樊昌宇, 丁 涵, 徐乙冉, 咸 蕊, 閆鳳娟

(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 江蘇 徐州 221116)

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性消化道腫瘤之一,而我國是原發(fā)性肝癌高發(fā)的國家,患病人數(shù)約占全球患病人數(shù)的一半[1]。根據(jù)2022年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,我國肝癌新發(fā)病例數(shù)高達(dá)43.1萬例,在所有癌癥中排名第四,死亡人數(shù)達(dá)到41.2萬人,位列第2[2]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界高發(fā)的肝癌類型,約占原發(fā)性肝癌總數(shù)的85%～90%[3]。盡管近年來醫(yī)療技術(shù)和治療方法有所改進(jìn),但肝細(xì)胞癌患者的5年生存率仍低于20%[4]。因此,深入探索調(diào)控肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子,對于開發(fā)新的肝癌診斷分子標(biāo)志物和治療靶點提供重要的理論基礎(chǔ)。

TRIM7(tripartite motif-containing protein 7)又稱作糖原結(jié)合蛋白(GNIP1),是2002年首次被鑒定出的E3泛素連接酶TRIM家族新成員[5],其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由1個RING結(jié)構(gòu)域、2個B-Box結(jié)構(gòu)域以及1個PRY/SPRY(B30.2)結(jié)構(gòu)域組成[6,7]。研究發(fā)現(xiàn),TRIM家族在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[8,9]?，F(xiàn)有研究表明,TRIM7除了在抗病毒、抗細(xì)菌等免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用外[10-13],其異常表達(dá)也參與肝癌、肺癌、腎細(xì)胞癌、骨肉瘤等多種腫瘤的發(fā)生[14-17]。有意思的是,在不同研究中,TRIM7通過泛素化修飾不同的底物表現(xiàn)出肝癌促進(jìn)和抑制的相反作用[7],提示TRIM7功能作用的復(fù)雜性。然而,肝癌發(fā)生中,TRIM7異常表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

SP1屬于SP/KLF轉(zhuǎn)錄因子家族,是第1個被發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下,SP1分布于體內(nèi)各種細(xì)胞內(nèi),通過與富含GC序列的基因啟動子區(qū)特異性結(jié)合,從而調(diào)控基因表達(dá)、參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種生命活動[18]。此外,SP1也參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn),SP1在肝癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤組織中表達(dá)水平顯著高于周圍正常組織,且與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn),SP1能夠直接結(jié)合在TRIM7基因啟動子上,從而上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)TRIM7基因的表達(dá),最終促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清(PAN, P30-3302)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco, C11995)、青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco, 15140-122)、胰酶(Gibco, 25200072)、Trizo(Invitrogen, 15596026)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme, R101-02)、SybrGreen qPCR Mix(DBI, 2143)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(promega, E1910)、TRIM7抗體(HUABIO,ER1918-12)、β-肌動蛋白(β-actin)(proteintech, 60008-1)、Flag抗體(Sigma, F3165)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

HEK-293 T、HepG2、和 L02細(xì)胞均來自于本實驗室凍存。細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基(10%FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗)中,并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗:細(xì)胞密度生長至80%時,采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000參照說明書步驟將相應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞。24 h后,收集細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測或提取細(xì)胞RNA、蛋白質(zhì)等后續(xù)實驗。

1.3 腫瘤組織中TRIM7的表達(dá)分析

采用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(http://timer.cistrome.org/)中的Gene_DE模塊分析TRIM7基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中所有腫瘤組織和鄰近正常組織中的表達(dá)情況;采用ToPP數(shù)據(jù)庫(http://www.biostatistics.online/topp/index.php)的單因素分析程序(univariate analysis)分析TRIM7基因在肝細(xì)胞癌(LIHC)中的表達(dá)以及肝細(xì)胞癌不同階段的表達(dá)分布,其參數(shù)設(shè)置如下:Select dataset: TCGA-LIHC;Data type: Gene expression;Cutoff: Median;Differential expression: yes。使用GEPIA2數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫,分析TRIM7基因表達(dá)與肝癌病人總生存時間的關(guān)系。GEPIA2數(shù)據(jù)庫參數(shù)設(shè)置:Gene:TRIM7;Methods: Overall survival;Group off: median;Hazards Ratio (HR): No;95% Confidence Interval: No。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫參數(shù)設(shè)置:Gene symbol:TRIM7;Split patients by: Auto select best cutoff;Survival: OS;Pathology: All;Patient: All。

1.4 三元基序家族蛋白7基因啟動子及其截短突變體報告基因載體構(gòu)建

以HepG2細(xì)胞基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增TRIM7基因啟動子序列,將純化的PCR產(chǎn)物(TRIM7啟動子片段)與報告基因載體pGL3-basic分別用MluI、Hind III進(jìn)行雙酶切,回收目的片段與載體片段經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,并利用含氨芐抗性的平板進(jìn)行篩選培養(yǎng)。次日挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,并挑取陽性克隆送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定,最后將測序正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)、提取質(zhì)粒pGL3-TRIM7-promoter。含有不同SP1結(jié)合位點TRIM7基因啟動子截斷突變體(PM1、PM2、PM3、PM4)以野生型TRIM7啟動子作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得,并按上述方法構(gòu)建到pGL3-basic載體中。

1.5 雙螢光素酶活性檢測

將生長狀態(tài)良好的HEK-293 T或HepG2細(xì)胞鋪至24孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時,共轉(zhuǎn)染野生型或突變型TRIM7基因啟動子驅(qū)動的螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒pGL3-TRIM7-pro、SP1表達(dá)質(zhì)粒,所有樣品均使用表達(dá)海腎熒光素酶的載體pRL-TK作為內(nèi)參,其中pGL3系列質(zhì)粒用量每孔為200 ng,pRL-TK用量為20 ng。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 用裂解緩沖液裂解細(xì)胞,根據(jù)制造商的說明采用雙熒光素酶報告試劑盒(Promega)檢測雙熒光素酶活性,螢火蟲熒光素酶活性歸一化為海腎熒光素酶活性,并表現(xiàn)為相對熒光素酶活性。

1.6 實時熒光定量PCR (RT-qPCR)

按照Trizol法從細(xì)胞中分離總RNA,隨后取出2 μL RNA溶液進(jìn)行濃度測定以及質(zhì)量鑒定;隨后根據(jù)產(chǎn)品說明書,使用HiScript II One Step RT-PCR Kit(諾唯贊)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;由RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA或者通過ChIP純化的DNA進(jìn)行RT-qPCR,采用SYBR Green PCR Master Mix,在CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection(Bio-Rad)系統(tǒng)上進(jìn)行;最后RT-qPCR檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析目的基因表達(dá),其中以β-肌動蛋白作為內(nèi)參。

1.7 Western印跡分析

將收取的細(xì)胞用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液在冰上裂解30 min,然后將細(xì)胞裂解液以12 000 r/min、4℃離心15 min收集上清液,在上清液中加入上樣(loading)緩沖液于 95℃金屬浴上煮沸15 min,使蛋白質(zhì)樣品變性。將等量的蛋白質(zhì)樣品通過SDS-PAGE凝膠分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉后,用一抗在4 ℃冰箱孵育過夜,經(jīng)洗膜、二抗孵育、再洗膜,用ECL (Millpore)顯影。

1.8 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)

將培養(yǎng)的L02細(xì)胞用1%(V/V)甲醛交聯(lián)固定,加入甘氨酸終止交聯(lián)(終濃度為0.125 mol/L),冷PBS洗細(xì)胞并收集細(xì)胞,在細(xì)胞核裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA)中裂解細(xì)胞,超聲打斷DNA至大小為400～800 bp。裂解物在4 ℃離心并保留上清,上清液中加入含蛋白酶抑制劑的稀釋緩沖液(20 mmol/L Tris-HCL,pH8.0,150 mmol/L NaCl,2 mmol/L EDTA,1%TritonX-100)進(jìn)行稀釋。用洗好的珠子和抗-Flag或?qū)φ誌gG在4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。清洗珠子后用洗脫緩沖液(0.1 mol/L NaHCO3,1% SDS,30 μg/mL蛋白酶K)在65 ℃過夜,以逆轉(zhuǎn)甲醛交聯(lián)。隨后,用DNA純化試劑盒純化DNA,用定量PCR法檢測純化的DNA。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

文章中所有實驗結(jié)果為3次獨(dú)立實驗代表性結(jié)果。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行分析,本研究檢測結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本均數(shù)間比較采用Student’st檢驗,多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 三元基序家族蛋白7在肝癌組織中的表達(dá)

TIMER2在線軟件以及腫瘤在線預(yù)后分析診斷平臺(ToPP)顯示:與正常組織相比,TRIM7基因在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)(Fig.1A),其中在肝細(xì)胞癌中TRIM7表達(dá)較正常組織明顯增多(P<0.001,Fig. 1A,B);并且隨著臨床上肝癌惡化程度增加,TRIM7表達(dá)呈遞增趨勢(Fig.1C,D)。此外,GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,在肝癌中,TRIM7高表達(dá)的腫瘤患者10年總體生存率明顯低于TRIM7低表達(dá)患者(Fig. 1E)。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果也顯示,TRIM7高表達(dá)的肝癌患者預(yù)后明顯較差(Fig.1F)。以上結(jié)果表明,TRIM7基因高表達(dá)參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。

2.2 三元基序家族蛋白7基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析

為了探究肝細(xì)胞癌中TRIM7基因表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制,本研究使用UCSC數(shù)據(jù)庫找到人TRIM7基因在染色體上的位置(chr5(q35.3):181193924-181205196, GRCh37/hg38),并分析轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)上游1 000 bp及下游170 bp范圍內(nèi)的DNA序列作為TRIM7基因啟動子預(yù)測序列。此外,本文利用在線網(wǎng)站(https://switchgeargenomics.com/)預(yù)測了與上述數(shù)據(jù)庫一致的TRIM7基因啟動子序列(Fig.2A)。利用在線軟件JAPSAR、HFTarget分析TRIM7基因啟動子序列上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。結(jié)果顯示,TRIM7基因啟動子的正義鏈上存在4個SP1轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點 (Fig.2B,C)。

Fig.2 The analyses of transcription factor binding sites in TRIM7 promoter (A) Schematic diagram of TRIM7 gene location; (B) Schematic of the SP1 binding motifs; (C) The related information of SP1 binding sites in the TRIM7 promoter

2.3 轉(zhuǎn)錄因子SP1正調(diào)控三元基序家族蛋白7基因啟動子活性

為了驗證轉(zhuǎn)錄因子SP1對TRIM7基因表達(dá)的調(diào)控作用,本研究以肝癌細(xì)胞HepG2的基因組DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增獲得TRIM7基因啟動子預(yù)測序列,并將此序列構(gòu)建至pGL3-basic報告基因質(zhì)粒中(Fig.3A)。最后,將重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序。測序結(jié)果與TRIM7啟動子序列進(jìn)行比對證實,成功構(gòu)建了pGL3-TRIM7-promoter報告載體并且擴(kuò)增的啟動子序列無突變(Fig.3B)。

Fig.3 SP1 positively regulates the activity of TRIM7 promoter (A) Schematic diagram of the vector of pGL3-Trim7 promoter; (B)The blast results of TRIM7 promoter sequence; (C) Luciferase reporter assays analyzing the effect of different doses of SP1 on TRIM7 promoter activity in HEK293T cells transfected with empty vector or plasmid encoding SP1 (0.1-0.8 μg) for 24 hours,*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001 versus control (0 μg) group. (D) Dual luciferase reporter assays analyzing the effect of SP1 overexpression or knockdown on TRIM7 promoter activity in HEK293T cells,***P< 0.001 versus control or si-ctrl group. All data are presented as the mean ± SD from three separate experiments

為了驗證SP1對TRIM7基因啟動子活性的影響,本文將不同劑量的轉(zhuǎn)錄因子SP1表達(dá)載體與pGL3-TRIM7-promoter報告載體共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞,進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。結(jié)果顯示:隨著轉(zhuǎn)錄因子SP1劑量的增加,TRIM7基因啟動子驅(qū)動的螢火蟲熒光素酶活性呈現(xiàn)遞增的趨勢,約為對照組的1.6～7倍(Fig.3C,D)。相反,沉默SP1顯著性抑制TRIM7啟動子活性約60%(Fig.3D)。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子SP1直接結(jié)合在三元基序家族蛋白7基因啟動子

為了進(jìn)一步驗證SP1通過結(jié)合在TRIM7啟動子上的SP1結(jié)合位點調(diào)控其活性,以TRIM7全長啟動子為模板,擴(kuò)增SP1結(jié)合位點缺失的截斷突變體TRIM7-PM1、PM2、PM3和PM4 (Fig.4A),并將突變體片段插入pGL3-basic報告基因質(zhì)粒中。將上述構(gòu)建的突變體報告質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子SP1共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,進(jìn)行雙熒光素酶活性報告檢測。結(jié)果顯示,隨著啟動子上SP1結(jié)合位點的缺失,SP1介導(dǎo)的啟動子轉(zhuǎn)錄激活作用明顯抑制,甚至完全取消(Fig.4A),提示SP1可能通過TRIM7啟動子的SP1位點激活其啟動子活性。為了探究SP1是否直接結(jié)合在TRIM7啟動子上,在肝細(xì)胞系L02中利用SP1抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀,并在TRIM7基因啟動子上的SP1結(jié)合位點附近設(shè)計引物,進(jìn)行ChIP-PCR檢測。結(jié)果顯示,與IgG陰性對照組相比,轉(zhuǎn)錄因子SP1在TRIM7啟動子上的SP1結(jié)合位點有明顯富集(P<0.01,Fig.4B)。以上結(jié)果提示,SP1通過直接結(jié)合在TRIM7啟動子上調(diào)控其表達(dá)。

Fig.4 SP1 directly binds to the promoter of TRIM7 (A) Graphic scheme of TRIM7 promoter deletion mutant that contains putative SP1 binding sites (left); Luciferase reporter assays analyzing the effect of SP1 on the wild type or mutant of TRIM7 promoter activity in HepG2 cells that transient co-transfected of the wild type or mutant of TRIM7 promoter-reporters with or without SP1 expression vector for 24 hours (right),**P< 0.01,***P < 0.001 versus control group. (B) ChIP-PCR analysis of SP1 binding on the promoter of TRIM7 gene in L02 cells transfected with Flag-SP1,the location of SP1 binding sites in TRIM7 promoter referred to Fig.2A;**P< 0.01,***P< 0.001 versus IgG group. All data are presented as the mean ± SD from three separate experiments

2.5 轉(zhuǎn)錄因子SP1促進(jìn)三元基序家族蛋白7基因表達(dá)

上述體外轉(zhuǎn)錄活性結(jié)果均提示,TRIM7啟動子上的SP1結(jié)合元件很可能對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵性作用。為進(jìn)一步驗證SP1調(diào)控TRIM7基因表達(dá),本文將不同劑量的SP1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,24 h后利用RT-qPCR和Western 印跡方法,分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測TRIM7基因表達(dá)。結(jié)果顯示,隨著SP1表達(dá)量增多,TRIM7基因表達(dá)呈明顯遞增的趨勢(>2倍)(Fig.5A,B);相反,使用siRNA沉默HepG2細(xì)胞內(nèi)SP1表達(dá),能夠顯著抑制TRIM7基因表達(dá),抑制效率約為60%(Fig.5C)。使用SP1結(jié)合抑制劑Mithramycin A處理過表達(dá)SP1的HepG2細(xì)胞,Western 印跡結(jié)果顯示,Mithramycin A呈現(xiàn)劑量依賴性抑制SP1介導(dǎo)的TRIM7基因表達(dá)上調(diào),抑制率為40%～60%(Fig.5D)?？傊?以上結(jié)果表明,SP1可以上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)TRIM7表達(dá)。

Fig.5 SP1 activates the expression of TRIM7 (A-B) HepG2 cells were transfected with different doses of SP1 (0.25- 4 μg) in 12 well culture plates, and after 24 hours, HepG2 cells were collected for RNA and protein extraction, respectively. RT-qPCR (A) and Western blot (B) analysis the expression level changes of TRIM7 in the above treated HepG2 cells; the representative results of TRIM7 protein were present with the auto exposure time and the long exposure time and marked as TRIM7 (s) or TRIM7 (L);*P<0.05,**P < 0.01,***P< 0.001 versus control(SP1-0) group. (C) HepG2 cells were transfected with two dependent siRNA target to SP1 gene (si-SP1-1 or si-SP1-2) separately, and collected for protein extraction after 24 hours. si-NC was used as a negative control. Western blot analysis of the silence efficiencies of SP1 and the expression of TRIM7 (left panel) as well as the average densitometry of TRIM7 expression relative to β-actin (right panel);**P < 0.01 versus si-NC group. (D) Western blot analysis of the expression of TRIM7 in HepG2 cells transfected with plasmid encoding SP1 followed by treated with indicated dose of mithramycin A for additional 24 hours. β-Actin was used as a loading control (left panel), and right graph shows relative TRIM7 protein level determined by densitometric analysis and normalized to the corresponding β-actin levels. Data are expressed as the mean of three independent experiments;*P<0.05 versus blank control group;#P<0.05,##P<0.01 versus Flag-SP1/ Mith A 0 group

3 討論

三結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)家族(tripartite motif, TRIM)是RING-E3泛素連接酶中最大的亞類之一,在人體中由80多個成員組成,其中大多數(shù)TRIM蛋白質(zhì)由于含有RING結(jié)構(gòu)域而具有E3泛素連接酶活性,并在天然免疫、自噬、細(xì)胞增殖和凋亡等多種細(xì)胞生命活動過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,而一些TRIM蛋白質(zhì)的異常表達(dá)會導(dǎo)致腫瘤在內(nèi)的各種疾病[20,21]。TRIM7也稱為GNIP/RNF90,是TRIM家族蛋白質(zhì)的新成員,在病毒感染、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[10,11]?，F(xiàn)有研究表明,TRIM7的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),例如TRIM7在肺腫瘤組織中的表達(dá)低于鄰近正常組織,且TRIM7表達(dá)與肺癌患者的臨床分期呈負(fù)相關(guān)[22]。但另有研究報道也發(fā)現(xiàn),在Ras驅(qū)動的癌癥模型中,過表達(dá)TRIM7增加了肺腫瘤負(fù)擔(dān),而TRIM7的下調(diào)則降低了腫瘤生長[14],提示TRIM7在肺癌發(fā)生中其功能的復(fù)雜性。此外,TRIM7異常表達(dá)與人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、臨床透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌ccRCC等腫瘤發(fā)生相關(guān),且與其預(yù)后不良具有相關(guān)性[17,23]。本文研究發(fā)現(xiàn),TRIM7在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào),并與肝癌的惡化程度呈正相關(guān)。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果也顯示,TRIM7高表達(dá)的肝癌患者預(yù)后明顯較差。然而,TRIM7在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

SP1作為鋅指轉(zhuǎn)錄因子SP家族中的一種,對許多啟動子中含有GC盒的細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要[24]。一系列的證據(jù)表明,在胃癌等多種腫瘤中,SP1出現(xiàn)過度激活,且SP1高表達(dá)與腫瘤的侵襲性生物學(xué)以及較差的臨床預(yù)后相關(guān)[25],例如,SP1通過與p62基因啟動子的GC盒結(jié)合激活p62轉(zhuǎn)錄,從而降低自噬流促進(jìn)胃癌發(fā)生[26]。本文利用多種在線數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),TRIM7基因啟動子的正義鏈上存在4個富含GC堿基的SP1轉(zhuǎn)錄因子潛在結(jié)合位點,并且利用雙熒光素酶報告實驗和染色質(zhì)免疫沉淀實驗證實,SP1可以直接結(jié)合在TRIM7啟動子上的潛在結(jié)合位點。此外,在線數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),SP1與TRIM7表達(dá)在肝細(xì)胞癌中具有相關(guān)性,并且我們的研究也表明,SP1可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌中TRIM7的表達(dá),而SP1結(jié)合抑制劑Mithramycin A處理則抑制了TRIM7的表達(dá)?？傊?以上研究初步揭示了肝細(xì)胞癌中TRIM7高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,但未來有必要利用高通量測序技術(shù)進(jìn)一步證實SP1在TRIM7啟動子上的結(jié)合位點,并利用基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù),在體內(nèi)多種水平驗證HCC中SP1對TRIM7基因表達(dá)的調(diào)控作用研究,從而為深入研究HCC中TRIM7異常表達(dá)的病理機(jī)制,以及臨床工作中肝細(xì)胞癌的有效治療方案的研究提供理論基礎(chǔ)。