李靜，朱井俊，2，邵坤，段子才，王飛

1 阜陽(yáng)市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽阜陽(yáng) 236001；2 阜陽(yáng)市第二人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科；3 阜陽(yáng)師范大學(xué)體育學(xué)院；4 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系

薄基底膜腎病，也稱為良性家族性血尿，是一種常見(jiàn)的遺傳性腎臟疾病，其發(fā)病率較高。該疾病是兒童和成人持續(xù)性鏡下血尿的最常見(jiàn)原因之一，臨床特征主要表現(xiàn)為持續(xù)性血尿和輕度蛋白尿，通常不會(huì)出現(xiàn)眼耳等其他器官的受累，并且預(yù)后較好［1-2］。患者通常具有正常的腎功能，其惟一或主要的病理表現(xiàn)是彌漫性腎小球基底膜變?。?-3］。1996年，LEMMINK 等［1］報(bào)道，薄基底膜腎病的主要致病原 因 與 編 碼Ⅳ型 膠 原α3、α4 鏈 的COL4A3 和COL4A4 的基因突變相關(guān)，該基因突變導(dǎo)致膠原蛋白結(jié)構(gòu)或數(shù)量改變，進(jìn)而影響基底膜的正常功能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。同時(shí)，在其他家系研究中，也報(bào)道了編碼Ⅳ型膠原α3、α4和α5鏈的基因COL4A3、COL4A4和COL4A5 可能為致病原因，其中，一些常見(jiàn)的COL4A4 基因突變位點(diǎn)包括c.4001A>G：p.G1334E錯(cuò)義突變位點(diǎn)、c.5044C>G：p.R1682G 錯(cuò)義突變位點(diǎn)和c.871-1G>A：splicing 剪切突變位點(diǎn)等。上述這些結(jié)果提示薄基底膜腎病與Alport綜合征（AS）有較為密切的關(guān)系，具有遺傳異質(zhì)性。一般認(rèn)為，多數(shù)薄基底膜腎病患者不會(huì)發(fā)展為慢性腎功能衰竭或終末期腎病，但10%～20%的薄基底膜腎病患者會(huì)在平均年齡60 歲時(shí)發(fā)展為終末期腎?。?］。目前，由于沒(méi)有明確的循證治療方案可用于薄基底膜腎病，因此，了解COL4A4 基因突變引起的薄基底膜腎病的臨床表型特征及遺傳特點(diǎn)對(duì)于該疾病預(yù)后、治療策略和監(jiān)測(cè)方案的制定非常重要。我們發(fā)現(xiàn)1 例由COL4A4 基因5 號(hào)外顯子c.274G>T：p.G92*無(wú)義突變所致的薄基底膜腎病，現(xiàn)將其家系遺傳特點(diǎn)報(bào)道如下。

1 資料分析

患者女，64歲。于2016年無(wú)明顯誘因下出現(xiàn)雙下肢輕度水腫，活動(dòng)后水腫癥狀加重，休息后稍緩解，無(wú)腰疼，無(wú)肉眼血尿，無(wú)胸悶、氣喘，未重視。半年后患者因水腫癥狀加重，呈凹陷性，伴有腰酸、乏力、夜尿增多等不適癥狀，至當(dāng)?shù)匦l(wèi)生院就診。查尿常規(guī)提示潛血陽(yáng)性（+++）、蛋白尿陽(yáng)性（++），血肌酐203 μmol/L，腎臟彩超提示雙腎大小尚可，臨床診斷“慢性腎炎、腎功能不全”。為進(jìn)一步明確病因，就診于本院，征得患者同意后給予行腎穿刺活檢術(shù)。腎活檢病理提示腎小球基底膜厚度變薄，符合薄基底膜腎病，建議行基因檢測(cè)進(jìn)一步明確診斷。經(jīng)與患者及其家屬溝通后，患者未同意行基因檢測(cè)。給予護(hù)腎、排毒、降壓、減少尿蛋白等藥物治療延緩腎功能進(jìn)展，并囑其注意休息、避免勞累、慎用腎毒性藥物，出院后患者沒(méi)有進(jìn)行規(guī)律門(mén)診復(fù)查隨訪、也未按時(shí)服用藥物。

2021 年6 月患者因惡心、嘔吐、胸悶就診本院。實(shí)驗(yàn)室檢查尿常規(guī)提示潛血陽(yáng)性（+++）、尿蛋白陽(yáng)性（++++），血 肌 酐1 008.8 μmol/L，尿 素 氮23.94 mmol/L，血紅蛋白74 g/L，腎臟超聲提示雙腎縮小、呈慢性損害性聲像圖。結(jié)合薄基底膜腎病史，臨床明確診斷為慢性腎衰竭—尿毒癥期；薄基底膜腎病。給予維持性血液透析治療，2～3 次/周，病情總體尚平穩(wěn)。

同時(shí)因?yàn)榧蚁抵杏卸嗳四I臟相關(guān)疾病出現(xiàn)，對(duì)患者3 代以內(nèi)的家庭成員進(jìn)行調(diào)查，該家系成員兒子（Ⅱ1、Ⅱ4）、女兒（Ⅱ2、Ⅱ3）均有血尿和蛋白尿，先證者的孫女Ⅲ2、孫子Ⅲ4和外甥女Ⅲ5均有血尿，其他家庭成員尿檢無(wú)異常。為了進(jìn)一步明確該病的病因以及是否存在遺傳性腎病，征得患者及其家人同意后，我們采集了先證者和其家系成員的外周靜脈血2 mL，使用Illumina Hiseq2500 測(cè)序儀對(duì)其進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，最后通過(guò)Sanger 測(cè)序?qū)z測(cè)到的變異位點(diǎn)進(jìn)行了家系驗(yàn)證。

全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，先證者（Ⅰ1）COL4A4 基因5 號(hào)外顯子存在c.274G>T：p.G92*無(wú)義突變。Sanger 測(cè)序結(jié)果（見(jiàn)圖1）顯示該突變遺傳符合家系共分離，在患者與家族成員中攜帶者遵循一致的遺傳模式，均符合常染色體顯性遺傳，提示該突變位點(diǎn)可能是致病位點(diǎn)。先證者兒子（Ⅱ4）、女兒（Ⅱ2、Ⅱ3）、孫女（Ⅲ2）、孫子（Ⅲ4）、外甥女（Ⅲ5）COL4A4 基因5 號(hào)外顯子均存在c.274G>T：p.G92*無(wú)義突變。其中先證者兒子（II1）因外出務(wù)工未進(jìn)行血樣采集化驗(yàn)，其女兒（Ⅲ2）和兒子（Ⅲ4）均攜帶該突變，再結(jié)合Ⅱ1 有血尿、蛋白尿癥狀，推測(cè)出家庭成員（Ⅱ1）攜帶該突變。對(duì)檢測(cè)出的COL4A4 基因突變進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，發(fā)現(xiàn)其為新發(fā)突變位點(diǎn)。

圖1 薄基底膜腎病家系中家庭成員COL4A4基因突變位點(diǎn)Sanger測(cè)序結(jié)果

按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）的遺傳突變分析指南，對(duì)先證者家系成員進(jìn)行遺傳分析，并參考遺傳病致病數(shù)據(jù)庫(kù)在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD）以及PubMed 等相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析。通過(guò)綜合遺傳方式和先證者的突變基因分析確定該遺傳病的遺傳方式，并鑒定出家系共分離的突變位點(diǎn)。最終根據(jù)先證者的臨床特征篩選出與先證者臨床特征最匹配的致病突變?yōu)?號(hào)外顯子.274G>T：p.G92*突變。

在Uniprot和Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選人類和其他物種COL4A4 基因同源蛋白序列，用DNAman 軟件進(jìn)行蛋白序列同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)p.G92*位點(diǎn)甘基酸在人類和其他物種相同位置上高度保守（見(jiàn)圖2）。應(yīng)用Swiss-model 同源建模軟件對(duì)新發(fā)現(xiàn)的變異進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)同源建模分析比對(duì)，變異c.274G>T：p.G92*導(dǎo)致編碼產(chǎn)物由甘氨酸替換成終止密碼子，與野生型蛋白相比有顯著差異（見(jiàn)圖3），說(shuō)明該突變可能會(huì)導(dǎo)致COL4A4 蛋白的形態(tài)異常和功能障礙。以上結(jié)果均顯示該突變?yōu)楸』啄つI病的潛在致病突變位點(diǎn)。

圖3 Swiss-model同源建模構(gòu)建的COL4A4蛋白三維結(jié)構(gòu)

2 討論

薄基底膜腎病的遺傳方式是一種常染色體顯性遺傳疾病，其發(fā)病通常與COL4A3/COL4A4 基因的突變有關(guān)。該疾病的主要臨床表現(xiàn)是血尿，多數(shù)患者表現(xiàn)為持續(xù)的鏡下血尿，也可能出呼吸道感染或劇烈活動(dòng)后的發(fā)作性肉眼血尿。該疾病可以在任何年齡發(fā)生，但多數(shù)患者的預(yù)后良好［5］。

在GBM 中，Ⅳ型膠原作為含量最豐富的分子之一，它與基底膜中的層黏連蛋白、巢蛋白等相互作用，共同參與組成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［6］。目前已鑒定出六種不同的IV 型膠原蛋白鏈，分別被命名為α1至α6，這些蛋白鏈由COL4A1 至COL4A6 基因進(jìn)行編碼。隨著腎臟的發(fā)育，α1α2 鏈逐漸被α3α4α5 鏈取代，因此α 3α4α5鏈?zhǔn)浅錾驡BM的主要成分，其交聯(lián)度更高，更耐蛋白質(zhì)降解，這可能對(duì)腎小球選擇性屏障特性的建立和維持至關(guān)重要［7］。COL4A3和COL4A4位于2q36.3 上，COL4A3 包含52 個(gè)外顯子并編碼α3 鏈（1 670 個(gè)氨基酸），而COL4A4包含48個(gè)外顯子并編碼α4 鏈（1 690 個(gè)氨基酸）［8］。薄基底膜腎病中COLA43 和COL4A4 突變可能影響阻礙GBM 中α3α4α5交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，并最終降低GBM 的厚度和穩(wěn)定性，導(dǎo)致薄基底膜腎病或AS的發(fā)生。

AS 的臨床表現(xiàn)比薄基底膜腎病復(fù)雜，主要表現(xiàn)為腎功能進(jìn)行性惡化、高頻感音神經(jīng)性耳聾和眼部病變，有些AS患者早期或者不典型的情況下只有血尿一種表現(xiàn)，需要與薄基底膜腎病進(jìn)行區(qū)分。AS的遺傳模式有多種，其中X連鎖顯性遺傳型占大多數(shù)，約85%，通常由COL4A5 基因發(fā)生突變導(dǎo)致，其余15%左右是常染色體顯性遺傳或隱性遺傳，由COL4A3 或COL4A4 基因發(fā)生突變引起［9］。當(dāng)存在持續(xù)性腎小球血尿、少量蛋白尿（500 mg/d）、腎功能正常（大部分）且無(wú)其他明顯腎外異常時(shí)，臨床上可診斷薄基底膜腎?。?0］。大約40%的薄基底膜腎病家庭成員有血尿，血尿與COL4A3/COL4A4 基因座的突變分離，約三分之二的薄基底膜腎病患者中，至少有一名其他家庭成員患有常染色體顯性遺傳模式的血尿［11］。

以往研究認(rèn)為薄基底膜腎病是良性的，在健康人群中可出現(xiàn)，其腎臟超聲、腎功能、血壓等均正常。本研究中，先證者64 歲，病情逐漸發(fā)展到加重階段，并開(kāi)始進(jìn)行透析治療，該家系成員II1、II2（38歲）、II3（36 歲）、II4（35 歲）均有血尿、蛋白尿，病情較先證者輕。先證者孫女III2（12 歲），孫子III4（7歲）以及外甥女III5（13 歲）均有血尿，無(wú)其他癥狀。有研究［12］發(fā)現(xiàn)，薄基底膜腎病的癥狀與年齡有相關(guān)性，患者會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)而漸漸發(fā)展到更加嚴(yán)重的臨床階段，出現(xiàn)蛋白尿、局灶階段性腎小球硬化、腎功能下降等臨床表現(xiàn)，這也表明薄基底膜腎病并不如之前所認(rèn)為的那樣良性。

薄基底膜腎病的遺傳模式是常染色體顯性遺傳，即只要一個(gè)等位基因上出現(xiàn)有害的突變，就可能引起疾病的發(fā)生。全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者（I1）COL4A4 基因5 號(hào)外顯子存在c.274G>T：p.G92*無(wú)義突變，使92 號(hào)甘氨酸突變成終止密碼子，進(jìn)而腎小球基底膜三聚體組裝異常，這破壞了Ⅳ型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和柔韌性，最終影響到基底膜網(wǎng)絡(luò)的功能。該突變經(jīng)Sanger測(cè)序結(jié)果證實(shí)與家系共分離相符合，在蛋白序列同源比對(duì)中發(fā)現(xiàn)，該變異位點(diǎn)在人類和其他物種之間具有高度的保守性，利用Swiss-model同源建模軟件構(gòu)建出的COL4A4蛋白野生型和變異型的三維結(jié)構(gòu)，可以清楚地看到變異體p.G92*無(wú)法形成完整的蛋白結(jié)構(gòu)，這種無(wú)義突變導(dǎo)致翻譯過(guò)程提前結(jié)束，所編碼的蛋白質(zhì)無(wú)法正常表達(dá)，對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響很大。

總之，COL4A4 基因5 號(hào)外顯子c.274G>T：p.G92*無(wú)義突變致薄基底膜腎病臨床表現(xiàn)為血尿，病理表現(xiàn)為基底膜變薄，晚期可能會(huì)發(fā)展為終末期腎病；該突變引起的遺傳模式為常染色體顯性遺傳。根據(jù)ACMG 指南，其突變類型可能為致病性突變。此突變位點(diǎn)目前在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道，補(bǔ)充了人類薄基底膜腎病基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)進(jìn)一步研究中國(guó)人群薄基底膜腎病的發(fā)病機(jī)制、遺傳咨詢等提供了依據(jù)。