霍云飛, 高明慧, 豆雙雙, 寇卜心, 柴夢音, 劉曉霓, 石 英

RelA(p65)是核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)家族的一員。NF-κB通路包括典型的NF-κB通路和非典型的NF-κB通路,其中RelA作為重要的轉(zhuǎn)錄因子參與典型的NF-κB通路[1-2]。在穩(wěn)定狀態(tài)下,RelA被NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,I-κB)抑制,隔離在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)?shù)湫偷腘F-κB通路被激活后,I-κB被磷酸化,失去了抑制RelA的能力,RelA進(jìn)入細(xì)胞核中參與下游基因的轉(zhuǎn)錄,以響應(yīng)炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化等多種外部刺激[1,3-5]。此外,也有研究表明RelA參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,特別是在肝癌中發(fā)揮重要作用。Xu等[6]發(fā)現(xiàn)當(dāng)肝臟發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)后,肝細(xì)胞RelA表達(dá)上調(diào),并激活RelA的Ser536磷酸化位點(diǎn),繼而激活下游絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threonine protein kinase,Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路,促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究也發(fā)現(xiàn),RelA的磷酸化促進(jìn)了小鼠肝癌的發(fā)生[7]。因此,抑制RelA的表達(dá)可能可以抑制肝癌的進(jìn)展。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象[8]。短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長期研究——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá),持續(xù)數(shù)周甚至更久[9]。慢病毒載體也可用于小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)表達(dá),其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細(xì)胞以進(jìn)行基因沉默的研究,避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定[9]。本研究旨在構(gòu)建靶向RelA基因的慢病毒載體,抑制肝癌細(xì)胞中RelA的表達(dá),為后續(xù)RelA在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶購自美國Thermo公司;慢病毒包裝試劑盒購自北京和元生物科技有限公司;細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;RNA提取試劑盒Fast Pure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMII 1ST Strand cDNA Synthesis Kit、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒TB Green Premix Ex TaqTM購自日本Takara公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;遺傳霉素G418購自碧云天生物科技有限公司;GAPDH抗體、RelA抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;CCK-8試劑購自美國AbMole公司。

1.2慢病毒載體及細(xì)胞 慢病毒載體pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Neo-WPRE購自上海和元生物科技有限公司。HepG2細(xì)胞及293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存,均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 MCO-18AIC恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司;Ti-E全電動倒置熒光顯微鏡、Ts2倒置顯微鏡均購自日本Nikon公司;EPS-3000電泳儀購自上海TANON公司;T100 PCR儀購自美國BioRad公司;ViiA7實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司;MULTISKAN GO全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 目的基因干擾靶點(diǎn)的設(shè)計 根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中RelA基因的核酸序列,設(shè)計siRNA靶向序列和陰性對照序列。見表1。

表1 siRNA靶向序列

1.4.2 shRNA的合成及退火 shRNA由上海和元生物科技有限公司進(jìn)行合成。在合成的shRNA中,loop莖環(huán)結(jié)構(gòu)為CTCGAG,3′端加入TTTTTT終止信號,5′端和3′端分別加入Age I和EcoR I酶切位點(diǎn)。見表2。將合成的單鏈shRNA用oligo annealing buffer溶解成20 μM,互補(bǔ)單鏈各取30 μl進(jìn)行混合,置于95 ℃水浴鍋中加熱5 min,然后室溫冷卻,形成雙鏈oligo片段。取1 μl雙鏈oligo片段用于后續(xù)的連接反應(yīng),其余-20 ℃保存。

1.4.3 線性化表達(dá)載體的制備 取2 μg載體質(zhì)粒pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Neo-WPRE,在Age I和EcoR I酶的作用下于37 ℃水浴鍋中孵育2 h進(jìn)行酶切,使其線性化。通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證酶切效果并回收大小約為8 688 bp的正確條帶。

1.4.4 載體質(zhì)粒與退火的shRNA連接 將上述線性化表達(dá)載體與退火的雙鏈oligo序列的連接反應(yīng)體系(見表3)于16 ℃過夜連接,完成慢病毒基因沉默質(zhì)粒構(gòu)建。見圖1。

圖1 RelA基因沉默慢病毒質(zhì)粒示意圖

表3 連接反應(yīng)體系

1.4.5 轉(zhuǎn)化、菌落PCR鑒定及測序 用構(gòu)建完成的RelA基因沉默慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含有氨芐西林抗性的LB固體培養(yǎng)基平板,37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子重懸于10 μl LB培養(yǎng)液中,取1 μl作為模板進(jìn)行菌落PCR鑒定,并將得到的陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證(測序引物序列:F:TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG;R:CTATTAATAACTAATGCATGGC)。經(jīng)測序驗(yàn)證正確的陽性克隆,用質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取質(zhì)粒,將提取出的質(zhì)粒用于慢病毒的包裝。

1.4.6 慢病毒包裝 接種5×106cells 293T細(xì)胞于10 cm培養(yǎng)皿中,過夜培養(yǎng)后使用慢病毒包裝試劑盒進(jìn)行慢病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后,收集上清,與濃縮試劑按照5∶1的比例在4 ℃溫度下進(jìn)行混合,過夜,離心收集沉淀并使用PBS重懸,即得到病毒濃縮液,-80 ℃保存。

1.4.7 慢病毒滴度測定 接種1×105cells 293T細(xì)胞于12孔板中,過夜培養(yǎng)后進(jìn)行病毒滴度測定。分別取0.1 μl、1 μl、10 μl病毒加入到12孔板中,同時添加終濃度為8 μg/ml的促感染試劑Polybrene。培養(yǎng)72 h后拍照記錄病毒感染后的情況并利用細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,用于實(shí)時定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測。根據(jù)公式TU ml-1=(C×N×D×1 000)/V計算出每毫升慢病毒液中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù),即為慢病毒滴度,C為平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù);N為感染時細(xì)胞的數(shù)目;D為病毒載體的稀釋倍數(shù),V為加入的稀釋病毒的體積數(shù)(μl)。

1.4.8 慢病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞及干擾效果鑒定 接種1×105cells HepG2細(xì)胞于6孔板中,過夜培養(yǎng)后再加入慢病毒和終濃度為8 μg/ml的Polybrene。每孔所加病毒量(μl)=MOI×感染時的細(xì)胞數(shù)/病毒滴度×1 000,其中HepG2的MOI值為10～30。轉(zhuǎn)染24 h后更換不含慢病毒的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,熒光顯微鏡下觀察感染情況并拍照記錄。更換含有遺傳霉素G418的新鮮培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,當(dāng)未轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞在含有遺傳霉素的培養(yǎng)基中全部死亡后即可認(rèn)為所有細(xì)胞均感染成功。收集轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,通過Western blot實(shí)驗(yàn)觀察RelA基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)情況,篩選干擾效果最好的細(xì)胞,通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力,增殖活力=(A1-Ab)/(A0-Ab),A1為細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后測得的OD450值,A0為細(xì)胞培養(yǎng)0 h時測得的初始OD450值,Ab為空白對照孔的OD450值。

2 結(jié)果

2.1RelA基因沉默慢病毒質(zhì)粒載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果 在Age I和EcoR I酶的作用下,載體質(zhì)粒pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Neo-WPRE被切割成線性化載體,瓊脂糖凝膠電泳顯示環(huán)狀載體和切割后的線性化載體在8 000～10 000 bp之間出現(xiàn)條帶,與載體實(shí)際大小8 688 bp一致,提示線性化載體切割成功。見圖2?。通過aKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒進(jìn)行膠回收,得到的線性化載體在T4 DNA ligase的作用下與退火的雙鏈oligo序列進(jìn)行連接,然后進(jìn)行菌落PCR。瓊脂糖凝膠電泳顯示,Y4056、Y21318、Y21319、Y21320四種慢病毒載體條帶大小均略低于500 bp,與實(shí)際的474 bp一致,提示成功篩選出陽性克隆。見圖2?。DNA測序后通過Vector NTI軟件比對,顯示各重組質(zhì)粒載體序列與設(shè)計序列一致。見圖3。綜合上述結(jié)果提示pCLenti-U6-shRelA-CMV-mCherry-F2A-Neo-WPREo質(zhì)粒(Y4056、Y21318、Y21319、Y21320)構(gòu)建成功。

?載體酶切結(jié)果,1:DNA ladder marker;2:H5739載體;3:H5739載體酶切后片段。?菌落PCR鑒定結(jié)果,M:DL2000 DNA marker;1～3:Y21318挑取的3個轉(zhuǎn)化子;4～6:Y21319挑取的3個轉(zhuǎn)化子;7～9:Y21320挑取的3個轉(zhuǎn)化子;10～12:Y4056挑取的3個轉(zhuǎn)化子圖2 RelA基因沉默慢病毒質(zhì)粒載體凝膠電泳及菌落PCR鑒定結(jié)果圖

?Y4056;?Y21318;?Y21319;?Y21320圖3 RelA基因沉默慢病毒質(zhì)粒測序比對結(jié)果圖

2.2慢病毒Lenti-shRelA包裝及滴度檢測結(jié)果 采用慢病毒包裝試劑盒和293T細(xì)胞將基因沉默慢病毒質(zhì)粒包裝后并進(jìn)行滴度測定。轉(zhuǎn)染72 h后,熒光顯微鏡觀察到四種慢病毒的熒光強(qiáng)度隨病毒含量升高均逐漸升高。見圖4。提取293T細(xì)胞的基因組DNA,通過qRT-PCR測定各慢病毒滴度,舍去誤差較大的結(jié)果,最終得出四種慢病毒滴度分別為3.13×108TU/ml(Y4056)、2.97×108TU/ml(Y21318)、2.51×108TU/ml(Y21319)、3.40×108TU/ml(Y21320)。見表4～7。

?Y4056;?Y21318;?Y21319;?Y21320圖4 慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光圖(×100)

表4 Y4056滴度測定結(jié)果

表5 Y21318滴度測定結(jié)果

表7 Y21320滴度測定結(jié)果

2.3Lenti-shRelA對HepG2細(xì)胞的干擾效果 使用上述四種慢病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,當(dāng)未轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞在含有遺傳霉素的培養(yǎng)基中全部死亡后,熒光顯微鏡下觀察到所有細(xì)胞均表達(dá)mCherry紅色熒光,提示轉(zhuǎn)染成功。見圖5?。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,發(fā)現(xiàn)與對照Y4056相比,Y21318、Y21319和Y21320三種慢病毒感染的HepG2細(xì)胞的RelA在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)均顯著降低(P<0.05),其中Y21320干擾效果最好。見圖5??。選擇干擾效果最好的Y21320慢病毒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

?熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染后的mCherry紅色熒光表達(dá)情況(×100);??Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HepG2細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染后RelA蛋白的表達(dá),與Y4056比較,*P<0.05圖5 Lenti-shRelA對HepG2細(xì)胞的干擾效果圖

2.4RelA敲降抑制HepG2細(xì)胞增殖 通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測RelA敲降后對細(xì)胞增殖活力的影響,結(jié)果顯示,RelA敲降后細(xì)胞增殖活力降低。見圖6。提示RelA在調(diào)控細(xì)胞增殖上發(fā)揮著重要作用。

圖6 RelA敲降對HepG2細(xì)胞增殖活力影響的結(jié)果圖(*P<0.05)

3 討論

3.1RNAi是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由dsRNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象[8]。由于shRNA表達(dá)載體可以穩(wěn)定抑制靶基因,已經(jīng)成為腫瘤領(lǐng)域常用的科學(xué)研究手段[10]。慢病毒載體是一類由人類免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)改造的病毒載體,優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究,避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定[9,11]。本研究采用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)穩(wěn)定沉默HepG2細(xì)胞的RelA基因。

3.2RelA作為NF-κB家族的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子,可通過影響下游靶基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞的增殖、炎癥反應(yīng)、免疫、分化等,對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在胰腺癌中,沉默含F(xiàn)YVE、Rho GEF和PH結(jié)構(gòu)域蛋白3(FYVE,RhoGEF and PH domain-containing 3,FGD3)可上調(diào)RelA表達(dá)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[12]。在肺癌中,NF-κB亞單位p50/p65激活可以促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞H1650對吉非替尼的耐藥[13]。在乳腺癌中,RelA是F-盒和含蛋白2的WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域(F-box and WD repeat domain-containing protein 2,FBXW2)的底物,兩者表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)敲降FBXW2表達(dá)后,RelA表達(dá)升高,從而促進(jìn)了腫瘤的生長。在FBXW2敲降的基礎(chǔ)上敲降p65,腫瘤的生長可被抑制[14]。

3.3RelA在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。據(jù)統(tǒng)計,在所有癌癥的發(fā)病率和死亡率中,肝癌分別位于第6位和第3位[15],而目前對于肝癌的治療方法,包括手術(shù)、介入、靶向藥物和免疫檢測點(diǎn)藥物治療等,仍存在疾病復(fù)發(fā)率高、患者生存率低等問題[16]。因此,尋找肝癌新的治療靶點(diǎn)尤為重要。研究發(fā)現(xiàn),通過抑制RelA的核易位,減少氧化應(yīng)激和炎癥,可改善肝纖維化[17];抑制NF-κB p65的磷酸化可以改善肝損傷,抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[18-19];RelA表達(dá)水平升高促進(jìn)了小鼠肝癌的發(fā)生[20]。上述研究結(jié)果提示抑制RelA的表達(dá)或磷酸化,可能有助于抑制腫瘤的進(jìn)展。

3.4在腫瘤中某些基因的異常表達(dá)常常引起RelA表達(dá)或磷酸化水平的異常,進(jìn)而影響腫瘤的增殖、遷移等[21-23]。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn),二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)可以通過激活NF-κB通路,使RelA磷酸化水平上升,誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá),從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生,而NF-κB通路抑制劑QNZ可以逆轉(zhuǎn)這種作用[7]。提示RelA在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用,但其具體生物學(xué)機(jī)制仍未被完全闡明。鑒此,本研究設(shè)計合成了RelA干擾序列并連接到H5739載體上,獲得了滴度分別為3.13×108TU/ml(Y4056)、2.97×108TU/ml(Y21318)、2.51×108TU/ml(Y21319)、3.40×108TU/ml(Y21320)的慢病毒載體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本研究所構(gòu)建的RelA shRNA慢病毒載體在體外可高效轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,經(jīng)過遺傳霉素G418的篩選,死亡細(xì)胞較少,且95%以上細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,shRelA慢病毒載體干擾效率較高,并篩選出了干擾效果最好的Y21320進(jìn)行后續(xù)研究。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲降RelA表達(dá)可顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖,提示RelA在調(diào)控細(xì)胞增殖上可能發(fā)揮著重要作用,但其機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述,本研究成功構(gòu)建了RelA基因shRNA慢病毒載體,獲得了穩(wěn)定沉默RelA基因的HepG2細(xì)胞,為進(jìn)一步研究RelA基因在肝癌發(fā)展中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。