雷 靜,張馨予,陳立軍,王大寧,孟 斌,溫曉昶,王江平

研究發(fā)現(xiàn),抑郁癥患者腸道菌群的組成及代謝物發(fā)生明顯變化[1,2],將抑郁癥患者的腸道菌群移植給正常小鼠可表現(xiàn)出抑郁樣癥狀[3,4],提示腸道菌群的改變可能是抑郁癥發(fā)病機制的始作俑者[5-7]。抗性糊精是一種耐受性極好的可溶性纖維[8],可調(diào)節(jié)腸道菌群,改變其組成及活性[9,10]。本研究選用抗性糊精對大鼠抑郁模型進行干預(yù),分析其抗抑郁作用,旨在為抑郁癥研究及治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 健康雄性SD大鼠,體重200 g[斯貝福(北京)生物科技有限公司,動物生產(chǎn)許可證SCXK(京)2019-0010]。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室,溫度控制在22～24 ℃,濕度50%,每12 h明暗交替光照,水和食物自由攝取。AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司);抗性糊精(北京華澳康達生物科技有限公司);QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)。本研究獲得天津市南開醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(批準號NKYY-DWLL-2020-145)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 大鼠隨機分為三組:對照組、模型組和抗性糊精組。每組8只。抗性糊精組:抗性糊精粉末溶于生理鹽水,灌胃(5 ml/kg);對照組和模型組:灌胃相同體積的生理鹽水,1次/d,持續(xù)21 d。對照組大鼠正常飼養(yǎng),不接受任何刺激。模型組和抗性糊精組均接受7種應(yīng)激刺激:禁水、水平震蕩、禁食、夾尾(距尾根部1 cm處)、冷水游泳、45 ℃烘箱熱烘以及黑白顛倒,每種刺激均實施3次,每天隨機給予一種,且相同刺激不連續(xù)兩天出現(xiàn)。造模結(jié)束后,對所有實驗動物進行糖水偏好實驗和曠場實驗,計算糖水偏愛率(%)=1%質(zhì)量體積分數(shù)的蔗糖水消耗量(ml)/總飲水消耗量(ml)×100%,記錄大鼠在礦場箱中的活動(穿越格數(shù)+直立次數(shù))。然后10%水合氯醛麻醉大鼠,收集大鼠腸道內(nèi)容物于凍存管中,液氮凍存。

1.2.2 16S rRNA高通量測序 以行為學(xué)指標為依據(jù),每組篩選4只大鼠進行高通量測序。提取大鼠腸道內(nèi)容物細菌總DNA,對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物進行電泳檢測并用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收目標片段?；厥债a(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量,按照每個樣本的測序量要求,進行相應(yīng)比例的混合。使用NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建,并通過Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit進行質(zhì)檢,文庫質(zhì)檢合格后采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺進行測序[11]。對原始數(shù)據(jù)處理后得到的有效數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 腸道菌群的多樣性分析 α多樣性指數(shù)進行評估,結(jié)果表明組間腸道微生物群落多樣性無顯著性差異(Ace指數(shù)P=0.8;Chao1指數(shù)P=0.81;Shannon指數(shù)P=0.78;Simpson指數(shù)P=0.28)。β多樣性主坐標分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)結(jié)果表明對照組與模型組菌群結(jié)構(gòu)組成差異明顯;抗性糊精組菌群結(jié)構(gòu)組成偏離模型組,接近對照組。表明抗性糊精可改善CUMS大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成和多樣性。

2.2 不同分類水平腸道菌群的組成分析

2.2.1 門水平腸道菌群組成 三組樣本中門水平的大鼠腸道菌群共鑒定出包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)在內(nèi)的19個菌門。 與對照組相比,模型組大鼠腸道菌群厚壁菌門相對豐度顯著降低[(0.92251±0.02838)vs.(0.82572±0.00761),P<0.05],擬桿菌門相對豐度顯著升高[(0.04671±0.00263)vs.(0.12341±0.03576),P<0.05];與模型組相比,抗性糊精組大鼠腸道菌群厚壁菌門相對豐度顯著升高[(0.82572±0.00761)vs.(0.93276±0.03284),P<0.01],擬桿菌門相對豐度顯著降低[(0.12341±0.03576)vs.(0.04708±0.00284),P<0.05]。

2.2.2 屬水平腸道菌群組成 在屬水平,與對照組相比,模型組大鼠腸道菌群厚壁菌門、阿克曼菌屬(Akkermansia)[(0.01327±0.00076)vs.(0.00000±0.00000)]、乳球菌屬(Lactococcus)[(0.00029±0.00010)vs.(0.00000±0.00000)]相對豐度顯著降低(P<0.05);糞桿菌屬(Faecalibaculum)[(0.00011±0.00004)vs.(0.00057±0.00005)]、Ruminococcaceae_UCG_014[(0.01003±0.00384)vs.(0.10976±0.04364)]相對豐度顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,抗性糊精可顯著回調(diào)上述菌屬(P<0.05,表1)。

表1 三組大鼠腸道菌群屬水平相對豐度對比

(續(xù)表)

2.3 標志菌群分析 為了找出不同類群中的優(yōu)勢菌群,本研究采用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size,LDA effect size),該分析方法強調(diào)統(tǒng)計意義和生物學(xué)相關(guān)性。對照組和模型組、模型組和抗性糊精組分別鑒定出有統(tǒng)計學(xué)意義的標志菌群(LDA Score>2,圖1)。通過分析發(fā)現(xiàn)Ruminococcaceae_UCG_014是模型組的標志菌群,阿克曼菌屬和乳球菌屬是對照組和抗性糊精組的標志菌群。

圖1 三組大鼠標志菌群線性判別分析

3 討 論

3.1 構(gòu)建模型 抑郁癥受多種因素的影響[12],應(yīng)激是抑郁癥產(chǎn)生的重要因素之一。動物模型是識別抑郁癥發(fā)病機制和研發(fā)新的藥物以及治療方法的最有效途徑[13,14]。其中CUMS模型更好地模擬了抑郁癥的核心癥狀,與人類現(xiàn)實生活中常見應(yīng)激事件的強度相符[11],作用持久且穩(wěn)定,被認為是目前最經(jīng)典的抑郁癥動物模型[15]。近年來研究發(fā)現(xiàn),抑郁癥的各種發(fā)病機制假說可能來源于腸道菌群的改變[5-7]。微生態(tài)調(diào)節(jié)劑主要有益生菌和益生元兩大類。益生菌具有改善體內(nèi)微生態(tài)平衡的作用,但是作為活的生物治療方法需考慮儲存方法、胃酸的影響、抗生素的影響以及是否有致病性等問題[16]。益生元可調(diào)節(jié)機體腸道微生態(tài),促進健康。且與益生菌相比,不用考慮上述問題?？剐院鳛橐嫔?是一種以淀粉為原料制成的水溶性膳食纖維,具有抗消化酶解等特性。因此筆者選用抗性糊精對其是否可改善抑郁癥進行探討研究。

應(yīng)激是正常的心理反應(yīng)。適當?shù)膽?yīng)激可提高機體的環(huán)境適應(yīng)能力, 但過度應(yīng)激可導(dǎo)致機體產(chǎn)生心理障礙[17]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),相同條件下實驗動物之間會出現(xiàn)應(yīng)激敏感和應(yīng)激抵抗兩種應(yīng)激狀態(tài),該現(xiàn)象恰好與人類不同個體間的異質(zhì)性相似。即面對現(xiàn)實生活中的各種應(yīng)激事件,不同個體之間會出現(xiàn)不同的應(yīng)激狀態(tài)[18]。鑒于抑郁模型的實驗數(shù)據(jù)存在很大的離散度[19],因此本研究基于抑郁模型的客觀數(shù)據(jù)篩選應(yīng)激敏感的動物樣本進行16S rRNA高通量測序,分析抗性糊精對CUMS大鼠腸道菌群的影響。

3.2 抗性糊精對CUMS大鼠腸道菌群的影響 臨床研究表明,抑郁癥患者與對照組的腸道菌群存在顯著差異[20],相較于對照組,抑郁癥患者的腸道微生物群多樣性和豐度都明顯下降[21]。本研究結(jié)果顯示,不同組間腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著變化。通過分析發(fā)現(xiàn):在門水平,模型組腸道菌群的厚壁菌門相對豐度降低,擬桿菌門的相對豐度升高,這與之前的抑郁動物以及抑郁患者的腸道菌群研究一致[22]。厚壁菌門和擬桿菌門是腸道菌群中所占比例最高的兩個菌門,兩者的比值(厚壁菌門/擬桿菌門)在一定程度上可以反映機體的健康狀態(tài)[23]。本研究結(jié)果顯示抗性糊精能夠調(diào)節(jié)擬桿菌門以及厚壁菌門的相對豐度。在屬水平,模型大鼠腸道菌群的阿克曼菌屬、乳球菌屬相對豐度顯著降低。阿克曼菌屬是存在于人體腸道中的一種益生菌[24,25]。有研究發(fā)現(xiàn)阿克曼菌屬在抑郁癥中的豐度顯著降低,并與下丘腦中的5-羥色胺水平呈顯著正相關(guān)。5-羥色胺與抑郁癥密切相關(guān),目前臨床上一些抗抑郁藥是針對5-羥色胺從而改善抑郁癥狀[26,27]。此外,本研究在對不同組別標志菌群分析時也發(fā)現(xiàn),阿克曼菌屬是對照組和抗性糊精組的標志菌群。因此,阿克曼菌屬很可能成為治療抑郁癥的潛在靶點。此外,研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠糞桿菌屬、Ruminococcaceae_UCG_014相對豐度顯著升高。兩者均可產(chǎn)生丁酸,丁酸是一種短鏈脂肪酸,可以加強上皮防御屏障,減少腸道炎癥。與糞球菌屬一起,糞桿菌屬始終與較高的生活質(zhì)量指標相關(guān),在抑郁癥患者中明顯減少[28]。以往的研究結(jié)果顯示,糞桿菌屬與抑郁癥呈負相關(guān),但潛在機制尚不清楚[29]。有研究表明,慢性應(yīng)激后糞便中次級膽汁酸水平的增加與Ruminococcaceae_UCG_014豐度呈正相關(guān),次級膽汁酸生物合成途徑的異常激活可能會促進CUMS小鼠的代謝紊亂和疾病進展[30]。同時,Ruminococcaceae_UCG_014是模型組的標志菌群?？剐院梢砸种粕鲜鼍鷮傧鄬ωS度的升高。以上結(jié)果表明抗性糊精可以調(diào)節(jié)抑郁大鼠的腸道菌群組成,促使腸道恢復(fù)動態(tài)平衡。

綜上所述,抗性糊精可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮抗抑郁作用,為抑郁癥的治療提供新的思路。然而,本研究僅發(fā)現(xiàn)抗性糊精可調(diào)節(jié)不同水平腸道菌群相對豐度的變化,但其干預(yù)腸道菌群的作用機制尚不清楚,課題組后續(xù)將對抗性糊精影響抑郁癥的機制進行探討研究,為促進健康、防治疾病提供更多科學(xué)有效的方案。