萇雨環(huán)，呂麗麗，李 曼，王夢(mèng)格，張銘娟，葉國(guó)柳

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 蚌埠 233004）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS）是一種多因素婦科疾病，其特征在于子宮腔外子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)的生長(zhǎng)，影響近10%～15%的育齡婦女，在不孕癥患者中，發(fā)病率約為40%～50%［1］。它是一種雌激素依賴性疾病，與慢性炎癥過(guò)程、慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)和不孕密切相關(guān)，極大地降低了育齡女性的生活質(zhì)量［2］。子宮內(nèi)膜異位癥與惡性腫瘤有很多相似之處，特別是它們的侵入性以及有著觸發(fā)其他組織重塑，血管形成和神經(jīng)支配的能力［3］。炎癥是子宮內(nèi)膜異位癥的重要病理生理機(jī)制［4］，有研究報(bào)道炎癥反應(yīng)可通過(guò)促進(jìn)炎性因子的釋放從而增加異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附與增殖特性［5］。因此深入探究該疾病炎癥方面的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）是一種伴隨炎癥反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡［6］，是近年來(lái)炎癥研究方面的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 信號(hào)通路在細(xì)胞焦亡發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且細(xì)胞焦亡在不同的炎癥性疾病中扮演著不同的角色［7，8］?；谏鲜鲅芯勘尘?，本實(shí)驗(yàn)將探討細(xì)胞焦亡相關(guān)因子GSDMD，Caspase-1，NLRP3，IL-1β，IL-18 及PI3K/AKT 信號(hào)通路在炎癥性疾病子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及其相關(guān)性，從而進(jìn)一步探究子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制，并為臨床治療提供具體靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集

選取2022 年1 月～2023 年1 月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科行子宮內(nèi)膜異位癥卵巢囊腫剝除術(shù)患者的異位囊腫組織50 例為子宮內(nèi)膜異位癥組。另選取同期在該院行宮腔鏡手術(shù)患者的正常內(nèi)膜組織55 例作為對(duì)照組，且術(shù)中排除子宮內(nèi)膜異位癥患者。病例組年齡20～41 歲，平均年齡（37.6 ±5.7）歲，對(duì)照組年齡21～43 歲，平均年齡（38.3 ±7.8）歲。兩組研究對(duì)象年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）3 個(gè)月內(nèi)未給予性激素藥物治療；（2）術(shù)中取得標(biāo)本組織均經(jīng)病理學(xué)檢查確診；（3）標(biāo)本的收集均經(jīng)患者及家屬同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）心、肝、腎等嚴(yán)重功能障礙者及患有其他嚴(yán)重婦科疾病者；（2）患惡性腫瘤，精神疾病者；（3）患免疫及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者。術(shù)中所取所有組織標(biāo)本均儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱以備研究使用。本研究符合人體實(shí)驗(yàn)倫理標(biāo)準(zhǔn)并已通過(guò)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)審批。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 提取及實(shí)時(shí)定量PCR 用TRIzol（天根，中國(guó)）試劑提取卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組織及對(duì)照組正常內(nèi)膜組織的總RNA，經(jīng)無(wú)核酸酶水洗之后，用Nanodrop ND-1000 分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒（近岸，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)合成cDNA 模板，并進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱1 min，95 ℃變性20 s 和60 ℃延伸1 min。所有樣品設(shè)置3 個(gè)副孔，使用2-△△CT法計(jì)算焦亡相 關(guān)因子，PI3K/AKT 信號(hào)通路在兩組研究對(duì)象中mRNA 表達(dá)的相對(duì)水平。焦亡相關(guān)因子及PI3K/AKT 通路的引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 引物系列Tab 1 Primer series for qRT-PCR

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法 配制RIPA 裂解緩沖液（碧云天），將50 mg 卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫組織或正常子宮內(nèi)膜組織裝進(jìn)500 μL RIPA 裂解液的勻漿管中，進(jìn)行勻漿處理，4 ℃，12 000 ×g，離心20 min。將等量的變性蛋白通過(guò)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h。隨即將PVDF 膜與一抗（多克隆抗-GSDMD；Caspase-1；NLRP3，1∶1 000 稀釋）在4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。用TBST 洗滌3 遍，再將膜與二抗（1∶1 000 稀釋）放至室溫2 h。再次洗滌三遍，根據(jù)BeyoECL 試劑盒（碧云天）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行曝光顯影，最后結(jié)果用image J 軟件量化處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Graphpad Prism 9 軟件繪圖。用非配對(duì)t檢驗(yàn)分析了細(xì)胞焦亡相關(guān)因子與PI3K/AKT 信號(hào)通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)差異，并用Pearson 檢驗(yàn)方法分析兩者在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中相關(guān)性，P＜0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 焦亡相關(guān)因子及PI3K/AKT 信號(hào)通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中mRNA 水平顯著升高

采用RT-qPCR 方法比較焦亡因子GSDMD、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 及信號(hào)通路PI3K/AKT 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常內(nèi)膜中的表達(dá)。結(jié)果顯示，焦亡相關(guān)因子與信號(hào)通路PI3K/AKT 的表達(dá)在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、2。

圖1 焦亡相關(guān)因子在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常內(nèi)膜中的mRNA 表達(dá)Fig 1 mRNA expression of pyroptosis-related factors in ectopic cysts of ovarian endometriosis versus normal endometrium

圖2 信號(hào)通路PI3K/AKT 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中與正常內(nèi)膜中的mRNA 表達(dá)Fig 2 mRNA expression of the signaling pathway PI3K/AKT in ovarian endometriosis versus normal endometrium

2.2 焦亡相關(guān)因子及PI3K/AKT 信號(hào)通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中蛋白水平明顯升高

同時(shí)提取卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常內(nèi)膜的蛋白，在Western Blot 實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證焦亡相關(guān)因子與PI3K/AKT 信號(hào)通路在兩組中的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，焦亡相關(guān)因子及信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、4。

圖3 焦亡相關(guān)因子在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常內(nèi)膜中蛋白水平的表達(dá)Fig 3 Expression of pyroptosis-related factors at the protein level in ovarian endometriosis ectopic cysts versus normal endometrium

圖4 信號(hào)通路PI3K/AKT 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常內(nèi)膜中蛋白水平的表達(dá)Fig 4 Expression of the signaling pathway PI3K/AKT at the protein level in ectopic cysts of ovarian endometriosis compared with normal endometrium

2.3 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中焦亡相關(guān)因子與PI3K/AKT 的表達(dá)呈正相關(guān)

采用Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)分析卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中焦亡相關(guān)因子和PI3K/AKT 信號(hào)通路mRNA 表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果顯示焦亡相關(guān)因子與PI3K/AKT 信號(hào)通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 卵巢子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞焦亡相關(guān)因子與信號(hào)通路PI3K/AKT 表達(dá)水平的相關(guān)性Tab 2 Correlation between pyroptosis-related factors and expression levels of signaling pathway PI3K/AKT in ovarian endometriosis cells

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，又被稱為“不死癌癥”。其復(fù)雜的癥狀給育齡女性的生理及心理均帶來(lái)了極大的痛苦。然而到目前為止，還沒(méi)有一種較完美的方法可以治療EMS?，F(xiàn)已推出的治療方法包括：（1）藥物療法；（2）保留子宮和卵巢的保守手術(shù)干預(yù)或切除子宮和卵巢的根治性手術(shù)干預(yù)；（3）期待療法［9］。但有研究表明無(wú)論方法如何，均有約50%的患者在5 年反復(fù)出現(xiàn)癥狀［1］。藥物只能用于治療已經(jīng)有癥狀的患者，而手術(shù)不僅會(huì)影響卵巢卵泡的儲(chǔ)備功能，且復(fù)發(fā)率也高達(dá)50%［10］。目前對(duì)該疾病形成的因素，最合理的解釋是月經(jīng)逆行假說(shuō)，指含有可存活的細(xì)胞的子宮內(nèi)膜異位癥碎片經(jīng)輸卵管回流至骨盆，植入腹膜和腹部器官，并產(chǎn)生持續(xù)的炎癥與粘連。雖然此理論是被接受的，但無(wú)法解釋為什么90%的女性會(huì)出現(xiàn)月經(jīng)逆行，但只有10% 的女性會(huì)發(fā)展為EMS［11］。因此解決子宮內(nèi)膜異位癥這一難題，需以生理病理為基礎(chǔ)，充分了解子宮內(nèi)膜異位癥的潛在分子發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)。

細(xì)胞焦亡是一種伴有炎癥因子產(chǎn)生和釋放的不同于細(xì)胞凋亡的一種特殊程序化細(xì)胞死亡，是近年來(lái)研究熱點(diǎn)。細(xì)胞焦亡信號(hào)通路包含依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（cystein-containing aspartat-specific protease-1，Caspase-1）的經(jīng)典途徑和依賴Caspase-4/5/11 的非經(jīng)典途徑［12］。在經(jīng)典途徑中NOD 樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）與接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和效應(yīng)蛋白Caspase-1（pro-Caspase-1）相互作用產(chǎn)生NLRP3 炎癥小體，在此過(guò)程中前體Caspase-1 被激活，活化的Caspase-1 不僅促進(jìn)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 前體成熟激發(fā)炎癥反應(yīng)，還切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD）使其暴露具有打孔活性的N 端結(jié)構(gòu)（GSDMD-N），GSDMD-N 在細(xì)胞膜上形成孔道，并釋放大量的IL-1β，IL-18 等炎癥物質(zhì)引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［13］。有研究報(bào)道，細(xì)胞焦亡的發(fā)生與經(jīng)典PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)，且在不同的疾病中細(xì)胞焦亡與PI3K/AKT 信號(hào)通路發(fā)揮的作用不同［14，15］。最新一項(xiàng)研究表明，麥芽酚通過(guò)抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路來(lái)阻斷NLRP3 炎癥小體形成，最終導(dǎo)致IL-1β，IL-18 等炎性因子減少?gòu)亩_(dá)到抑制細(xì)胞焦亡來(lái)減輕椎間盤(pán)內(nèi)炎癥的作用［14］。而另一項(xiàng)研究指出在BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中紫杉葉素可以上調(diào)PI3K/AKT 信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞焦亡從而減輕脊髓損傷后的神經(jīng)炎癥［8］。因此驗(yàn)證以炎癥性疾病為特征的子宮內(nèi)膜異位癥中細(xì)胞焦亡與PI3K/AKT 信號(hào)通路的作用。

近期研究顯示E3 泛素連接酶TRIM24 可負(fù)調(diào)控NLRP3/Caspase-1/IL-1β 介導(dǎo)的異位人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞焦亡和遷移［16］。同時(shí)，Xu 等［17］的研究表明在原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，沉默長(zhǎng)非編碼轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（lnc-MALAT1）可改善NLRP3介導(dǎo)的焦亡和IL-1β 釋放，從而緩解TGF-β1 介導(dǎo)的纖維化。一致地，本研究檢測(cè)到焦亡相關(guān)因子GSDMD、Caspase-1、NLRP3、炎性因子IL-1β、IL-18 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥囊腫組織中的表達(dá)均高于在正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，因此可以證實(shí)細(xì)胞焦亡這一炎癥反應(yīng)參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展。在檢測(cè)焦亡相關(guān)因子的同時(shí)還檢測(cè)信號(hào)通路PI3K/AKT 的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PI3K/AKT 信號(hào)通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥囊腫組織中同樣較正常內(nèi)膜組織高表達(dá)。PI3K/AKT 信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展早在之前的研究中被證實(shí)［18，19］。Takeuchi 等［20］近年來(lái)發(fā)現(xiàn)原始卵泡的過(guò)度激活會(huì)引起子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的卵巢儲(chǔ)備減少，并且這種激活是由PI3K-PTEN-AKT-Foxo3 途徑介導(dǎo)的。但至今還沒(méi)有研究關(guān)注細(xì)胞焦亡與PI3K/AKT 信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜異位癥中的關(guān)系。本研究采用Pearson 檢驗(yàn)分析，得出結(jié)論卵巢子宮內(nèi)膜異位癥囊腫組織中的焦亡相關(guān)因子mRNA 的表達(dá)水平分別與信號(hào)通路PI3K、AKT mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)。在前人研究基礎(chǔ)上，結(jié)合本次研究推測(cè)細(xì)胞焦亡調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥是通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究首次在子宮內(nèi)膜異位癥中將細(xì)胞焦亡與PI3K/AKT 信號(hào)通路聯(lián)系起來(lái)，有望進(jìn)一步揭示子宮內(nèi)膜異位癥的分子機(jī)制并為其提供新的治療靶點(diǎn)。本研究主要局限于組織學(xué)層面，因此驗(yàn)證還不夠充分，后續(xù)還將從動(dòng)物，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)多維度探索細(xì)胞焦亡經(jīng)典/非經(jīng)典途徑與PI3K/AKT信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜異位癥中的具體調(diào)控機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

萇雨環(huán)：課題的構(gòu)思與實(shí)驗(yàn)，撰寫(xiě)文章；呂麗麗、李曼、王夢(mèng)格、張銘娟：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，分析；葉國(guó)柳：論文指導(dǎo)與修改，經(jīng)費(fèi)支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。