韓東洋，劉澄澄，徐暢臨，張鑫，宋星星，張佳妮，沈冰茜，辛園園，張凌源，李珣

(廣西大學動物科學技術學院/廣西壯族自治區(qū)獸用生物制品工程研究中心/廣西畜禽繁育與疾病防控重點實驗室/廣西高校動物疫病預防與控制重點實驗室，廣西 南寧 530004)

大量研究證實雌性動物的生殖功能與能量代謝息息相關，能量代謝的不同狀態(tài)可直接影響動物的生殖活動[1-2]。隨著神經內分泌研究的發(fā)展，人們發(fā)現多種神經肽不僅參與動物的生殖活動和能量代謝，而且作為能量代謝信號調控動物的生殖功能[3-4]。2000年，Tsutsui等[5]在鵪鶉的下丘腦中發(fā)現了一種由12種氨基酸組成的神經肽，命名為促性腺激素抑制激素(GnIH)。大量研究證實GnIH在下丘腦、垂體和性腺水平均可參與動物的生殖調控[6]。有研究證明GnIH在卵巢水平參與動物的生殖調控，尤其影響卵巢顆粒細胞的生理功能，但其具體調控機制尚未完全明確[7-9]。

隨著GnIH生理功能研究的深入，發(fā)現GnIH還參與攝食、應激和能量代謝等多種生理活動。2005年，Tachibana等[10]給雞側腦室注射GnIH后發(fā)現能夠顯著增加動物的攝食量，推測GnIH可能是下丘腦中一種新型促食欲素。隨后，其他研究人員在羊、小鼠及獼猴上也得到相似的結論[11]。Benton等[12]研究發(fā)現GnIH促進動物攝食，并顯著升高脂肪中葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)表達和甘油三酯(TGs)的含量，抑制睪丸中葡萄糖轉運蛋白8(GLUT8)和胰島素受體的表達，同時顯著降低血清中睪酮含量。因此我們推測GnIH可能是聯(lián)系動物生殖與能量代謝的一種新型調控因子，并猜測GnIH可能通過調控卵泡的糖代謝影響卵巢的生殖功能。

本研究以廣西特色的瑤雞作為研究對象，研究GnIH對瑤雞卵巢葡萄糖攝入、糖酵解和三羧酸循環(huán)(TCA)過程的影響。期望通過本研究證實GnIH是一種新型的能量代謝調控因子，從而進一步完善GnIH生理功能，并為探究能量代謝異常導致卵巢功能障礙提供新的突破口。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

南丹瑤雞10只，雌性，180日齡，體重(1 700±100)g，購自南寧禽苗市場?，庪u適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為2組，其中對照組注射0.9%生理鹽水，每次0.1 mL/只；GnIH組注射24.54 μg/kg GnIH，每次0.1 mL/只，每天注射2次(7：00和19：00)，連續(xù)2周。

1.2 主要儀器及試劑

反轉錄試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；葡萄糖(GLU)試劑盒、丙酮酸測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

GnIH購自生工生物工程(上海)科技有限公司；糖代謝相關基因葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)、葡萄糖轉運蛋白3(GLUT3)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脫氫酶A(LDHA)、乳酸脫氫酶B(LDHB)和琥珀酸脫氫酶B(SDHB)引物均由北京擎科生物科技有限公司設計及合成，詳見表1。

表1 引物信息

1.3 采食模式監(jiān)測

瑤雞在恒定光照(12 h光照、12 h黑暗)和溫度(25±2)℃的條件下飼養(yǎng)，自由采食和飲水。分別記錄2組每天光照和黑暗條件下的采食量，每2 d記錄注射后1、2、4和8 h采食量。

1.4 臟器指數檢測

最后一次注射15 min后，將瑤雞頸動脈放血處死，取出卵巢并稱重，計算卵體比(卵巢重量/體重)。

1.5 葡萄糖和丙酮酸含量檢測

收集卵巢，稱重后于液氮速凍，儲存在-80 ℃?zhèn)溆?。將卵巢組織研磨，按照測定試劑盒說明書進行操作測定葡萄糖和丙酮酸的含量。

1.6 熒光定量RT-PCR檢測基因mRNA表達水平

按照TRIzol法提取各組卵泡總RNA，反轉錄獲得cDNA。采用熒光定量RT-PCR的方法檢測mRNA的表達情況。qPCR反應體系為20 μL，其中10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR 酶溶液、8 μL ddH2O、0.5 μL Primer 1、0.5 μL Primer 2和1 μL Template cDNA。反應程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算所檢測基因mRNA的相對表達量。

1.7 數據統(tǒng)計與分析

試驗結果采用SPSS 20.0軟件進行獨立樣本t檢驗進行評估，并進行顯著性檢驗，P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 GnIH對瑤雞表觀指標的影響

2.1.1 GnIH對瑤雞采食量的影響

由圖1可知，與對照組相比，腹腔注射GnIH后瑤雞的采食量增多。其中，注射GnIH后1、2、4、8 h瑤雞的采食量均顯著增加(P<0.05)，提示腹腔注射GnIH可引起瑤雞采食量的增加。

注：*表示P<0.05。下同。

由圖2所示，與對照組相比，腹腔注射GnIH后瑤雞的夜間平均采食量極顯著升高(P<0.01)。

注：**表示P<0.01。下同。

2.1.2 GnIH對瑤雞卵巢臟器指數的影響

由圖3可知，與對照組相比，腹腔注射GnIH后瑤雞的卵體比顯著降低(P<0.05)。

2.2 GnIH對卵巢糖代謝的影響

2.2.1 GnIH對瑤雞卵巢組織葡萄糖攝入的影響

由圖4可知，腹腔注射GnIH后，瑤雞GLUT1和GLUT3基因mRNA的表達量極顯著上升(P<0.01)，但卵巢組織中葡萄糖含量沒有顯著差異。

圖4 GnIH對卵巢GLUT1(A)、GLUT3(B)表達量和葡萄糖(C)含量的影響

2.2.2 GnIH對瑤雞卵巢組織葡萄糖酵解的影響

由圖5可知，腹腔注射GnIH后可使卵巢中糖酵解關鍵限速酶PK和PFK基因mRNA的表達量顯著上升(P<0.05)，卵巢組織中LDHA基因mRNA的表達量顯著升高(P<0.05)，而LDHB基因mRNA的表達量顯著下降(P<0.05)。

圖5 GnIH對糖酵解相關基因mRNA表達量的影響

2.2.3 GnIH對瑤雞卵巢組織線粒體能量代謝的影響

由圖6可知，腹腔注射GnIH后，瑤雞卵巢組織中線粒體能量代謝的底物丙酮酸含量顯著上升(P<0.05)，而線粒體能量代謝和TCA循環(huán)中關鍵酶SDHB的表達量顯著下降(P<0.05)。

圖6 GnIH對瑤雞卵巢組織線粒體能量代謝的影響

3 討論

近年研究證明，GnIH可以影響機體的采食并可能參與能量代謝[13-14]。Tachibana等[10]首次報道了GnIH作為一種新的促食欲肽，能促進雞的采食。McConn等[15]通過腦室內注射(ICV)給藥也觀察到GnIH可增加不同品系雞食物攝入的結果。先前研究證明慢性腹腔注射GnIH會導致小鼠發(fā)生胰島素抵抗，采食量增加，進而引起小鼠糖代謝紊亂[16 ]。以上研究與本試驗的結果一致，腹腔注射GnIH可導致瑤雞的采食量增加，猜測食物攝入異常能夠引起能量代謝的紊亂。糖代謝的改變對卵巢的發(fā)育產生有害影響[17]。GnIH與母雞的卵巢退化有關[18-19]，本研究發(fā)現腹腔注射GnIH會導致瑤雞卵巢臟器指數顯著降低，證實了該結論。

卵巢發(fā)育所需的能量主要來源于TCA循環(huán)[20]。丙酮酸含量升高，表明卵巢顆粒細胞的代謝模式發(fā)生了變化[21]。本研究發(fā)現，腹腔注射GnIH會導致丙酮酸含量升高，TCA循環(huán)關鍵酶(SDHB)的表達量顯著下降。Mao等[22]在線粒體功能損傷的卵巢顆粒細胞中發(fā)現葡萄糖消耗明顯增高，糖酵解活性增強。糖酵解和氧化磷酸化是細胞葡萄糖代謝的主要途徑和主要的能量來源。然而，在卵母細胞中，葡萄糖轉運蛋白和磷酸果糖激酶的表達水平極低，表明卵母細胞很少直接消耗葡萄糖作為代謝底物[23]。本研究結果表明，腹腔注射GnIH可導致卵巢內葡萄糖轉運蛋白GLUT1、GLUT3和糖酵解相關酶PK、PFK、LDHA、LDHB的表達增加，提示腹腔注射GnIH可引起TCA循環(huán)異常并增加卵巢糖酵解的活性。

4 結論

本研究探討了腹腔注射GnIH對瑤雞采食和卵巢糖代謝的影響，結果提示腹腔注射GnIH可增加瑤雞的采食量，導致瑤雞卵巢葡萄糖轉運的加快，促進糖酵解的發(fā)生，TCA循環(huán)異常和丙酮酸的積累，引起卵巢糖代謝紊亂，進而導致卵巢發(fā)育異常。