王統(tǒng)華, 覃月秋, 黃美英, 易廷莊, 胡高裕

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科, 廣西 百色 533000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一種常見的臨床疾病,起病急、進(jìn)展快、進(jìn)程中容易出現(xiàn)多種并發(fā)癥且死亡率高,重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)還可能引起除胰腺外全身系統(tǒng)炎癥反應(yīng),甚至可能導(dǎo)致器官衰竭,預(yù)后危險(xiǎn)[1]。近年來,AP的死亡率也逐漸增多,各種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子以及激素等因素在SAP的發(fā)生發(fā)展中都有參與。Ghrelin是生長激素促分泌素受體 (growth hotmonese cretagogue receptor,GHS-R)的內(nèi)源性配體,是最近發(fā)現(xiàn)的具有多種生物功能的含28個(gè)氨基酸的小分子腸道肽,當(dāng)Ghrelin與其GHS-R結(jié)合后,具有刺激垂體前葉釋放生長激素,增加食欲,調(diào)節(jié)能量代謝平衡以及促進(jìn)胃酸分泌等生物學(xué)功能,但其作用機(jī)理目前尚不清楚[2-4],有研究表明Ghrelin可能參與AP的發(fā)生發(fā)展過程[5-6]。 此外,血清淀粉酶、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-a,TNF-α)和核因子(nuclear factor κB,NF-κB)也可能參與在AP的病程中[7-8]。在本研究中,通過注射?；悄懰徕c復(fù)制AP動(dòng)物模型,同時(shí)建立GHS-R拮抗組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,觀察模型大鼠的血清蛋白、Ghrelin的表達(dá)水平以及其與反映AP嚴(yán)重程度的參數(shù)、炎癥因子和氧化應(yīng)激的關(guān)系,并測(cè)量了IL-6和TNF-α的表達(dá)水平,報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇48只10～12周齡健康大鼠(SPF級(jí)),體質(zhì)量200～235 g,由右江民族醫(yī)學(xué)院提供。

1.1.2試劑及儀器 5%的牛磺膽酸鈉(Simga公司),10%水合氯醛,Ghrelin(上海博宏生物科技有限公司);微量注射器、電泳槽、全自動(dòng)酶標(biāo)儀Multiskan MK3(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司),RT-PCR儀(Bio-Rad公司),JEM-2100F掃描透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社),凝膠成像系統(tǒng)(英國基因技術(shù)有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1動(dòng)物分組與造模 隨機(jī)將48只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組及拮抗組,每組12只。實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物在同一環(huán)境、晝夜交替喂養(yǎng)7 d,術(shù)前常規(guī)禁食12 h,10%水合氯醛按照0.3 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉。模型組大鼠選擇大鼠腹部沒有血管的區(qū)域?qū)σ饶懝苓M(jìn)行穿刺,按逆行方向注射5%的?；悄懰徕c誘發(fā)大鼠SAP[9]。對(duì)照組大鼠處理方式與模型組一致,但不注射?；悄懰徕c。治療組大鼠:于制模后1 h給予腹腔注射Ghrelin。拮抗組:在制模前30 min給予腹腔注射生長激素釋放肽(Growth hormone releasing peptide,GHRP-6),制模后1 h再腹腔注射Ghrelin。如果過程中出現(xiàn)大鼠因胰腺炎程度過重而未能存活的情況,應(yīng)重新選擇大鼠進(jìn)行SAP造模補(bǔ)充。

1.2.2樣本提取 (1)各組大鼠均在麻醉后2 h心臟取血,留樣標(biāo)注;(2)心臟取血后處死大鼠,收集胰腺組織,稱重并計(jì)算胰腺質(zhì)量指數(shù);部分組織經(jīng)PBS洗滌后,用4%多聚甲醛固定,其余組織被儲(chǔ)存在液氮用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)量。

1.2.3血清淀粉酶、IL-6、TNF-α、NF-κB檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法測(cè)定各組大鼠血清淀粉酶、IL-6、TNF-α、NF-κB的表達(dá)水平。

1.2.4胰腺IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA表達(dá)水平 采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法測(cè)定,從各組大鼠的胰腺組織中提取mRNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,采用SYBR Advantage Real-timePCR Premix 試劑盒進(jìn)行熒光定量反應(yīng),檢測(cè)各組大鼠胰腺IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA表達(dá)水平。

1.2.5胰腺組織病理檢查及病理評(píng)分 將上述經(jīng)PBS洗滌后固定在4%多聚甲醛的胰腺組織取出切片、脫水、染色、沖洗封片之后,在光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織病理學(xué)形態(tài),并根據(jù)胰腺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胰腺質(zhì)量指數(shù)

與對(duì)照組相比,模型組胰腺質(zhì)量指數(shù)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明大鼠AP時(shí)胰腺明顯腫大;與模型組相比,治療組胰腺質(zhì)量指數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明Ghrelin可以改善胰腺炎大鼠的胰腺腫大;與治療組相比,拮抗組胰腺質(zhì)量指數(shù)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明GSH-R拮抗可影響Ghrelin對(duì)胰腺炎大鼠的治療效果。見圖1。

注：(1)與對(duì)照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與治療組比較,P<0.05。

2.2 血清淀粉酶、IL-6、TNF-α及NF-κB表達(dá)

檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示,與對(duì)照組相比,模型組的大鼠血清淀粉酶、IL-6、TNF-α及NF-κB表達(dá)水平均有明顯升高(P<0.01);與模型組相比,治療組血清淀粉酶、IL-6、TNF-α及NF-κB表達(dá)水平明顯降低(P<0.01);與治療組相比,拮抗組血清淀粉酶、IL-6、TNF-α、NF-κB表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。

2.3 胰腺組織IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA表達(dá)

4組胰腺組織IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示(圖3),與對(duì)照組相比,模型組的IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表達(dá)量有明顯升高(P<0.01);與模型組比較,治療組IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表達(dá)量都明顯降低(P<0.01);與治療組比較,拮抗組IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表達(dá)量有明顯升高(P<0.01)。

注：(1)與對(duì)照組比較,P<0.01;(2)與模型組比較,P<0.01;(3)與治療組比較,P<0.01。

2.4 胰腺組織病理變化及病理評(píng)分

由圖4可見,對(duì)照組大鼠的胰腺可見胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,血管紋理清晰,無水腫壞死;模型組大鼠的胰腺間質(zhì)浸潤,出現(xiàn)組織壞死及多處出血灶;治療組胰腺間質(zhì)水腫,炎癥細(xì)胞浸潤,胰腺輕度炎癥;拮抗組胰腺組織出現(xiàn)出血灶,壞死水腫。評(píng)分見表1。

表1 各組大鼠胰腺組織病理評(píng)分結(jié)果

注：A:對(duì)照組;B:模型組;C:治療組;D拮抗組

3 討論

SAP是一種病情嚴(yán)重的急性炎癥性疾病,目前占所有胰腺炎病例的2%[10]。許多關(guān)于SAP的研究發(fā)現(xiàn),體內(nèi)的各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與了SAP的發(fā)展,并且是一個(gè)持續(xù)的發(fā)展過程。目前已知的與胰腺炎有關(guān)的炎癥因子有血清淀粉酶、IL-6和TNF-α等[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道,Ghrelin可以抑制炎癥反應(yīng)期間的炎癥反應(yīng)因子的釋放[12]。在一項(xiàng)關(guān)于AP的臨床研究中,Dembinski等[13]分別用雨蛙素及脂多糖誘導(dǎo)急性水腫性胰腺炎(AEP)和急性壞死性胰腺炎(ANP),發(fā)現(xiàn)在AP發(fā)病24 h后血清Ghrelin水平開始上升,ANP組的Ghrelin水平高于AEP組,提示Ghrelin可以作為判斷AP嚴(yán)重程度的標(biāo)志物之一。

淀粉酶水平是診斷急性胰腺炎最常用的生化標(biāo)志物[14],而IL-6和TNF-α是診斷和預(yù)后SAP的重要標(biāo)志物。TNF-α與各種炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[15]。當(dāng)體內(nèi)TNF-α水平升高時(shí),可刺激炎癥細(xì)胞產(chǎn)生各種組織損傷因子,從而促使胰腺炎的發(fā)生,也成為診斷胰腺炎的重要標(biāo)志物之一。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠SAP模型的成功制備以及內(nèi)源性Ghrelin對(duì)SAP治療的影響,表現(xiàn)為血清淀粉酶水平的明顯增加和TNF-α水平的變化。

IL-6是一種細(xì)胞因子,在全身性炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,在AP進(jìn)程中,體內(nèi)IL-6水平明顯增高,而過多的IL-6存在會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的抗體,引起細(xì)胞有害毒效應(yīng),高水平IL-6可以和TNF-α協(xié)同作用,產(chǎn)生微循環(huán)血凝塊,損害身體,導(dǎo)致全身多器官損害反應(yīng)[16-17]。因此,IL-6水平的升高與SAP的嚴(yán)重程度密切相關(guān),IL-6已成為研究SAP疾病進(jìn)展的一個(gè)重要標(biāo)志物。本研究再次證實(shí)了SAP造模成功以及內(nèi)源性Ghrelin在治療SAP方面的功效。

NF-κB是AP發(fā)展的一個(gè)重要標(biāo)志物,是許多炎癥因子(如TNF-α)的啟動(dòng)劑[18],抑制NF-κB可能有效地減緩SAP的進(jìn)展。本研究表明,與對(duì)照組比較,模型組的NF-κB明顯升高,在治療組被Ghrelin抑制,其表達(dá)也有所下降;與治療組比,拮抗組NF-κB表達(dá)有增高,表明GSH-R抑制了Ghrelin因子的表達(dá),導(dǎo)制其無法發(fā)揮抗炎作用。NF-κB的表達(dá)水平和內(nèi)源性Ghrelin對(duì)SAP治療的影響,證實(shí)了SAP模型制備的成功以及Ghrelin在治療SAP方面的作用。

綜上所述,本研究采用5%?；悄懰徕c成功制備大鼠SAP模型,發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性Ghrelin對(duì)模型大鼠的胰腺功能有明顯的改善,在Ghrelin治療下,炎癥因子IL-6、TNF-α、NF-κB的表達(dá)水平明顯得到抑制,降低了炎癥因子mRNA的表達(dá),從而降低炎癥對(duì)機(jī)體的損害,達(dá)到對(duì)大鼠胰腺的保護(hù)作用,為今后Ghrelin對(duì)SAP的治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。