辛晨, 況春燕*, 劉興德

(1.貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院 心內科, 貴州 貴陽 550003; 2.貴州省人民醫(yī)院 心內科, 貴州 貴陽 550003; 3.貴州中醫(yī)藥大學 心內科, 貴州 貴陽 550003)

在研究T細胞譜系的小鼠過程時Schwarz首次發(fā)現(xiàn)Schlafen(Slfn)基因家族,該基因家族僅存在于哺乳動物中[1];也有研究認為 Slfn基因在細胞增殖、分化和凋亡等方面具有重要的作用[2-3]。Slfn家族成員在哺乳動物中廣泛地表達,但是該家族基因成員在小鼠中的組成部分與人類中的組成部分有所不同[4],小鼠Slfn家族基因的成員有Slfn1、Slfn1L、Slfn2、Slfn3、Slfn4、Slfn5、Slfn8、Slfn9、Slfn10及Slfn14共10個,而組成人類Slfn家族基因的成員只有Slfn5、Slfn11、Slfn12、Slfn13及Slfn14共5個,其中Slfn5和Slfn14是人類和小鼠中共存的Slfn家族基因[5-6]。Slfn家族成員根據(jù)其基因/蛋白質大小、序列的同源性以及結構域有所不同,又被劃分為3個亞組[7],目前科研人員對Slfn家族基因的分子功能知之甚少。已有研究顯示,Slfn1在大鼠內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)中表達,可調節(jié)EPCs的生物學行為,且Slfn1在體外是EPCs增殖和管形成的強大負性調節(jié)因子[8-9],然而Slfn3是否能夠像同家族成員Slfn1一樣,對心血管系統(tǒng)起到調控作用、并對EPCs的增殖及遷移產生影響到目前為止尚未見報道。因此,為了后續(xù)更加深入地探討Slfn3基因對EPCs多種生物學行為的影響,本研究構建了小鼠短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)-Slfn3重組腺病毒以供體外感染小鼠脾源EPCs,檢測其在EPCs中的轉染效果,現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物、細胞及載體 4～8周齡雄性C57小鼠(重慶貝萊康生物);人胚胎腎細胞HEK293和pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP載體(上海和元生物),大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(日本Takara)。

1.1.2主要試劑和儀器 胎牛血清、改良Eagle(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)基(美國Gibco),高保真 Prime STAR酶、TaqDNA聚合酶及T4 DNA連接酶(日本Takara),胰蛋白酶(美國Hyclone),質粒DNA小量抽提試劑盒和質粒純化試劑盒(美國Axygen),限制性內切酶AgeⅠ和EcoRⅠ(華大基因),電熱恒溫水槽(上海一恒),PCR儀(美國Applied Biosystems),移液器(德國Eppendorf),DNA電泳槽(上海天能科技),凝膠成像分析儀(培清科技),超微量分光光度計(北京凱奧科技),冷凍高速離心機(美國Thermo Fisher)。

1.2 研究方法

1.2.1干擾載體的構建 利用GenBank基因軟件獲得了Slfn3基因(NM_011409.1)序列及其上游和下游的序列,并根據(jù)其序列設計合成3個小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)靶點及1條無義的陰性對照(negative control,NC),siRNA-Slfn3(1)為CTCAATCTCAGATGAAGTGAA,siRNA-Slfn3(2)為AGCAGAATCCAGACCAAGTTC,siRNA-Slfn3(3)為ATCCAGGACAGATCCCGAAGA,NC為CCCGGACTGTAAACTACAGAT;人工合成上述4對引物(表1)[10-11]。利用限制性內切酶AgeⅠ和 EcoRⅠ對載體pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP進行雙酶切,使其線性化后,將目的基因Slfn3與其連接,連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,置于含卡那霉素抗性的細菌基礎培養(yǎng)液培養(yǎng),于37 ℃、5%CO2條件下孵育過夜,PCR鑒定挑選出陽性克隆,并對陽性克隆進行DNA測序驗證[10,12];經DNA測序驗證正確的質粒依次命名為shRNA-Slfn3(1)、shRNA-Slfn3(2)、shRNA-Slfn3(3)及shRNA-Slfn3(NC),并提取質粒。測序正向引物序列為CCGGCTCAATCTCAGATGAAGTGAACTCGAGTTCACTTCATCTGAGATTGAGTTTTTTG,位于人U6啟動子序列中;反向引物序列為AATTCAAAAACTCAATCTCAGATGAAGTGAACTCGAGTTCACTTCATCTGAGATTGAG,位于CMV啟動子的5序列。

表1 構建的病毒載體框架序列

1.2.2腺病毒的包裝、擴增和滴度測定 取HEK293細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng);運用Admax系統(tǒng),將先前所得的3個穿梭質粒分別轉染到HEK293細胞中,得重組腺病毒shRNA-Slfn3;HEK293細胞種植于6孔板之中,等到其生長至密度為70%～80%的時候,去除原培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗2次,加Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5×10-3/L,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h;骨架質粒和穿梭質粒按1∶1均勻混合制備得病毒載體質粒,取病毒載體質粒4 μg 按2.5×10-4/L加入含Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中,混合均勻,再加腺病毒包裝轉染試劑室溫放置20 min,待轉染復合體狀態(tài)穩(wěn)定后在先前培養(yǎng)HEK293細胞的6孔板之內加入上述所得的轉染復合體,37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h,吸取原有的舊培養(yǎng)基,再加2×10-3/L新鮮培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每隔3 d換液1次,出現(xiàn)病毒空斑則停止換液處理,待所有細胞完全發(fā)生病變后采集上清液[12-13]。將HEK293細胞直接接種于規(guī)格為10 cm×10 cm×2 cm的培養(yǎng)皿中,待細胞生長密度達到90%以上,加合適度的病毒感染細胞;待細胞全部病變后,收取病毒并分裝[10,14]。將生長狀態(tài)良好的HEK293細胞接種于24孔板,每孔種植的細胞數(shù)量為5.0×105個,放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng);等細胞的生長密度達到90%以上,分別將病毒液按照10-5～10-8的濃度梯度進行稀釋,按1×10-4/L依次加入接種有HEK293細胞的24孔板中,待病毒感染細胞48 h;運用光學顯微鏡進行觀察,每個培養(yǎng)孔中隨機選擇5個觀察視野,統(tǒng)計陽性細胞的數(shù)目,并計算每個培養(yǎng)孔內陽性細胞的平均數(shù)目及病毒的滴度[12-13]。

1.2.3小鼠EPCs的培養(yǎng) 斷頸法處死C57小鼠,取其脾臟剪碎研磨,用PBS沖洗過濾獲得細胞懸液。將淋巴細胞分離液與細胞懸液以1∶4的比例(切勿混勻)加入離心管,放入水平離心機,4 ℃條件下2 000 r/min離心20 min。離心后的液體被分為4層,其中單個核細胞位于第2層、呈薄薄的白膜層,將其吸出放入離心管,1 500 r/min離心10 min;棄上清,加PBS洗滌3次,培養(yǎng)于含20%胎牛血清及青霉素-鏈霉素雙抗溶液的低葡萄糖L-DMEM培養(yǎng)基中,每隔48 h換液1次,待細胞生長密度達70%時進行轉染。

1.2.4shRNA-Slfn3轉染EPCs 取生長密度達到70%的EPCs,加shRNA-Slfn3進行病毒轉染EPCs 至48 h,應用熒光顯微鏡檢測視野內的染上EGFP的細胞(綠色熒光細胞),計算細胞轉染效率(轉染效率=視野內可見的綠色熒光細胞數(shù)量/總細胞數(shù)量×100%)。

2 結果

2.1 目的穿梭質粒的鑒定

利用測序軟件對4組序列進行DNA測序分析驗證。結果顯示,3組shRNA-Slfn3以及1組對照序列內均含有設計的目的序列(圖1),表明目的穿梭質粒構建成功。

2.2 重組腺病毒的包裝

將DNA測序無誤的shRNA-Slfn3與輔助質粒一同轉染到HEK293細胞,轉染后13 d左右即可在光學顯微鏡下觀察到細胞大量漂浮,且細胞呈現(xiàn)綠色熒光,最后收集細胞得重組腺病毒。見圖2。

注：綠色熒光表示轉染上shRNA-slfn3質粒的細胞。

2.3 重組腺病毒的擴增

將收集得到的病毒再次用于感染HEK293細胞進行病毒擴增,可以在熒光顯微鏡下觀察到大量EGFP的表達(圖3)。

2.4 重組病毒的滴度

重組病毒滴度的結果顯示,shRNA-Slfn3(1)、shRNA-Slfn3(2)及shRNA-Slfn3(3)的病毒滴度分別為2.37×1013pfu/L、3.16×1013pfu/L及4.74×1013pfu/L。

2.5 shRNA-Slfn3 轉染EPCs

用shRNA-Slfn3轉染EPCs 48h,熒光顯微鏡下觀察到細胞中有強綠色熒光效應,則為成功地轉染上shRNA-Slfn3的EPCs,轉染效率為(67.64±2.58)%。見圖4。

圖4 EPCs轉染shRNA-Slfn3 48 h后熒光的表達(100×)

3 討論

本研究構建了小鼠shRNA-Slfn3的重組腺病毒質粒,并且進行了腺病毒的包裝,為Slfn3基因后續(xù)研究奠定了基礎;成功地從小鼠脾臟提取到EPCs,在體外培養(yǎng),并用構建的小鼠shRNA-Slfn3重組腺病毒質粒成功轉染到EPCs中,為后續(xù)Slfn3基因和EPCs的相關研究提供了可靠的保障。

多年來,許多研究者對大多數(shù)Slfn家族基因的功能進行了深入研究,盡管Slfn家族不同基因和蛋白質的確切功能還尚待確定,但是有最新的研究證據(jù)表明,該家族的多個成員參與了發(fā)育、免疫反應和細胞的增殖[15]。在胸腺細胞的成熟過程和T細胞的發(fā)育過程之中,Slfn家族成員的表達呈顯著上調,與之相反的是其在胸腺瘤細胞和成纖維細胞中的表達則為抑制細胞的增殖[16]。Slfn3基因隸屬于Slfn家族的第二亞群,蛋白分子的大小介于58～68 kDa,其蛋白結構中包含有一個“SLFN盒”,與一個不同的AAA結構域相鄰,還有一個此亞群特有但功能未知的高度保守的“Ser-Trp-Ala-Asp-Leu(SWADL)”結構域[17]。最新研究已經確定Slfn3基因是外圍CD4+CD25+T細胞中過度表達的基因,可以在T細胞分化和激活中發(fā)揮作用,并可能成為T細胞激活的新標志物。在T細胞激活和增殖的時候,Slfn3基因的mRNA在CD4+CD25+Tregs中呈現(xiàn)出下調的趨勢,與此不同的是,其在CD4+CD25-Teffs中受到明顯上調。而且TGF-β能夠抑制Slfn3基因在抗CD3/CD28激活的CD4+T細胞中的表達[18]。此外,Slfn3基因已經被證實是細胞增殖的負性調節(jié)劑,其能夠在體內和體外介導嚙齒動物腸細胞的分化,并且Slfn3基因的表達可以明顯抑制富含癌干細胞、抗FOLFOX的結腸癌細胞的多種特征,它的表達可能會使結腸癌更容易受到癌癥化療的影響[19]。在更進一步的研究中還發(fā)現(xiàn),Slfn3基因在 EPCs 中也有明顯的表達,先前有研究證實另一Slfn家族成員Slfn1被證實在大鼠EPCs中表達并且調節(jié)EPCs的生物學行為,由此可以推測Slfn3也在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用,極有可能參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程。然而,目前Slfn3基因在這方面的研究少之又少,這極大地限制了其臨床應用。

科研人員經常通過操縱某個基因的表達來研究這個基因的功能,降低目的基因的表達或者完全敲除目的基因是最常用的兩種方法[20]。其中敲減基因的方法多種多樣,比如siRNA、shRNA及CRISPR-CasRx等。本研究采用的是shRNA敲低技術,shRNA是一種類似于發(fā)卡狀的短頸環(huán)結構,通常是借助質粒病毒等載體導入細胞內,需要經細胞內的酶進行切割,才能轉變成siRNA而發(fā)揮作用[21];shRNA被連接在病毒載體上,以DNA的形式導入細胞,在細胞核內,被轉錄為pri-miRNA,細胞內的Drosha酶修剪pri-miRNA的兩端序列,使其變成一種具有頸環(huán)結構的小RNA(microRNA, miRNA),即shRNA的前體pre-shRNA;接下來pre-shRNA從細胞核內游走到細胞質,在細胞質內形成了成熟的shRNA;在細胞質內的Dicer酶作用下,shRNA的環(huán)狀結構被切掉,只剩下核心的siRNA序列;siRNA可以降解mRNA,干擾翻譯過程,從而降低蛋白質的表達水平。與siRNA的瞬態(tài)效果相比,shRNA雖然發(fā)揮作用的過程更加復雜,但是其可以通過病毒載體整合到基因組內,更加穩(wěn)定地表達,并且能夠長久持續(xù)地發(fā)揮作用[22]。基因敲減技術在這些年不斷地取得進步和創(chuàng)新,已經從最開始最基本的將目的基因完全敲除,發(fā)展到現(xiàn)在可以在特定的組織、特定的時間敲除目的基因,在特異性得到了提高的同時,基因敲除的效率也得到了顯著的提高。基因敲減技術在基因組學中的廣泛應用,極大地推動了全球醫(yī)學領域研究的不斷發(fā)展和進步。

本研究選用Slfn3作為目的基因片段,pADV-U6-shRNA- CMV-EGFP作為干擾載體,Slfn3基因片段被成功地插入到重組腺病毒載體中,構建了shRNA-Slfn3重組腺病毒;并對小鼠脾源EPCs進行了體外培養(yǎng),用該重組腺病毒能夠成功感染EPCs,轉染效率為(63.64±2.58)%,為更進一步研究利用腺病毒敲低Slfn3基因表達在EPCs生物學功能中的作用打下了基礎。