許 蘭, 肖亦舒, 劉春亞, 賈炳豪, 杜 樂(lè), 李冬娜, 任立成

(海南醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室, ?？?571199)

哺乳動(dòng)物血紅蛋白是由與血紅素相關(guān)的2條α和2條β-多肽鏈組成的四聚體,多肽鏈組成不同形式的血紅蛋白由相關(guān)但不同的基因表達(dá)提供。在人類基因組中,編碼α和β-多肽鏈的基因位于不同染色體上的2個(gè)多基因簇中。每個(gè)簇包含在個(gè)體發(fā)育不同階段表達(dá)的幾個(gè)基因:前者由位于16號(hào)染色體上的胚胎基因ε和2個(gè)成人基因α所編碼;后者由位于11號(hào)染色體上的5個(gè)(1個(gè)胚胎基因ε、2個(gè)胎兒基因Gγ、Aγ和2個(gè)成人基因δ和β)功能基本相同的基因所組成。珠蛋白基因的這種階段特異性表達(dá)現(xiàn)象稱為珠蛋白基因轉(zhuǎn)換[1,2]。

人血紅蛋白轉(zhuǎn)換描述了人β-珠蛋白基因復(fù)合物的5個(gè)珠蛋白基因(HBE(hemoglobin subunit epsilon)、HBG2(hemoglobin subunit gamma 2)、HBG1(hemoglobin subunit gamma 1)、HBD(hemoglobin subunit delta)和HBB(hemoglobin subunit beta)分別編碼ε、γ、δ、β珠蛋白鏈)的高度協(xié)同調(diào)控表達(dá)的分子機(jī)制。在人類從胚胎早期到晚期的發(fā)育過(guò)程中,這些珠蛋白基因的激活順序?qū)?yīng)于它們?cè)?1號(hào)染色體上5′到3′的排列位置(HBE-HBG2-HBG1-HBD-HBB)。研究發(fā)現(xiàn),β-珠蛋白各基因轉(zhuǎn)錄活性主要受位點(diǎn)控制區(qū)(locus control regions, LCR)的調(diào)控,這是一個(gè)位于ε基因上游6～25 kb區(qū)域內(nèi)的遠(yuǎn)端順式增強(qiáng)子調(diào)控元件,調(diào)控β-珠蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄活性。LCR通過(guò)染色質(zhì)的折疊作用,在人體不同發(fā)育階段、與不同珠蛋白基因的啟動(dòng)子結(jié)合,從而在時(shí)間和空間上特異性的調(diào)控基因的轉(zhuǎn)換表達(dá)[3-6]。人類β-珠蛋白基因階段特異性表達(dá)的遺傳改變和表觀遺傳機(jī)制引起了廣泛關(guān)注。β-珠蛋白基因的階段特異性表達(dá)是由不同機(jī)制組成的一個(gè)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)細(xì)胞在不同狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換時(shí),其基因組空間組織的整體變化與局部轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)狀態(tài)密切相關(guān)。染色質(zhì)構(gòu)象通過(guò)抑制或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與其靶標(biāo)結(jié)合的活性,從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。

近年來(lái),三維基因組的研究成為理解細(xì)胞命運(yùn)決定的一個(gè)不可或缺的方面,與高通量測(cè)序和染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(chromosome conformation capture, 3C)相關(guān)的新技術(shù)的發(fā)展,使人們能夠直接對(duì)染色質(zhì)的空間構(gòu)象進(jìn)行分析,揭示了染色質(zhì)狀態(tài)、基因組構(gòu)象和基因表達(dá)動(dòng)態(tài)之間存在的顯著聯(lián)系。這為解決細(xì)胞分化、細(xì)胞重編程和腫瘤發(fā)生過(guò)程中關(guān)鍵的生物過(guò)程鋪平道路[7,8]。

本研究以急性白血病CD4+T細(xì)胞為研究對(duì)象,用不同濃度雷帕霉素處理細(xì)胞,研究其核內(nèi)β-珠蛋白家族基因染色質(zhì)重塑過(guò)程中,染色質(zhì)三維相互作用網(wǎng)絡(luò)變化過(guò)程、染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)的重構(gòu),以及染色質(zhì)重塑在功能上調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。雷帕霉素作為mTOR的變構(gòu)抑制劑,在臨床上是用于治療血紅蛋白病的良好候選藥物,對(duì)紅細(xì)胞生成有顯著的促進(jìn)作用。雷帕霉素及其類似物不僅可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制,還可以影響基因轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控[9]。因此,開(kāi)展對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)染色質(zhì)重塑分子機(jī)制的研究具有十分重要的基礎(chǔ)理論與臨床實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人CD4+T淋巴白血病細(xì)胞(Jurkat細(xì)胞株)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢);雷帕霉素(rapamycin, RAPA)購(gòu)自Sigma公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒Fasting RT Kit、DNA純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;兔抗-HBD、兔抗-HBE、兔抗-HBG和兔抗-GAPDH抗體均購(gòu)自博士德生物技術(shù)有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;抗-CTCF抗體購(gòu)自美國(guó)upstate公司;TB Green? Premix Dimer EraserTM(RR091A)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(A25742)熒光定量試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific有限公司;超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自biosharp生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將CD4+T細(xì)胞接種于含10 %胎牛血清和1 %青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃和5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)處在指數(shù)期的細(xì)胞密度達(dá)到80 %時(shí),用終濃度為10, 20, 50 nmol/L的RAPA處理細(xì)胞48 h,即刻收集細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RT-qPCR及Western 印跡分析

使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1 μL稀釋10×的cDNA為模板進(jìn)行定量分析,以GAPDH基因作為內(nèi)參,基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT公式計(jì)算。在Applied Biosystems QuantStudio 3熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),反應(yīng)程序按照定量試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行(RR091A):95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 25 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。設(shè)計(jì)引物序列正如Table 1所示。收集不同濃度RAPA處理的細(xì)胞懸液加入RIPA裂解液,充分裂解細(xì)胞以提取總蛋白質(zhì)。制備15 % SDS-PAGE凝膠分離樣品,5 %脫脂奶粉封閉2 h,一抗4 ℃孵育過(guò)夜,二抗孵育2 h,ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.4 甲醛交聯(lián)細(xì)胞核樣品的制備

當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞處在指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),在培養(yǎng)基中添加甲醛,使其終濃度為1 %,室溫下交聯(lián)固定10 min,加入終濃度為0.125 mol/L的甘氨酸,振蕩混勻5 min,淬滅甲醛。用PBS洗滌3次,加入5 mL NP-40細(xì)胞裂解液,在冰上裂解1.5 h,離心去上清;再重新加入1 mL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞沉淀,收集交聯(lián)的細(xì)胞核,每管約含107個(gè)細(xì)胞。將樣品儲(chǔ)存于-80 ℃。

1.5 甲醛輔助分離調(diào)控元件(FAIRE)分析

FAIRE樣品制備方法參考Simon 等[10-12]報(bào)道的方法。取一支交聯(lián)的細(xì)胞核進(jìn)行超聲波處理,將染色質(zhì)DNA剪切至200～300 bp的平均大小。取超聲后樣品的10 %作為上樣量分析。剩余樣品4 ℃離心,去除不溶物,通過(guò)酚氯仿抽提純化DNA,即可獲得FAIRE樣品。在Applied Biosystems QuantStudio 3熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),按照定量試劑盒(RR091A)說(shuō)明設(shè)置反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 25 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)Table 2。

Table 2 Primer sequences for FAIRE/ChIP

1.6 染色體構(gòu)象捕獲(3C)技術(shù)分析

3C樣品制備方法參考Dekker[12,13]等報(bào)道的方法進(jìn)行。交聯(lián)的細(xì)胞核用限制酶緩沖液洗滌并重懸于含有1% SDS的限制酶緩沖液中,37 ℃恒溫振蕩10 min,加入20 % Trion 100猝滅SDS,之后加入Hind Ⅲ 酶切消化過(guò)夜(14～16 h),酶切結(jié)束,加入10 % SDS于65 ℃水浴孵育20 min滅活酶。在10 mL的連接體系中,加入T4 DNA連接酶,16 ℃條件下連接4～5 h。之后加入蛋白酶K消化蛋白質(zhì)并通過(guò)乙醇沉淀DNA,即可獲得3C樣品。在Applied Biosystems QuantStudio 3熒光定量PCR儀上,對(duì)3C樣品進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。qPCR采用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix熒光定量試劑盒(ABI),按照試劑盒要求設(shè)置反應(yīng)程序:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。3C定量PCR引物通過(guò)Primer3在線設(shè)計(jì),其序列見(jiàn)Table 3。

Table 3 Primer sequences for 3C

1.7 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)分析

ChIP樣品的制備方法參考文獻(xiàn)報(bào)道[12]以及試劑盒說(shuō)明的方法進(jìn)行。甲醛交聯(lián)過(guò)的細(xì)胞核加入1 mL RIPA緩沖液,重懸并超聲,將其剪切到200～300 bp的平均大小。超聲樣品4 ℃離心,取上清的10 %作為上樣量分析。余下樣品加入10 mL RIPA進(jìn)行稀釋,加入蛋白酶抑制劑和3 μL的CTCF抗體,4 ℃低速旋轉(zhuǎn)反應(yīng)過(guò)夜。加入20 μL的蛋白 A/G瓊脂糖(protein A/G plus-agarose)親和過(guò)夜,收集DNA-蛋白質(zhì)免疫復(fù)合物。所富集的DNA樣品,用100 μL EB 緩沖液洗脫。洗脫樣品加蛋白酶K,在65 ℃下消化解交聯(lián)過(guò)夜。ChIP富集的DNA樣品進(jìn)一步用超薄DNA純化試劑盒純化回收。按照定量試劑盒(RR091A)說(shuō)明設(shè)置反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 25 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)同F(xiàn)AIRE引物一致(見(jiàn)Table 1)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖,以(mean ±SD)表示分析結(jié)果,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)比較,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素影響β-珠蛋白家族基因的表達(dá)水平

本課題組前期研究工作發(fā)現(xiàn),RAPA作用于CD4+T細(xì)胞48 h的半抑制濃度約為98.82 nmol/L[14]。高濃度的RAPA作用下,會(huì)抑制細(xì)胞增殖并導(dǎo)致細(xì)胞自噬,低濃度處理情況下對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。因此,本文選取終濃度為10 、20 和50 nmol/L濃度的RAPA處理細(xì)胞48 h時(shí),收集細(xì)胞樣本,提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別對(duì)β-珠蛋白家族基因的5個(gè)成員HBE、HBG1、HBG2、HBD和HBB的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析。qPCR結(jié)果表明,β-珠蛋白家族基因在未處理的CD4+T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平具有明顯的差異性(Fig.1A);其中,HBE與HBD基因轉(zhuǎn)錄水平較高,HBB基因轉(zhuǎn)錄水平最低。經(jīng)10 nmol/L RAPA處理后,珠蛋白基因HBG1/HBG2、HBD、HBB的轉(zhuǎn)錄水平均降低;RAPA處理濃度增加到20 nmol/L和50 nmol/L時(shí),HBE、HBG1/HBG2、HBD和HBB基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升,上調(diào)約2～3倍;尤其是HBB基因經(jīng)50 nmol/L的RAPA處理時(shí),上調(diào)近10倍;而HBE基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著RAPA處理濃度的增加一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

通過(guò)Western 印跡分析,進(jìn)一步驗(yàn)證了β-珠蛋白家族基因在蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化趨勢(shì)(Fig.1 B)。RAPA誘導(dǎo)后,β-珠蛋白家族基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上調(diào)。其中,HBG、HBD、HBB基因在10 nmol/L濃度下,蛋白質(zhì)表達(dá)水平下調(diào),20 nmol/L和50 nmol時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)水平上升;HBE基因經(jīng)RAPA誘導(dǎo)后蛋白質(zhì)的表達(dá)水平上調(diào),與定量PCR結(jié)果趨勢(shì)基本一致。研究結(jié)果表明,β-珠蛋白家族基因在RAPA誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的差異。這為進(jìn)一步深入研究β-珠蛋白家族基因轉(zhuǎn)換表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制提供了良好的模型。據(jù)此研究結(jié)果,本文認(rèn)為,RAPA誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞可能改變了細(xì)胞內(nèi)的表觀遺傳學(xué)微環(huán)境,例如染色質(zhì)開(kāi)放性和基因座位的空間組織等,從而影響基因的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步探究β-珠蛋白家族基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制,本文通過(guò)FAIRE、3C及ChIP技術(shù)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證分析。

2.2 雷帕霉素誘導(dǎo)β-珠蛋白基因座位染色質(zhì)可及性改變

基因表達(dá)水平的改變與染色質(zhì)可及性格局的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)。開(kāi)放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)是招募轉(zhuǎn)錄因子到DNA序列以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所必需的[15-17]。為了進(jìn)一步研究β-珠蛋白家族基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制,本文應(yīng)用甲醛輔助分離調(diào)控元件(formaldchyde assisted isolation of regulatory elements, FAIRE)技術(shù)分析細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的開(kāi)放程度。FAIRE是直接檢測(cè)基因組核小體缺失區(qū)域的一種簡(jiǎn)單方法。它可以直接富集活性染色質(zhì)區(qū)域,對(duì)該區(qū)域的DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序,就可以在全基因組范圍內(nèi)對(duì)開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)行分析和作圖。

本文通過(guò)qPCR實(shí)驗(yàn)對(duì)β-珠蛋白家族基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)的開(kāi)放程度進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果正如Fig.2所示,當(dāng)10 nmol/L濃度的RAPA誘導(dǎo)時(shí),珠蛋白HBG1/2、HBD、HBB基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)可及性降低,當(dāng)RAPA處理濃度增加到20 nmol/L和50 nmol/L時(shí),染色質(zhì)可及性明顯增加。調(diào)控元件LCR在10 nmol/L、20 nmol/L濃度的RAPA誘導(dǎo)下,染色質(zhì)可及性降低;50 nmol/L時(shí),可及性增加。經(jīng)10、20 和50 nmol/L濃度的RAPA誘導(dǎo),β-珠蛋白家族基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)可及性變化趨勢(shì)與基因表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致。但是,在50 nmol/L RAPA處理細(xì)胞時(shí),各基因的染色質(zhì)可及性變化趨勢(shì)與基因表達(dá)趨勢(shì)略微不符,這是由于RAPA處理濃度偏高,引起細(xì)胞自噬,使其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散,從而導(dǎo)致50 nmol/L RAPA誘導(dǎo)時(shí),染色質(zhì)可及性整體結(jié)果虛高。這些結(jié)果表明,10 nmol/L RAPA能夠抑制珠蛋白基因染色質(zhì)的開(kāi)放程度,從而抑制基因的表達(dá);20 nmol/L和50 nmol/L的RAPA能夠活躍珠蛋白基因染色質(zhì)開(kāi)放區(qū),從而激活基因的表達(dá)。染色質(zhì)可及性分析結(jié)果,進(jìn)一步證明了RAPA通過(guò)影響染色質(zhì)可及性重構(gòu),從而在功能上調(diào)控該基因家族成員的表達(dá)。

Fig.2 Chromatin accessibility analysis of β-globin family gene loci after RAPA induction After 48 hours of RAPA treatment, qPCR was used to analyze the degree of chromatin opening in the promoter regions of LCR and β-globin family genes. Results are reported as the mean ± SD (n=3).*P<0.05,**P<0.01

2.3 雷帕霉素誘導(dǎo)LCR與β-珠蛋白家族基因座位間相互作用頻率的改變

為進(jìn)一步了解RAPA誘導(dǎo)染色質(zhì)可及性重構(gòu)過(guò)程中,染色質(zhì)開(kāi)放程度對(duì)染色質(zhì)之間相互作用的影響。本文通過(guò)3C技術(shù),分析了RAPA誘導(dǎo)細(xì)胞前后,β-珠蛋白家族基因座位的空間組織變化過(guò)程。在珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域?qū)ふ液线m的Hind III酶切位點(diǎn),在該點(diǎn)位設(shè)計(jì)下游引物,LCR區(qū)域設(shè)計(jì)上游引物,并作為3C分析的錨定位點(diǎn)(Anchor)(Fig.3A)。通過(guò)控制模板對(duì)不同引物間的擴(kuò)增效率進(jìn)行校正,3C模板的設(shè)計(jì)參照Ren L報(bào)道的方法[12],qPCR實(shí)驗(yàn)分析調(diào)控元件LCR與珠蛋白家族基因啟動(dòng)子區(qū)之間的相互作用頻率。由于3C樣品成分復(fù)雜,使用模板量大,易受背景噪音的影響產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,故需要對(duì)3C引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。qPCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示(Fig.3A),HBE、HBG1/HBG2、HBD和HBB基因啟動(dòng)子區(qū)分別與調(diào)控元件LCR之間發(fā)生相互作用,形成連接產(chǎn)物,且連接產(chǎn)物未見(jiàn)非特異性擴(kuò)增。

Fig.3 3C-qPCR analysis of the interaction frequency between β-globin family genes and LCR A schematic of the β-globin family gene region depicts the locations of the Hind III sites (top tick marks) and the primers used (bottom tick marks) in the 3C assays. The direction and length of the arrows indicate the primer direction and the size of the amplified fragment; (B) After cells were treated with different concentrations of RAPA for 48 hours, the frequency of interaction between the regulatory element LCR and the globin gene promoter region was analyzed by qPCR. Results are reported as the mean ± SD (n=3).*P<0.05,**P<0.01

qPCR分析結(jié)果進(jìn)一步顯示(Fig.3B),經(jīng)不同濃度RAPA誘導(dǎo),調(diào)控元件LCR與珠蛋白家族基因啟動(dòng)子區(qū)之間的相互作用頻率存在明顯差異。LCR-HBE之間的相互作用頻率呈現(xiàn)上升趨勢(shì);而LCR- HBG1/HBG2相互作用頻率均呈現(xiàn)降低趨勢(shì);LCR-HBD/HBB在10 nmol/L濃度的RAPA誘導(dǎo)下相互作用頻率降低,隨著RAPA濃度增加,相互作用頻率也隨之增加。LCR與HBE、HBD及HBB啟動(dòng)子區(qū)相互作用頻率變化趨勢(shì)與染色質(zhì)可及性變化趨勢(shì)基本一致。進(jìn)一步說(shuō)明了RAPA通過(guò)改變?chǔ)?珠蛋白家族基因座位的空間結(jié)構(gòu),進(jìn)而調(diào)控該基因的表達(dá)。在研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn),LCR-HBG2相互作用頻率均降低與染色質(zhì)可及性變化趨勢(shì)相反,這是由于在設(shè)計(jì)HBG2基因的3C引物時(shí),Hind III酶切位點(diǎn)分布較少,所選取的研究片段過(guò)長(zhǎng)(7.4 kb),在樣品制備過(guò)程中,染色質(zhì)片段隨機(jī)連接時(shí)不易與LCR形成有效連接片段,進(jìn)而導(dǎo)致LCR與HBG2之間的相互作用頻率偏低。

2.4 雷帕霉素處理CD4+T細(xì)胞,改變了CTCF與β-珠蛋白家族基因座位的結(jié)合頻率

CTCF(CCCTC-binding factor)是一種重要的染色質(zhì)架構(gòu)蛋白質(zhì)。它通過(guò)介導(dǎo)染色質(zhì)環(huán)的形成,改變?nèi)旧|(zhì)的空間組織結(jié)構(gòu)。染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的改變與基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。ChIP作為研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具,將該技術(shù)與高通量測(cè)序結(jié)合,能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)與目的蛋白質(zhì)相互作用的DNA片段[18-19]。本文通過(guò)qPCR實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證β-珠蛋白家族基因與CTCF之間相互作用頻率的變化情況,以期說(shuō)明RAPA誘導(dǎo)過(guò)程中,CTCF蛋白參與調(diào)控β-珠蛋白家族基因的空間組織構(gòu)象,導(dǎo)致珠蛋白啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)可及性發(fā)生改變,進(jìn)而在功能上調(diào)控基因的表達(dá)。研究結(jié)果正如Fig.4顯示,不同濃度RAPA誘導(dǎo)后,CTCF與β-珠蛋白家族各基因的結(jié)合頻率發(fā)生顯著改變。10 nmol/L濃度的RAPA處理時(shí),除HBE基因外,珠蛋白HBG1/2、HBD和HBB基因啟動(dòng)子區(qū)與CTCF的結(jié)合頻率降低;RAPA處理濃度增加到20 nmol/L和50 nmol/L時(shí),珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)與CTCF的結(jié)合頻率增加;調(diào)控元件LCR在10 nmol/L和20 nmol/L濃度的RAPA誘導(dǎo)下,與CTCF的結(jié)合頻率降低;50 nmol/L時(shí),與CTCF的結(jié)合頻率顯著增加。CTCF結(jié)合頻率的變化趨勢(shì)與染色質(zhì)可及性以及染色質(zhì)相互作用頻率的變化趨勢(shì)基本一致。該結(jié)果進(jìn)一步證明了CTCF參與了RAPA所誘導(dǎo)的β-珠蛋白家族基因座位的重塑過(guò)程,從而在功能上調(diào)控了該基因家族成員的表達(dá)。

3 討論

血紅蛋白病是一種遺傳性疾病。在這種疾病中,點(diǎn)突變會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)異常的珠蛋白鏈。例如,β珠蛋白鏈合成異常會(huì)導(dǎo)致β-地中海貧血,這是許多亞洲國(guó)家最常見(jiàn)的血紅蛋白病。地中海貧血是一個(gè)重要的健康問(wèn)題,約1 %～5 %的世界人口是地中海貧血的突變攜帶者。根據(jù)合成受抑制的鏈,又將地中海貧血命名為α-,β-,γ-,δ-等地中海貧血。所有地中海貧血癥的共同點(diǎn)是血紅蛋白鏈的合成不足,導(dǎo)致不穩(wěn)定的血紅蛋白鏈在紅系細(xì)胞內(nèi)積累使得紅細(xì)胞過(guò)早溶解。地中海貧血是一種復(fù)雜的疾病,由許多不同的分子缺陷引起。來(lái)自正常供體的造血干細(xì)胞移植、基因治療或者患者自體造血干細(xì)胞的基因編輯可以明確改善有缺陷的紅細(xì)胞生成,是治療重型地中海貧血的有效方法。盡管如此,移植排斥反應(yīng)和移植相關(guān)死亡的風(fēng)險(xiǎn)很高,而基因治療和基因編輯試驗(yàn)仍需要相當(dāng)大的優(yōu)化和進(jìn)一步的安全性評(píng)估。定期輸血和鐵螯合療法仍然是地中海貧血治療的基石[20,21]。

隨著對(duì)珠蛋白基因表達(dá)的分子基礎(chǔ)和表觀遺傳機(jī)制的深入研究。表觀遺傳藥物逐漸成為治療地中海貧血的新方案。許多研究旨在尋找能夠提高人類HbF水平的藥物,例如激素、細(xì)胞毒劑和造血細(xì)胞因子等。特別是尋找與病理無(wú)關(guān)但表現(xiàn)出誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)特性的分子。在紅細(xì)胞生成過(guò)程中,mTOR是紅細(xì)胞在體外和體內(nèi)生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,用RAPA抑制mTOR通路,對(duì)紅細(xì)胞生成有顯著影響[22]。Pecoraro等實(shí)驗(yàn)室[23]對(duì)25例鐮狀細(xì)胞病和25例β-地中?；颊叩募t系祖細(xì)胞進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)RAPA能夠增加60 %的鐮狀細(xì)胞病患者和56 %的β-地中?；颊咧笑?珠蛋白的mRNA表達(dá),并將其療效與羥基脲進(jìn)行比較。結(jié)果表明,RAPA可在體內(nèi)用于治療血紅蛋白疾病,特別是對(duì)羥基脲治療無(wú)效或長(zhǎng)期治療后反應(yīng)降低的患者。這一研究結(jié)果證明,RAPA可能是體內(nèi)用于治療血紅蛋白病的良好候選藥物。Zuccato等[24]報(bào)告了一項(xiàng)基于西羅莫司的臨床試驗(yàn)結(jié)果。低劑量的西羅莫司可改變?cè)煅δ?并使部分β-地中海貧血患者的γ-珠蛋白基因的表達(dá)增加。

本文研究結(jié)果為上述研究團(tuán)隊(duì)的臨床研究結(jié)果提供了重要的分子機(jī)制與理論基礎(chǔ)。RAPA是一種在臨床上較為廣泛應(yīng)用的抗免疫排斥藥物,可以抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。本文使用RAPA處理CD4+T細(xì)胞后,顯著提高了β-珠蛋白家族基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)的開(kāi)放程度,更加開(kāi)放的染色質(zhì)促進(jìn)了CTCF介導(dǎo)的調(diào)控元件LCR與珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合,以激活基因的轉(zhuǎn)錄。而本文對(duì)不同RAPA處理?xiàng)l件下染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)的變化情況,以及調(diào)控元件與基因之間相互作用頻率進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RAPA處理濃度從低到高的變化過(guò)程中,染色質(zhì)的開(kāi)放程度發(fā)生不同的改變,這種變化導(dǎo)致了基因表達(dá)模式也呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。染色質(zhì)可及性增加時(shí),基因表達(dá)上調(diào);染色質(zhì)可及性降低時(shí),基因表達(dá)下調(diào)(Fig.5)。本文通過(guò)這種動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程闡述了β-珠蛋白家族基因表達(dá)轉(zhuǎn)換調(diào)控的分子機(jī)制,為臨床精準(zhǔn)治療提供了理論與臨床實(shí)踐基礎(chǔ)。

Fig.5 The pattern of chromatin structure changes induced by transcription of β-globin family genes This model describes the process of chromatin structure changes induced by β-globin gene transcription. In the context of open chromatin centers, the local remodeling of chromatin structure exposed the binding sites of the ε gene, and the transcription complex is recruited to the accessible LCR holocomplex. Transcription complexes are then transferred from the LCR to high affinity binding sites at the globin gene promoters, thereby activating the expression of the ε gene

此外,大量的臨床研究表明,RAPA在延長(zhǎng)壽命方面顯示出巨大的前景。RAPA可以用于預(yù)防和治療幾乎所有與年齡相關(guān)的疾病,包括癌癥、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)退行性變。據(jù)報(bào)道,RAPA作為一種抗衰老藥物在高劑量和低劑量的生物系統(tǒng)中具有截然不同的效應(yīng),中/高劑量時(shí)具有細(xì)胞毒性,低劑量時(shí)可抑制衰老、延長(zhǎng)壽命[25-26]。本文使用RAPA處理CD4+T細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)10 nmol/L RAPA顯著抑制HBG/HGD/HBE基因的表達(dá),激活HBE基因的表達(dá)。在人血紅蛋白轉(zhuǎn)換表達(dá)機(jī)制中,HBE編碼胚胎基因ε、HBG1/2編碼胎兒基因γ、HBD和HBB分別編碼成人基因δ和β,經(jīng)低濃度的RAPA誘導(dǎo)后,胚胎基因ε的表達(dá)水平顯著上升,而胎兒基因γ和成人基因δ/β的表達(dá)水平顯著降低。研究發(fā)現(xiàn),在低濃度的RAPA作用下,顯示出一種逆分化的特性,抑制細(xì)胞的分化。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以反映出低濃度的RAPA具有抗衰老的作用。

目前,許多新的治療方法正在開(kāi)發(fā)中。Sirolimus、benserazide和IMR-687可以誘導(dǎo)HbF的產(chǎn)生;apotransferrin、VIT-2763、PTG-300通過(guò)靶向地中海貧血的鐵代謝異常改善貧血。這可能結(jié)束單純依賴轉(zhuǎn)鐵蛋白作為地中海貧血治療主要手段的時(shí)代[27]?？傊?繼續(xù)開(kāi)發(fā)控制表觀基因組景觀的藥物在研究更精確、有針對(duì)性的療法方面具有廣闊的前景。

我們研究結(jié)果顯示,RAPA處理CD4+T細(xì)胞,增強(qiáng)了β-珠蛋白基因座位的染色質(zhì)可及性,開(kāi)放的染色質(zhì)有利于轉(zhuǎn)錄因子CTCF與基因序列的結(jié)合;并促進(jìn)順式增強(qiáng)子元件LCR與珠蛋白家族基因啟動(dòng)子區(qū)之間的相互作用,進(jìn)而激發(fā)基因轉(zhuǎn)錄的活躍性,從而精確調(diào)控珠蛋白基因家族的轉(zhuǎn)換表達(dá)。