王家威，左越，宮哲軒，劉福林，劉彤彤

河北大學(xué)附屬醫(yī)院心臟外科，河北保定 071000

氫氣在很長的一段時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是一種無功能的生物惰性氣體，對人體內(nèi)的生物活動(dòng)不產(chǎn)生任何效應(yīng)［1］。但是日本學(xué)者OHSAWA 等［2］在2007年的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)氫氣在體外環(huán)境中可以選擇性地清除具有細(xì)胞毒性的活性氧（ROS）分子的現(xiàn)象，并且提出了氫氣選擇性抗氧化和細(xì)胞保護(hù)作用的新假說，使得氫氣的生物學(xué)意義被重新重視起來。心肌缺血再灌注損傷（MIRI）一直是急性心肌梗死（AMI）患者在冠脈復(fù)流后繼續(xù)造成心肌損傷的重要原因之一，近年來有研究表明線粒體活性氧（mROS）的產(chǎn)生［3］和線粒體功能障礙［4］是普遍存在于各類組織缺血再灌注損傷病理過程中的重要驅(qū)動(dòng)因素。氫氣作為分子量最小的氣體，具有穩(wěn)定共價(jià)鍵的非極性分子，呈電中性，這些特性使得氫氣可以通過自由擴(kuò)散的方式進(jìn)入線粒體等亞細(xì)胞間隔參與分子活動(dòng)［5］，從而抑制線粒體內(nèi)ROS 的生成，調(diào)控線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)的穩(wěn)定，通過上述調(diào)控機(jī)制改善MIRI?，F(xiàn)就氫氣對MIRI 患者心肌細(xì)胞線粒體ROS 生成抑制和線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)調(diào)控的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 氫氣對MIRI 患者心肌細(xì)胞線粒體ROS 生成抑制作用及其機(jī)制

氫氣對諸如羥自由基（·OH）在內(nèi)的ROS清除作用一直被認(rèn)為是氫氣抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要因素之一，但是氫氣直接清除ROS 的理論仍有局限。一方面外體外實(shí)驗(yàn)中氫氣與ROS 中諸如·OH 的反應(yīng)速度比谷胱甘肽、葡萄糖或其他生物分子的反應(yīng)速度慢很多［6］；另一方面氫氣在對帕金森、內(nèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肥胖和糖尿病等先天或慢性疾病某些方面的改善無法完全用清除ROS來解釋［7］。在哺乳動(dòng)物的線粒體中，目前已發(fā)現(xiàn)了11個(gè)與底物氧化等有關(guān)的產(chǎn)生ROS 的位點(diǎn)［8］，其中大部分的ROS 來源于呼吸鏈（ETC）上的電子泄漏，而半醌（QH-）則被認(rèn)為是其中的一個(gè)重要的紐帶，因?yàn)檫^量或者不適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生QH-可能是超氧化物的主要來源之一［9-10］。對此，ISHIBASHI 等［7］提出了氫氣干預(yù)ROS 生成上游事件中的線粒體復(fù)合體催化中心的反應(yīng)從而干預(yù)ROS生成行為的猜想。

1.1 抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ中ROS 的生成 線粒體復(fù)合體Ⅰ又被稱為NADH-泛醌還原酶，是線粒體鏈上最大的膜蛋白復(fù)合體，是呼吸鏈的入口，主要由突入線粒體基質(zhì)中的長臂和嵌入線粒體內(nèi)膜上的橫臂兩部分組成，其主要作用是將電子從NADH 傳遞到偶聯(lián)的輔酶Q（即泛醌），同時(shí)將H+從線粒體的基質(zhì)側(cè)泵入膜間隙側(cè)［11］。線粒體復(fù)合體Ⅰ在生物學(xué)上與［NiFe］-氫酶有著密切的關(guān)系，［NiFe］-氫酶的功能是催化質(zhì)子的可逆轉(zhuǎn)化，使微生物能夠?qū)錃庾鳛槟茉催M(jìn)行生命活動(dòng)［12］，也因此線粒體復(fù)合體Ⅰ被認(rèn)為擁有一些氫酶的性質(zhì)。復(fù)合體Ⅰ按照功能分類為：長臂遠(yuǎn)端的N 模塊、長臂近端對接到橫臂上的Q模塊以及橫臂上的近端泵模塊（PP）和遠(yuǎn)端泵模塊（PD）；其中，Q 模塊將N 模塊氧化NAPDH 產(chǎn)生的電子經(jīng)泛醌結(jié)合位點(diǎn)（IQ）傳遞給線粒體膜間隙中的泛醌，生成二氫泛醌（QH2）或QH-（介于泛醌和二氫泛醌之間的中間體）［13］。在哺乳動(dòng)物的線粒體復(fù)合體Ⅰ中，Q 模塊中的IQ被認(rèn)為是氫氣抑制復(fù)合體Ⅰ中ROS的生成的關(guān)鍵位點(diǎn)，氫氣在IQ通過QH-的影響活化，與附近的堿和酸性氨基酸發(fā)生協(xié)同反應(yīng)，裂解成質(zhì)子和電子（類似于［NiFe］-氫酶中氫氣裂解反應(yīng)過程中的情況7］），其中電子逆向通過Q 模塊轉(zhuǎn)移至N模塊，以自由基的形式還原氧化的FMN（和/或?qū)AD + 還原為NADH），質(zhì)子則通過正向轉(zhuǎn)移將QH-還原為QH2，避免了產(chǎn)生ROS的有害電子泄露［7］。

1.2 抑制線粒體復(fù)合體Ⅲ中ROS 的生成 與復(fù)合體Ⅰ的結(jié)構(gòu)不同，哺乳動(dòng)物的復(fù)合體Ⅲ的結(jié)構(gòu)是一個(gè)對稱的二聚體，每個(gè)單體有11 個(gè)亞基，其中具有催化活性的亞基是細(xì)胞色素b（包括高電勢bH和低電勢bL）、細(xì)胞色素c1和被鐵硫蛋白包裹的高電勢FeS 輔基［14］，復(fù)合體Ⅲ主要作用是通過Q 循環(huán)將來自線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ的電子轉(zhuǎn)移至復(fù)合體Ⅳ［15］。對比較為復(fù)雜機(jī)制不明確復(fù)合物Ⅰ，復(fù)合物Ⅲ產(chǎn)生ROS 的機(jī)制早已經(jīng)有了被大眾所信服的解釋：復(fù)合體Ⅲ在通過Q 循環(huán)傳遞電子的過程中，QH2氧化位點(diǎn)（Qo）上產(chǎn)生的攜帶單電子的不穩(wěn)定QH-可以在復(fù)合物Ⅲ中自由移動(dòng)，直接將單電子傳遞給O2，并通過非酶反應(yīng)形成ROS（一方面，缺血期低氧誘導(dǎo)半醌將電子傳遞給O2，另一方面，再灌注期大量進(jìn)入線粒體中，這兩方面的因素共同促進(jìn)了有害ROS 的產(chǎn)生［7］。比如QUINLAN 等［16］發(fā)現(xiàn)，抗霉素A 可以特異性地阻斷復(fù)合體Ⅲ的泛醌還原位點(diǎn)（QI），導(dǎo)致Qo位QH-上的電子停滯，從而與O2反應(yīng)生成ROS；而豆蔻素和霉唑作為Qo位點(diǎn)的特異性抑制劑，可以阻斷QH2與Qo位點(diǎn)的結(jié)合，阻止電子向復(fù)合體Ⅲ的轉(zhuǎn)移，從而阻止復(fù)合體Ⅲ中ROS 的產(chǎn)生。這一其具體的機(jī)制可能是由于阻斷了從Q 循環(huán)中生成QH-的電子轉(zhuǎn)移［17］，更加佐證了上述的解釋。因此，雖然復(fù)合體Ⅲ與［NiFe］-氫酶并沒有太大的聯(lián)系，但是目前的研究證據(jù)可以說明氫氣干預(yù)復(fù)合體Ⅲ中ROS 產(chǎn)生的可能機(jī)制：即氫氣可能直接與Qo位上的不穩(wěn)定QH-發(fā)生非酶促反應(yīng)，從而抑制超氧化物的產(chǎn)生。

總之，在Toru Ishibashi提出的假設(shè)描述中，氫氣可能同時(shí)作為氧化劑和還原劑，在產(chǎn)生ROS 的關(guān)鍵位點(diǎn)活化，通過將質(zhì)子傳遞給包括QH-在內(nèi)的泛醌物種或是將電子沿電子轉(zhuǎn)移途徑逆向傳遞給ETC上游的電子供體，阻止ROS 產(chǎn)生位點(diǎn)兩個(gè)方向上的電子流動(dòng)，從而防止在缺血再灌注損傷的情況下ETC 過早泄漏產(chǎn)生ROS 的有害電子，進(jìn)入大量有害ROS產(chǎn)生的惡性循環(huán)中［7］。

2 氫氣對MIRI 患者心肌細(xì)胞線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)調(diào)控的作用及其機(jī)制

在機(jī)體內(nèi)，每個(gè)細(xì)胞中的全部線粒體構(gòu)成了一個(gè)動(dòng)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)，并由“線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)”去調(diào)控，該系統(tǒng)是通過線粒體的融合、分裂、自噬、線粒體生物發(fā)生和線粒體未折疊蛋白反應(yīng)等方式維持細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量和質(zhì)量相對穩(wěn)定的復(fù)雜動(dòng)態(tài)生理過程［18］。有關(guān)氫氣干預(yù)線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)的研究目前主要集中在以下幾個(gè)方面：調(diào)控PINK1/Parkin 信號 通 路［19］、Drp1 和Mfn2 信號 通 路［20］、FUNDC-1 通路［21］、未折疊蛋白反應(yīng)［22］、激活PGC-α 促進(jìn)線粒體生物發(fā)生［23］。

2.1 調(diào)控PINK1/Parkin 和FUNDC-1 介導(dǎo)的線粒體自噬途徑 PINK1/Parkin 途徑和FUNDC-1 途徑都屬于線粒體自噬途徑。線粒體自噬是一種選擇性的自噬，是細(xì)胞內(nèi)的自噬小體精準(zhǔn)的識別衰老或受損的線粒體，并向其運(yùn)送至溶酶體內(nèi)清除的過程，從而防止諸如缺血再灌注損傷的病理過程中的線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的進(jìn)展，維持心肌細(xì)胞的能量平衡及存活。

有關(guān)線粒體自噬的機(jī)制，目前研究最多的就是PINK1/Parkin 途徑。在正常細(xì)胞內(nèi)，PINK1 定位于線粒體外膜（OMM），然后經(jīng)線粒體轉(zhuǎn)位膜復(fù)合物轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)膜（IMM），被內(nèi)膜上的基質(zhì)加工肽酶（Mpp）和早老素相關(guān)的菱形蛋白（Parl）迅速降解；然而，當(dāng)線粒體在應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，線粒體膜電位的降低通過影響Mpp 和Parl 以及轉(zhuǎn)位蛋白的活性來干擾PINK1 的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解，導(dǎo)致PINK1 前體在OMM 上積累［24］。積累的PINK1通過招募并磷酸化Parkin 進(jìn)而使包括線粒體rho GTPase 1（Miro1）、線粒體融合蛋白1/2（Mfn1/2）和電壓依賴性陰離子通道（VDAC1）在內(nèi)的線粒體自噬蛋白經(jīng)過泛素化而激活［25］；另外，PINK1 也可以直接磷酸化TANK 結(jié)合蛋白1（TBK1），進(jìn)而進(jìn)一步激活其他線粒體自噬受體，比如核點(diǎn)蛋白（NDP52）、p62和視神經(jīng)磷酸酶（OPTN）。所有這些受體含有微管蛋白1 輕鏈3（LC3）相互作用區(qū)（LIR 模體）和泛素相互作用區(qū)，可以促進(jìn)泛素化的線粒體和自噬小體之間的融合，從而清除功能障礙的線粒體18］。目前，普遍認(rèn)為在缺血期時(shí)增強(qiáng)量均有所提升，而在沉默PINK1基因后，氫氣對缺血再灌注損傷的保護(hù)作用受到了逆轉(zhuǎn)［26］。在另一項(xiàng)研究［19］中發(fā)現(xiàn)了氫可以通過促進(jìn)線粒體自噬活性，增強(qiáng)PINK1、Parkin 和VDAC 的表達(dá)，促進(jìn)Lc3-I向Lc3-II 的轉(zhuǎn)化，降低p62 的表達(dá)，從而改善內(nèi)毒素刺激后線粒體功能障礙。

FUNDC-1 途徑也是線粒體自噬途徑中的一員，F(xiàn)un14 結(jié)構(gòu)域蛋白1（Fundc1）是一種具有3 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的OMM蛋白。在低氧等應(yīng)激條件的誘導(dǎo)下，F(xiàn)undc1 介導(dǎo)的線粒體自噬主要通過磷酸化（或去磷酸化）修飾來激活。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三個(gè)磷酸化位點(diǎn)：Tyr18、Ser13 和Ser17；Ser13 和Tyr18 的磷酸化抑制Fundc1-LC3 的相互作用和隨后的線粒體自噬，而Ser17的磷酸化會(huì)增強(qiáng)線粒體自噬18］。正常的細(xì)胞環(huán)境中，F(xiàn)UNDC-1 介導(dǎo)的自噬會(huì)被Tyr18 的磷酸化所抑制［27］；而在缺血再灌注損傷中，這種抑制的作用會(huì)減弱，從而使FUNDC-1 發(fā)揮其誘導(dǎo)自噬的作用。在氫氣干預(yù)下，敗血癥模型中小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)的p-18-Fundc1 蛋白的含量相較于沒有氫氣干預(yù)的模型組會(huì)更明顯的減少，同時(shí)氫氣也會(huì)促進(jìn)FUNDC-1 與LC3 的相互作用，增強(qiáng)原本受到抑制的FUNDC-1介導(dǎo)的自噬［21］。

另外，同屬于線粒體自噬途徑的BNIP3/NIX 途徑及其所屬的BCL-2家族在細(xì)胞凋亡的機(jī)制中已經(jīng)有了較為全面的研究，氫氣的干預(yù)機(jī)制也有了比較多的探討，但是目前仍沒有關(guān)于氫氣干預(yù)BNIP3/NIX途徑的相關(guān)報(bào)道。

2.2 調(diào)控Drp1 介導(dǎo)的線粒體分裂 線粒體膜電位對線粒體功能的維持有著非常重要的意義，在細(xì)胞缺氧或應(yīng)激的過程中，線粒體膜電位的下降會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，而氫氣處理可以通過增加線粒體膜電位來改善線粒體功能［19］，其機(jī)制可能使通過線粒體分裂來控制的。線粒體分裂則可以產(chǎn)生新的線粒體，允許線粒體的重新分布，并促進(jìn)受損線粒體的分離。線粒體的分裂是一個(gè)不對稱的過程，它使分裂后的其中一個(gè)子體線粒體具有高膜電位，并很快重新融合到細(xì)胞內(nèi)線粒體網(wǎng)絡(luò)中，而另一個(gè)子體線粒體具有低膜電位，通常經(jīng)過PINK1/Parkin 線粒體自噬途徑清除［28］。適當(dāng)?shù)木€粒體分裂產(chǎn)生許多子線粒體，正如前文所說，部分子線粒體繼續(xù)參與進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的線粒體網(wǎng)絡(luò)為心肌細(xì)胞提供ATP，其他的子線粒體以線粒體自噬的方式清除。在缺乏Drp1 基因的個(gè)體中，發(fā)現(xiàn)了線粒體呼吸功能受損，線粒體吞噬功能受到抑制，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放的易感性增加，以及細(xì)胞凋亡率或壞死率增加的現(xiàn)象，但是在基線水平上，Drp1 的過表達(dá)又會(huì)誘導(dǎo)線粒體功能障礙和心肌細(xì)胞的凋亡［29］。因此Drp1 在MIRI的過程中扮演的角色仍然不明確，是否加重或改善心臟再灌注損傷及其可能的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。有意思的是在肺膿毒癥的模型中，氫氣干預(yù)后Drp1的表達(dá)量水平較模型組明顯的下降，但是與對照組的差距卻并不明顯［20］，這表明氫氣可能是在一定程度上逆轉(zhuǎn)缺氧應(yīng)激帶來的過度的有害線粒體分裂，以維持在正常生理環(huán)境的水平來減輕細(xì)胞的損傷。

2.3 調(diào)控Mfn2途徑介導(dǎo)的線粒體融合 線粒體融合使線粒體內(nèi)物質(zhì)能夠在線粒體之間交換，與線粒體分裂和自噬一起清理受到損害、老化的線粒體，保證細(xì)胞內(nèi)線粒體本身的穩(wěn)定以保證細(xì)胞功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。線粒體融合是由神經(jīng)營養(yǎng)因子1（OPA1）、線粒體融合蛋白1/2（Mfn1/2）3 種蛋白同時(shí)作用的過程，其中Mfn1 和Mfn2 分別誘導(dǎo)IMM 和OMM 的融合［30］。目前有關(guān)氫氣干預(yù)線粒體融合途徑的報(bào)道較少，但是DONG 等［20］發(fā)現(xiàn)，在肺膿毒癥的模型中，氫氣干預(yù)后Mfn2 的表達(dá)水平與正常的組織沒有明顯的差別，但相較于模型組卻有著明顯的提升。這表明，在膿毒癥存在的情況下，氫處理可以使Mfn2 的水平維持在正常的范圍以促進(jìn)線粒體的融合，從而減輕應(yīng)激損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。但是除了其介導(dǎo)線粒體融合的作用外，Mfn2 還有著其他的作用，比如作為Parkin的線粒體受體介導(dǎo)心肌細(xì)胞的線粒體自噬［31］。目前Mfn1/2 在心臟缺血再灌注損傷中的作用引起了激烈的爭論，因?yàn)闊o論其表達(dá)量的增多還是減少都能在一定程度上提供心臟的保護(hù)，氫氣在這一機(jī)制中的作用也不明確，可能是通過線粒體融合或是線粒體自噬這兩種方式減輕心肌細(xì)胞的損傷，目前只能說為氫氣干預(yù)MIRI的研究提供了一條新的方向［18］。

2.4 調(diào)控線粒體未折疊蛋白反應(yīng) 線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（UPRmt）是在諸如氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷、線粒體DNA 或代謝功能受損、以及線粒體蛋白平衡紊亂這些應(yīng)激環(huán)境下，促進(jìn)線粒體伴侶蛋白和蛋白水解酶的表達(dá)，從而恢復(fù)線粒體蛋白穩(wěn)定的過程，是屬于線粒體質(zhì)量控制的一員［32］。目前發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中一共有3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與了線粒體未折疊蛋白反應(yīng)的過程，它們包括ATF5、ATF4 和CHOP，但是沒有直接的證據(jù)證明氫氣可以通過上述幾種轉(zhuǎn)錄因子激活線粒體未折疊蛋白反應(yīng)。SOBUE 等［22］發(fā)現(xiàn)，氫氣可以使組蛋白H3K27去甲基酶或染色質(zhì)重組，隨后通過H3K27 或H3K9 甲基化狀態(tài)的改變而激活線粒體未折疊蛋白反應(yīng)，這提示了氫氣可能通過其他的途徑來激活線粒體未折疊蛋白反應(yīng)的通路；同時(shí)他們也給出了一個(gè)后續(xù)的方向，即氫氣可能通過使JMJD3（一種H3K27去甲基酶）表達(dá)的上調(diào)來激活線粒體未折疊蛋白反應(yīng)。

2.5 調(diào)控線粒體生物發(fā)生 線粒體生物發(fā)生是一種建立在線粒體分裂、生長和增值基礎(chǔ)上的線粒體數(shù)量增多的過程，是線粒體周轉(zhuǎn)的一種再生機(jī)制，其主要目的是為了及時(shí)補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量以提供充足的能量滿足細(xì)胞活動(dòng)。線粒體生物發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要核基因組與線粒體基因組的緊密配合，它們分別轉(zhuǎn)錄各自對應(yīng)的線粒體蛋白質(zhì)以促進(jìn)線粒體生物發(fā)生的進(jìn)展，以提高線粒體的質(zhì)量水平。核基因組中編碼的線粒體蛋白的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄共激活因子的調(diào)控，其中研究最廣泛的與線粒體生物發(fā)生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子是PGC-1α，它可以激活如核呼吸因子NRFs（包括Nrf1和Nrf2），以及雌激素相關(guān)受體（Err）家族蛋白在內(nèi)的各種轉(zhuǎn)錄因子［33］。NRFs 主要參與線粒體呼吸亞基和線粒體轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，其中轉(zhuǎn)錄因子包括線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）和轉(zhuǎn)錄因子B（TFBM）［34］。在缺氧等應(yīng)激條件下，PGC-1α、Nrf2和TFAM的表達(dá)水平升高，而氫氣處理進(jìn)一步增加了這些蛋白的表達(dá)水平［35］，這說明氫氣可以在一定程度上增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生，增加細(xì)胞中正常功能線粒體的數(shù)量，緩解應(yīng)激造成的線粒體功能障礙，但是其詳細(xì)的作用機(jī)制仍然不明，可能是在上游階段促進(jìn)PGC-1α 的磷酸化和去乙酰化來激活下游的信號通路。

綜上所述，氫氣除了通過清除ROS 來緩解氧化應(yīng)激的作用之外，也可能直接干預(yù)線粒體產(chǎn)生致病性ROS 的上游階段，選擇性的抑制缺血再灌注損傷過程中的額外ROS 產(chǎn)生來減輕氧化應(yīng)激的影響［7］。除此之外，線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)是最近提出來的一個(gè)新概念，其系統(tǒng)的失衡被認(rèn)為是導(dǎo)致MIRI的一個(gè)重要的影響因素［4］。有不少報(bào)道都提出了氫氣參與在應(yīng)激或是缺氧條件下線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)自我調(diào)控的過程，通過PINK1/Parkin 信號通路、Drp1 和Mfn2信號通路、FUNDC-1通路、未折疊蛋白反應(yīng)、激活PGC-α 促進(jìn)線粒體生物發(fā)生等方式改善MIRI，這一過程從結(jié)果來看是有益的，但是其具體的分子機(jī)制仍然不明確；線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)的調(diào)控是復(fù)雜的動(dòng)態(tài)生理過程，各路徑之間也有著相互的影響，闡明氫氣在參與線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)調(diào)控的具體作用機(jī)制是可能一個(gè)未來研究的重點(diǎn)方向。