF23的病理生理作用,包括誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大生長和增加肝細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[26]。此外,Klotho基因敲除的小鼠氣道炎癥加劇,肺內(nèi)FGFR4表達(dá)增加,而Klotho基因的過度表達(dá)則可減輕氣道炎癥[9]。Krick等[9]報(bào)道COPD患者血漿FGF23水平明顯升高,FGF23可通過FGFR4介導(dǎo)的PLCγ/NFAT信號(hào)通路顯著增加人支氣管上皮細(xì)胞中IL-1β的釋放。Krick等[9]認(rèn)為抑制FGF23或FGFR4可能是COPD的一種新的抗炎策略。本研究表明,α-亞麻酸降低了哮喘大鼠肺組織中FGF23和FGFR4的表達(dá),而促進(jìn)了Klotho的表達(dá)。這些結(jié)果提示α-亞麻酸可能通過調(diào)節(jié)FGF23-Klotho-FGFR4信號(hào)來減輕哮喘癥狀。然而,還需要在細(xì)胞和分子水平上進(jìn)一步驗(yàn)證上述推論,這也將是本課題組的后續(xù)研究方向之一。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,α-亞麻酸可抑制哮喘大鼠的氣道炎癥和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、改善脂代謝,其機(jī)制可能是通過糾正Th1/Th2和Treg/Th17的失衡及調(diào)節(jié)FGF23-Klotho-FGFR4信號(hào)來實(shí)現(xiàn)的?？傊?α-亞麻酸在治療哮喘方面具有較高的潛力,FGF23-Klotho-FGFR4信號(hào)可能是哮喘治療的新策略。