陸美茵 朱東艷 光曉燕 李劍

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)最常見的腫瘤, 好發(fā)于30～50 歲女性, 發(fā)病率高達(dá)33%［1］, 但其確切的病因尚未闡明。已有研究提示, 子宮肌瘤具有遺傳易感性, 其發(fā)病與特定基因的多態(tài)性密切相關(guān), 如雌激素代謝通路基因COMT、SULT1A 以及DNA 損傷修復(fù)與細(xì)胞增殖基因XPC、XRCC1［2-5］。從遺傳學(xué)層面揭示子宮肌瘤的易感因素, 對(duì)該疾病的早期篩查、治療抉擇及預(yù)后監(jiān)測(cè)無疑具有重要意義。色素框同源蛋白4(chromobox protein homolog 4, CBX4) 隸 屬 多 梳 蛋 白 家族(polycomb-group proteins, PcG), 是多梳抑制復(fù)合物1(poly-comb repressive complex 1, PRC1)的 重 要 組 成 蛋白［6］。CBX4 通過對(duì)H3K9me3、H3K27me3 等染色體組蛋白的泛素化修飾, 促進(jìn)染色體重塑而抑制下游基因轉(zhuǎn)錄, 以此調(diào)控DNA 修復(fù)、細(xì)胞增殖、分化及衰老等生理或病理機(jī)能［7-9］。既往研究表明, CBX4 基因多態(tài)性與多種腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后相關(guān)。Tan 等［10］報(bào)道該基因rs2289728 位點(diǎn)GA 基因型攜帶者罹患肝細(xì)胞肝癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高, Luo 等［11］發(fā)現(xiàn)其rs77447679 位點(diǎn)CA 基因型是胃癌的易感因素。作者在子宮肌瘤易感基因篩查工作中, 發(fā)現(xiàn)CBX4 基因rs1285251 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)與子宮肌瘤發(fā)病及臨床病理特征間關(guān)系密切, 該位點(diǎn)有望成為子宮肌瘤風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的新靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014 年2 月～2020 年1 月在深圳市寶安區(qū)婦幼保健院就診的子宮肌瘤患者419 例作為病例組, 所有患者均通過術(shù)后組織病理學(xué)確診為子宮平滑肌瘤, 年齡21～49 歲, 平均年齡(36.1±7.5)歲。選取同期在本院體檢的499 例健康女性作為對(duì)照組,經(jīng)B 超檢查排除子宮肌瘤, 年齡23～50 歲, 平均年齡(36.7±8.8)歲。兩組研究對(duì)象的一般資料比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。兩組研究對(duì)象均為漢族, 均排除了惡性腫瘤、其他女性生殖系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病且近半年內(nèi)無激素類藥物治療史。研究獲得寶安區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn), 入組者均簽署研究知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 EDTA 采血管采集兩組研

究對(duì)象2 ml 肘靜脈外周血, 置于-20℃冰箱保存。使用MagaBio plus 全血基因組DNA 純化試劑盒(杭州博日科技股份有限公司)抽提DNA, 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度及純度, 操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.2.2 基因分型 利用NCBI dbSNP 數(shù)據(jù)庫和SNPinfo數(shù)據(jù)庫, 以漢族女性人群最小等位基因頻率＞5%為檢索條件, 查詢CBX4 基因位點(diǎn)的SNP。本研究選擇其中的rs1285251(IVS2 C＞T)位點(diǎn)為研究對(duì)象。采用MassARRAY (Agena Bioscience 公 司, 美 國(guó)) 方 法予CBX4 基因SNP 分型檢測(cè)［12］：①樣本DNA 行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。反應(yīng)總體積5 μl, 反應(yīng)條件94℃ 4 min, 94℃ 20 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 45 個(gè)循環(huán), 72℃ 3 min。②蝦堿性磷酸酶去除體系中游離dNTPs。③單堿基延伸, 反應(yīng)總體積9 μl, 反應(yīng)條件94℃ 4 min, 94℃ 5 s, 52℃ 5 s, 72℃ 5 s, 40 個(gè)循環(huán)。④MassARRAY Nanodispenser RS1000 點(diǎn) 樣 儀, 將 延伸產(chǎn)物移至SpectroCHIP (Agena)芯片。⑤基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析芯片數(shù)據(jù), TYPER 4.0 軟件予結(jié)果分型。擴(kuò)增引物序列為5'-ACGTTGG ATGCCACTTTGCTTCGCACAGAG-3', 5'-ACGTTGGA TGTCAGGAGGCAGAAGCTCAG-3'。延伸引物序列為5'-CACCTCTGGCCCTCC-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS27.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t 檢驗(yàn)；遺傳平衡分析采用Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)；基因型頻率及等位基因頻率以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)；單變量和多變量Logistic 回歸計(jì)算相對(duì)優(yōu)勢(shì)比(odd ratio, OR)與95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)結(jié)果 病例組和對(duì)照組CBX4 基因rs1285251 位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(χ2=2.110、3.205, P=0.146、0.073＞0.05)。結(jié)果提示納入的研究對(duì)象具有群體代表性。見表1。

2.2 兩組基因型頻率及等位基因頻率分布比較 病例組與對(duì)照組CBX4 基因rs1285251 位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布比較, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。病例組人群TT 基因型較對(duì)照組人群更為常見(占比依次為12.17%、6.41%), 等位基因T 頻率亦顯著高于對(duì)照組(占比依次為32.58%、28.36%)。見表2。

2.3 CBX4 基因多態(tài)性與子宮肌瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系與CC基因型相比, 攜帶TT基因型人群子宮肌瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯升高［OR=2.046, 95%CI=(1.268, 3.301), P=0.003＜0.05］, 校正年齡后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［OR=1.951,95%CI=(1.138, 3.344), P=0.015＜0.05］。再 對(duì) 該 位 點(diǎn) 顯性與隱性模型進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示隱性模型條件下,TT 基因型攜帶者與TC+CC 基因型相比罹患子宮肌瘤的風(fēng)險(xiǎn)更高［OR=2.023, 95%CI=(1.273, 3.212), P=0.003＜0.05］, 校正年齡后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 ［OR=2.018,95%CI=(1.201, 3.393), P=0.008＜0.05］。顯性模型條件下各基因型與子宮肌瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)(P＞0.05)。見表3。

2.4 CBX4 基因多態(tài)性與子宮肌瘤臨床病理特征的分層分析 進(jìn)一步評(píng)價(jià)了隱性模型條件下, CBX4 基因多態(tài)性與子宮肌瘤臨床病理特征間的關(guān)聯(lián)度。分層分析顯示, 攜帶TT 基因型的＜40 歲女性子宮肌瘤患 病 風(fēng) 險(xiǎn) 明 顯 升 高［OR=1.811, 95%CI=(1.054, 3.110),P=0.031＜0.05］, 校正年齡后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［OR=1.839,95%CI=(1.036, 3.264), P=0.037＜0.05］；但TT 基因型并未影響≥40 歲女性罹患肌瘤的風(fēng)險(xiǎn)。此外, TT 基因型攜帶者出現(xiàn)多發(fā)性肌瘤［OR=2.432, 95%CI=(1.406,4.209), P=0.001＜0.05］、校正年齡后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［OR=2.726, 95%CI=(1.438, 5.167), P=0.002＜0.05］, 肌壁 間 肌 瘤［OR=2.145, 95%CI=(1.320, 3.485), P=0.002＜0.05］、校正年齡后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［OR=2.025,95%CI=(1.170, 3.504), P=0.012＜0.05］及大體積肌瘤(最大 肌 瘤 長(zhǎng) 徑≥5 cm)［OR=2.124, 95%CI=(1.300, 3.470),P=0.003＜0.05］、校正年齡后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［OR=2.138,95%CI=(1.231, 3.714), P=0.007＜0.05］的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。上述結(jié)果提示rs1285251 位點(diǎn)對(duì)子宮肌瘤患病風(fēng)險(xiǎn)的影響與年齡、腫瘤數(shù)量、腫瘤位置與最大肌瘤長(zhǎng)徑相關(guān)聯(lián)。見表4。

表1 兩組Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)結(jié)果［n(%)］

表2 兩組基因型頻率及等位基因頻率分布比較［n(%)］

表3 Logistic 回歸分析CBX4 基因多態(tài)性與子宮肌瘤的關(guān)系

表4 CBX4 基因多態(tài)性與子宮肌瘤臨床病理特征的分層分析

3 討論

子宮肌瘤是常見的婦科生殖腫瘤。盡管其表現(xiàn)為良性生物學(xué)行為, 肌瘤所導(dǎo)致的異常子宮出血、疼痛、繼發(fā)性不孕及感染等病變則嚴(yán)重危害女性身心健康及生活質(zhì)量［13,14］。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代的來臨, 從基因篩查層面提高肌瘤易感人群的識(shí)別度、探尋肌瘤生物學(xué)特征的預(yù)測(cè)靶點(diǎn), 對(duì)子宮肌瘤早期預(yù)防監(jiān)測(cè)、優(yōu)化治療方案及降低并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)均具有重要意義。

CBX4 編碼基因位于17q25.3, 全長(zhǎng)6.24kb, 包含5 個(gè)外顯子與4 個(gè)內(nèi)含子區(qū)［15］。本次研究中, 作者首次報(bào)道了CBX4 基因rs1285251 位點(diǎn)SNP 與子宮肌瘤發(fā)病及臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果表明與TC 或CC基因型攜帶者比較, TT 基因型攜帶人群罹患子宮肌瘤風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。分層研究顯示, 該位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)存在于＜40 歲的女性。由于該年齡段女性處于育齡期,早期預(yù)測(cè)子宮肌瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無疑有助于加強(qiáng)預(yù)防監(jiān)測(cè), 保障生殖健康。大體積肌瘤、多發(fā)性肌瘤及肌壁間肌瘤都易于造成宮腔狹窄和子宮牽張, 是導(dǎo)致子宮出血、繼發(fā)不孕與腹部墜脹疼痛的重要原因, 常需要臨床治療干預(yù)［16-19］。作者的研究提示TT 基因型恰是上述肌瘤特征的遺傳易感因素, 因此, 其對(duì)相關(guān)人群的治療決策有重要參考價(jià)值。

rs1285251 定位于CBX4 基因2 號(hào)內(nèi)含子區(qū)［10］, 該SNP 位點(diǎn)C/T 堿基轉(zhuǎn)換是否對(duì)CBX4 功能有調(diào)控作用目前尚不清楚。作者通過eOTLQen 平臺(tái)(www.eqtlgen.org)對(duì)rs1285251 予以表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)(expression quantitative trait loci, eQTL)分析［20］, 發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)T 堿基轉(zhuǎn)換能顯著上調(diào)CBX4mRNA 表達(dá)水平(資料未顯示)。Berta 等［21］和Chuang 等［22］均證實(shí)與正常子宮肌壁比較, 子宮肌瘤組織中CBX4mRNA 表達(dá)水平明顯升高, 并認(rèn)為CBX4 高水平表達(dá)可能參與子宮肌瘤形成。由此推測(cè), rs1285251 位點(diǎn)C/T 堿基轉(zhuǎn)換, 可能通過促進(jìn)CBX4 表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)子宮肌瘤的發(fā)生。事實(shí)上,CBX4 過表達(dá)已被證明在結(jié)腸癌、乳腺癌及骨肉瘤等多種腫瘤發(fā)生演進(jìn)中發(fā)揮作用［15,23-25］。作者擬在其后的工作中對(duì)上述假說做進(jìn)一步探索。

綜上所述, CBX4 基因rs1285251 位點(diǎn)TT 基因型是子宮肌瘤易感因素, 其與發(fā)病年齡(＜40 歲)和肌瘤臨床病理特征(大體積肌瘤、多發(fā)性肌瘤及肌壁間肌瘤)顯著相關(guān), 可為肌瘤的早期監(jiān)測(cè)與個(gè)體化防治提供指導(dǎo)參考。