金育, 羅佳, 何春艷, 羅忠瑞, 張玉芳, 劉野

(中國醫(yī)學科學院 & 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所, 云南 昆明 650118)

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物和細胞來源 6～8周齡C57BL/6雌性小鼠30只,體質(zhì)量18～22 g,購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所,無特定病原體(specific pathogen free,SPF)條件下飼養(yǎng),定期更換墊料、添加食物與飲用水,所有動物實驗均經(jīng)中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所動物倫理委員會批準(DWSP202203032);小鼠黑色素瘤細胞B16F10-OVA來自國家納米科學中心。

1.1.2主要試劑和儀器 Liposome Kit(美國Sigma-Aldrich公司),Zombie NIRIM Fixable Viability Kit和流式染色抗體(美國Biolegend公司),Cytofix/Cytoperm固定破膜試劑(美國BectonDickinson公司),腫瘤疫苗多肽(氨基酸序列為SMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTS;合肥國肽生物有限公司),磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、改良Eagle(Dulbecco's modified Eagle medium,DMEM)高糖培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS;美國Gibco公司);細胞計數(shù)板(江蘇求精新材料集團),70 μm細胞濾網(wǎng)(中國Biosharp公司),水平離心機和流式細胞儀(美國Beckman公司),CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司),T75培養(yǎng)瓶(無錫耐思生物科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1黑色素瘤細胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤B16F10-OVA細胞于含有10% FBS,105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每2～3 d傳代1次。

1.2.2小鼠造模、分組及免疫 取“1.2.1”項下對數(shù)生長期細胞制作成2×1010個/L細胞懸液,接種于小鼠右側(cè)前肢皮下,200 μL /只,30 min內(nèi)接種完畢,7 d后觀察腫瘤形成情況,以確定造模成功。取造模成功小鼠隨機均分為空白(Blank)組(生理鹽水100 μL)、LNP+抗原組(腫瘤疫苗多肽50 μg和LNP 10 μg 混合配成終體積為100 μL的混合液,現(xiàn)配現(xiàn)用)、LNP+R848組(LNP 10 μg和R848 3.18 μg混合配成終體積為100 μL的混合液,現(xiàn)配現(xiàn)用)、R848+抗原組(腫瘤疫苗多肽50 μg和R848 3.18 μg混合配成終體積為100 μL的混合液,現(xiàn)配現(xiàn)用)及LNP+R848+抗原組(腫瘤疫苗多肽50 μg、LNP 10 μg及R848 3.18 μg混合配成終體積為100 μL的混合液,現(xiàn)配現(xiàn)用),2次免疫,間隔7 d。

1.2.3瘤體測量 “1.2.2”項下各組小鼠免疫處理期間每隔1 d測量腫瘤的長徑(length,L)、短徑(width,W),并依此計算腫瘤體積[volume,V;V=(L×W2)/2]。

1.2.4腫瘤細胞的制備 “1.2.2”項下各組小鼠第2次免疫后第7天麻醉處死,取出瘤體,于生物安全柜中用滅菌剪刀剪碎,置于70 μm細胞濾網(wǎng)研磨、過濾,收集細胞懸液至離心管;每管加紅細胞裂解液5 mL,輕輕震蕩混勻,裂解時間不超過5 min,加 PBS 5 mL終止裂解,混勻離心;加PercollTM分離液離心分離細胞,4 ℃、1 800 r/min離心30 min,吸出表面黑色液體,加DMEM高糖培養(yǎng)基10 mL重懸洗滌細胞,4 ℃、1 800 r/min離心10 min,棄上清,收集細胞計數(shù)備用。

1.2.5腫瘤CD8陽性T淋巴細胞(CD8+T)和CD4+T細胞的檢測 取“1.2.4”項下細胞1×109個/L到96孔板,加5 mg/L腫瘤疫苗多肽刺激6 h進行染色分析;使用Zombie NIRTM染色(0.1 μL /孔),室溫避光孵育15 min,以評估細胞的生存能力;2% FBS/PBS洗滌,加CD45-Brilliant Violet 605、CD3-Brilliant Violet 510、CD4-Fluoresceine Isothiocyanate、CD8-Alexa Fluor 700及CD107a-Phycoerythrin流式染色抗體,4 ℃避光孵育30 min,2% FBS/PBS洗滌細胞;加固定破膜液,4 ℃避光孵育30 min,用Permeabilization Wash buffer洗2次;加干擾素γ(interferon γ,IFN-γ )-Allophycocyanin抗體、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)-Preactivated PerCP-Cy5.5 Maleimide抗體,4 ℃避光孵育30 min,用Permeabilization Wash buffer洗滌細胞,重懸細胞轉(zhuǎn)移至流式管后上機進行檢測;使用FlowJo軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 9軟件進行統(tǒng)計分析,3組及以上比較采用單因素方差分析,2組間比較用t檢驗來檢測顯著性;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長情況

免疫期間,各組小鼠腫瘤生長結(jié)果顯示(圖1),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤生長較慢,且免疫后第12天 ,腫瘤體積分別小于Blank組、LNP+抗原組、LNP+ R848組及R848+抗原組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注： (1)與同時點Blank組比較,P<0.05;(2)與同時點LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與同時點LNP+R848組比較,P<0.05;(4)與同時點抗原+R848比較,P<0.05。

2.2 CD4+T細胞分泌CD107a的水平

流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示(圖2),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD4+T細胞分泌的CD107a分別高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明該組小鼠T細胞活化程度增高。

注：A為流式細胞儀檢測結(jié)果,B為定量結(jié)果; (1)與Blank組比較,P<0.05;(2)與LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與LNP+ R848組比較,P<0.05;(4)與抗原+R848組比較,P<0.05。

2.3 CD8+T細胞分泌CD107a的水平

流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示(圖3),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD8+T細胞分泌的CD107a高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明該組小鼠腫瘤組織中T細胞活化程度增高。

注：A為流式細胞儀檢測結(jié)果,B為定量結(jié)果;(1)與Blank組比較,P<0.05;(2)與LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與LNP+ R848組比較,P<0.05;(4)與抗原+R848組比較,P<0.05。

2.4 CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌IFN-γ的水平

流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示(圖4和圖5),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌IFN-γ的水平高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明該組小鼠的T細胞在受到疫苗刺激后可產(chǎn)生更高水平的抗原特異性免疫保護。

注：A、B、C、D及E為流式細胞儀檢測結(jié)果,F為流式細胞儀定量結(jié)果; (1)與同時點Blank組比較,P<0.05;(2)與同時點LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與同時點LNP+R848組比較,P<0.05;(4)與同時點抗原+R848比較,P<0.05。

注：A、B、C、D及E為流式細胞儀檢測結(jié)果,F為流式細胞儀定量結(jié)果; (1)與同時點Blank組比較,P<0.05;(2)與同時點LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與同時點LNP+ R848組比較,P<0.05;(4)與同時點抗原+R848組比較,P<0.05。

2.5 CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌TNF-α的水平

流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示(圖6和圖7),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌TNF-α的水平高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明LNP對R848和抗原的共遞送可以刺激T淋巴細胞產(chǎn)生更高水平的抗原特異性的細胞免疫效應。

3 討論

腫瘤疫苗利用腫瘤特異性抗原觸發(fā)T細胞介導抗腫瘤免疫反應。腫瘤疫苗靶向腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原,通過活化CD8+T細胞達到初步激活主動免疫殺傷癌細胞的作用。而后裂解的癌細胞又會釋放不同種類的腫瘤抗原經(jīng)抗原提呈細胞[例如:樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)]提呈給T細胞,進而引發(fā)更為廣泛的抗腫瘤應答[15]。腫瘤疫苗的類型可以分為:肽段疫苗、樹突細胞疫苗、核酸疫苗[信使RNA(message RNA,mRNA)或者DNA疫苗]、病毒疫苗以及原位腫瘤疫苗[16]。目前抗腫瘤疫苗的研發(fā)面臨著以下幾個難點:疫苗分子的選擇、遞送系統(tǒng)的選擇、腫瘤微環(huán)境的改善等[17]。在提高疫苗有效性方面,一種已經(jīng)開始使用的方法是將腫瘤疫苗與一些免疫刺激劑共用,來提高疫苗的有效性。另一方面,疫苗的遞送系統(tǒng)在腫瘤疫苗系統(tǒng)中有著重要的作用,需要對人體傷害小,更容易降解的載體材料。除此之外,有些疫苗本身穩(wěn)定性差,需要遞送系統(tǒng)能夠更穩(wěn)定的裝載,讓抗原能夠長期耐高溫的儲存,在體內(nèi)時抗原能夠長期表達,更好地刺激免疫細胞[18]。

本研究利用黑色素瘤特異性抗原多肽制備多肽腫瘤疫苗,以R848作為佐劑,增強其免疫原性,并選擇LNP作為遞送載體,探索設(shè)計的腫瘤疫苗在黑色素瘤小鼠模型上的免疫效果。

在自然殺傷(natural killer, NK)細胞和細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell, CTL)中,CD107a是溶細胞顆粒中最豐富的蛋白質(zhì)之一,它位于囊泡膜的內(nèi)側(cè),介導蛋白經(jīng)溶酶體途徑的分選[19]。CD107a可以用來評價NK細胞或者T細胞活性的原因就是:一旦顆粒到達NK/T細胞的漿膜面,顆粒膜與細胞膜發(fā)生融合,CD107a隨即暴露在細胞膜表面,這被認為是一種保護效應細胞(NK/T細胞)免受脫顆粒相關(guān)的自殺機制[20-22]。目前研究表明,CD107a分子的膜表達可以直接反映NK細胞或者CTL的脫顆粒過程,從而反映其殺傷功能。IFN-γ是抗腫瘤免疫相關(guān)的關(guān)鍵細胞因子,通過誘導凋亡、或者非凋亡細胞死亡來殺傷腫瘤細胞;還可通過巨噬細胞活化、上調(diào)抗原處理及呈遞分子的表達等方式發(fā)揮抗腫瘤的作用[23-24]。TNF-α是一種主要由活化的巨噬細胞、T淋巴細胞分泌的多功能性細胞因子,參與機體炎癥反應和免疫調(diào)控,在自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不可忽視的作用[25-26]。本研究以LNP為載體,引入TLR7/8的激動劑R848,構(gòu)建了具有高免疫原性的LNP-R848佐劑共遞送系統(tǒng),并在小鼠黑色素瘤模型上進行驗證,利用流式細胞術(shù)檢測腫瘤組織細胞中CD4+T細胞及CD8+T細胞分泌CD107a、IFN-γ和TNF-α的水平,結(jié)果表明,LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤細胞中CD4+T細胞及CD8+T細胞分泌CD107a、IFN-γ和TNF-α的水平高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,說明該疫苗能通過增強T細胞反應抑制腫瘤生長。本研究結(jié)果表明,佐劑共遞送是增強腫瘤疫苗免疫效果的有效策略。

綜上所述,本研究開發(fā)了一種腫瘤疫苗的設(shè)計策略,利用LNP遞送腫瘤抗原和免疫佐劑R848,能有效增強T細胞免疫反應,顯著抑制小鼠黑色素瘤的生長,在增強腫瘤疫苗性能方面具有很大的潛力。