胡銳 萬蘭婷 安穎 朱進 李善慶 嚴(yán)立

武漢市第四醫(yī)院手外科,湖北 武漢 430033

骨質(zhì)疏松癥是常見骨科疾病,多發(fā)于絕經(jīng)期女性及中老年人,骨質(zhì)疏松性骨折是其嚴(yán)重并發(fā)癥之一,具有較高的發(fā)病率與致殘率[1]。骨折的愈合是一個復(fù)雜的過程,涉及到初始的炎癥反應(yīng)、骨痂生長、骨組織重塑及各種生長因子、細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)[2]。研究顯示,環(huán)氧化酶2(COX-2)在骨折修復(fù)中具有重要作用,COX-2可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素E2(PGE2),PGE2與受體結(jié)合,刺激環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的產(chǎn)生,進而促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá),加速成骨細(xì)胞的增殖與分化,促進骨痂鈣化和重塑,促進骨折愈合[3];因此,COX-2/PGE2信號通路在骨折愈合過程中發(fā)揮重要作用。蟲草素(Cordycepin)是從冬蟲夏草中提取的活性物質(zhì),具有抗炎、抗氧化作用[4]。研究顯示,蟲草素通過抑制白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子釋放及抗氧化應(yīng)激作用,促進大鼠骨折愈合[5]。然而,蟲草素對骨質(zhì)疏松大鼠的骨折愈合的影響及作用機制尚不清楚。本研究通過探究蟲草素對骨質(zhì)疏松大鼠的骨折愈合及COX-2/PGE2通路的影響,初步探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:雌性SD大鼠(SPF級),體質(zhì)量200～230 g,購自廣東維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(粵)2022-0063]。飼養(yǎng)條件為室溫22～25 ℃,相對濕度45 %～60 %,自由飲水采食。

1.1.2主要試劑:蟲草素(B20196,HPLC≥98 %)購自上海源葉生物科技有限公司;蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(C0105 M)、COX-2抑制劑NS-398(S1772)、COX-2(AF1924)、VEGF(AF1309)抗體購自碧云天生物科技有限公司;大鼠ALP(SP12819)、Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA試劑盒(SP12422)購自武漢賽培生物科技有限公司;骨鈣素(osteocalcin,OC)檢測試劑盒(E4764-100)購自艾美捷科技有限公司COX-2(E-EL-R0792c)、PGE2(E-EL-0034c)、cAMP(E-EL-0056c)ELISA試劑盒購自Elabscience公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組及模型制備:根據(jù)參考文獻(xiàn)[6],行雙側(cè)卵巢切除術(shù)制備骨質(zhì)疏松大鼠模型,假手術(shù)組(Sham組,n=10)只暴露卵巢,不做摘除。術(shù)后8周,造模大鼠骨密度顯著低于假手術(shù)組(Sham組)則骨質(zhì)疏松大鼠模型制備成功。腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉所有大鼠后,右側(cè)股骨外側(cè)切取縱向切口,分離暴露并鋸斷于右側(cè)股骨近端1/3部位,克氏針行髓腔內(nèi)固定,即建立骨折模型,Sham組不鋸斷右側(cè)脛骨。將建模成功的大鼠分為Model組、Cordycepin組、Cordycepin+COX-2抑制劑組(NS-398組),每組10只。Cordycepin組大鼠每日腹腔注射10 mg/kg的Cordycepin[5],Cordycepin+NS-398組[7]每日給予10 mg/kg的Cordycepin與10 mg/kg的NS-398腹腔注射,Sham組與Model組大鼠給予等量的生理鹽水,連續(xù)給藥8周。

1.2.2標(biāo)本處理與采集:末次給藥24 h后,采用X射線對各組大鼠股骨骨折處攝片,評估骨折愈合情況;麻醉處死大鼠,心臟采血,3 000 r/min離心15 min分離血清,-20 ℃保存。分離右側(cè)股骨,選取其中5只大鼠的股骨組織使用甲醛固定后,EDTA溶液脫鈣4周,石蠟包埋。另外5只大鼠股骨組織冷凍保存。

1.2.3放射性(X線)檢查:經(jīng)X光掃描右側(cè)骨折股骨,觀察骨折愈合情況后,并進行X光片評分[8]。采用雙能X射線骨密度儀(型號:InAlyzer,韓國MEDIKORS公司)檢測骨密度(BMD)。

1.2.4生物力學(xué)檢測:取右側(cè)股骨,拆除內(nèi)固定物(克氏針)后,將骨折的股骨雙側(cè)固定。使用力學(xué)測試裝置通過三點彎曲試驗(20 mm跨度,1 mm/min)評估每組的生物力學(xué)特性。以骨痂處為加載點,記錄最大負(fù)荷、剛度。

1.2.5骨組織病理學(xué)觀察:股骨組織經(jīng)4 %多聚甲醛固定,用磷酸鹽緩沖液漂洗后,加入EDTA-2Na溶液置于4 ℃冰箱脫鈣1個月,經(jīng)常規(guī)脫水處理后,石蠟包埋,將石蠟包埋的骨組織切成4 μm的切片,脫蠟后,采用蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察骨折處骨組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6血清ALP、CTX-Ⅰ、OC水平檢測:按照試劑盒說明書,采用ELISA法檢測血清ALP、CTX-Ⅰ、OC水平。

1.2.7骨組織COX-2、PGE2、cAMP水平檢測:取冷凍股骨組織,按照質(zhì)量體積比1∶9的比例加入生理鹽水,充分研磨后,12 000 r/min 離心15 min,采集上清液,ELISA法檢測上清液中COX-2、PGE2、cAMP水平。

1.2.8免疫組化法檢測骨組織COX-2、VEGF表達(dá):取骨組織石蠟切片,加入胰蛋白酶進行抗原修復(fù),采用5 %山羊血清封閉1 h,加入COX-2、VEGF抗體(1∶100),4 ℃孵育過夜,加入酶標(biāo)羊抗兔二抗(1∶200),37 ℃孵育2 h,DAB顯色,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照,細(xì)胞中棕黃色顆粒為陽性表達(dá),采用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析,測定光密度值量化COX-2、VEGF陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨折愈合情況

Sham組大鼠骨折處未見骨折線;Model組骨折線明顯,骨折處見少量骨痂,X光片評分較Sham組顯著降低(P<0.05);Cordycepin組可見較多骨性骨痂連接于骨折端,骨折線模糊不清,X光片評分較Model組顯著升高(P<0.05);與Cordycepin組比較,Cordycepin+NS-398組骨痂形成較小,骨折線不清晰,X光片評分顯著降低(P<0.05),見表1與圖1。

圖1 X光線下觀察各組大鼠骨折愈合情況

表1 各組大鼠X光片評分比較

2.2 各組大鼠股骨BMD比較

與Sham組比較,Model組大鼠BMD顯著降低(P<0.05);與Model組比較,Cordycepin組BMD顯著升高(P<0.05);與Cordycepin組比較,Cordycepin+NS-398組BMD顯著降低(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠BMD比較

2.3 各組大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)比較

與Sham組比較,Model組大鼠骨最大負(fù)荷與剛度顯著降低(P<0.05);與Model組比較,Cordycepin組大鼠骨最大負(fù)荷與剛度顯著升高(P<0.05);與Cordycepin組比較,Cordycepin+NS-398組大鼠骨最大負(fù)荷與剛度顯著降低(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)比較

2.4 各組大鼠骨折處骨組織病理變化

Sham組大鼠骨組織結(jié)構(gòu)清晰,排列整齊,骨小梁形態(tài)完整且數(shù)量較多;Model組大鼠骨折處有少量骨細(xì)胞和新生骨組織,骨小梁數(shù)量減少且間距增大,并可見炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象;Cordycepin組大鼠骨組織骨小梁數(shù)量明顯增加,骨折處骨細(xì)胞數(shù)量增多,新生骨組織增加,炎性細(xì)胞浸潤減少;Cordycepin+NS-398組較Cordycepin組骨小梁和骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少,骨小梁間距增加,見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠股骨組織病理變化(200×)

2.5 各組大鼠血清ALP、CTX-Ⅰ、OC水平比較

與Sham組比較,Model組大鼠血清CTX-Ⅰ水平顯著升高,ALP、OC水平顯著降低(P<0.05);與Model組比較,Cordycepin組大鼠血清CTX-Ⅰ水平顯著降低,ALP、OC水平顯著升高(P<0.05);與Cordycepin組比較,Cordycepin+NS-398組血清CTX-Ⅰ水平顯著升高,ALP、OC水平顯著降低(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠血清ALP、CTX-Ⅰ、TRAP、OC水平比較

2.6 各組大鼠骨組織COX-2、PGE2、cAMP水平比較

與Sham組比較,Model組大鼠骨組織COX-2、PGE2、cAMP水平顯著降低(P<0.05);與Model組比較,Cordycepin組大鼠骨組織COX-2、PGE2、cAMP水平顯著顯著升高(P<0.05);與Cordycepin組比較,Cordycepin+NS-398組大鼠骨組織COX-2、PGE2、cAMP水平顯著降低(P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠骨組織COX-2、PGE2、cAMP水平比較

2.7 各組大鼠骨組織COX-2、VEGF表達(dá)

與Sham組比較,Model組大鼠骨組織COX-2、VEGF表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與Model組比較,Cordycepin組大鼠骨組織COX-2、VEGF表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與Cordycepin組比較,Cordycepin+NS-398組鼠骨組織COX-2、VEGF表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見圖3與表6。

圖3 免疫組化檢測骨組織COX-2、VEGF表達(dá)(400×)

表6 各組大鼠骨組織COX-2、VEGF表達(dá)

3 討論

骨折是骨質(zhì)疏松的常見并發(fā)癥,研究發(fā)現(xiàn),女性進入絕經(jīng)期,由于體內(nèi)雌激素減少,加速骨吸收,引起骨吸收與骨生成失衡,影響骨折愈合[9-10]。迄今為止,市面上有許多抗骨質(zhì)疏松癥藥物,包括甲狀旁腺素、雙膦酸鹽和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑。盡管這些藥物有效,但長期使用會產(chǎn)生不良反應(yīng),如腎功能損害和乳腺癌發(fā)病率增加。雌激素在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中起著至關(guān)重要的作用,雌激素替代療法是一種很有前途的治療選擇。然而,雌激素會增加女性生殖系統(tǒng)癌癥的風(fēng)險,這阻礙了雌激素替代療法的全面實施。據(jù)報道,植物雌激素對骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折有治療作用,且安全性高,如大豆異黃酮[11]、淫羊藿總黃酮[12]。

蟲草素有多種藥理活性,如抑制腫瘤生長、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和抑制氧化應(yīng)激,抗炎、抗纖維化和神經(jīng)保護活性,在多種疾病均有應(yīng)用[13]。蟲草素還可抑制軟骨細(xì)胞分化,促進成骨細(xì)胞分化,抑制炎癥反應(yīng),改善骨關(guān)節(jié)炎癥狀[14]。Li等[15]研究顯示,在閉合性股骨骨折大鼠模型中,蟲草素促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成骨并通過缺氧,改善大鼠骨折的放射學(xué)參數(shù)和機械性能,加速骨折愈合。此外,有研究發(fā)現(xiàn),冬蟲夏草中含有的蟲草素,具有補充雌激素的作用,可以防止雌激素缺乏引起的骨質(zhì)流失,對去卵巢后的骨質(zhì)疏松具有特定的保護作用,是治療骨質(zhì)疏松癥的良好天然候選藥物[16]。然而,蟲草素在雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松性骨折中的作用尚未得到研究。

ALP是一種由成骨細(xì)胞分泌的蛋白,是骨礦化所必需的物質(zhì),OC是反映成骨細(xì)胞活動(包括骨形成和更新)的血清標(biāo)志物,兩者均為成骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物,在骨折愈合過程中發(fā)揮重要作用[17-18]。CTX-Ⅰ是骨吸收的生物標(biāo)志物,當(dāng)骨代謝正常時,其在血液中能檢測到的含量極微,而當(dāng)破骨細(xì)胞活性增強時,血液中CTX-Ⅰ水平明顯升高[19]。此外,骨骼的機械強度是與骨折風(fēng)險相關(guān)的最重要參數(shù)。本研究通過摘除雌性大鼠卵巢后建立骨質(zhì)疏松性骨折模型,發(fā)現(xiàn)蟲草素可明顯促進骨折部位愈合,X線檢查可見骨性骨痂連接于骨折端,骨折線模糊不清,X光片評分、BMD、骨痂最大負(fù)荷與剛度均較模型大鼠升高,病理學(xué)證實蟲草素可促進骨組織新生,且蟲草素可增加血清中成骨因子(ALP、OC)水平,降低骨吸收標(biāo)志物CTX-I水平,表明蟲草素可促進骨形成,促進骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合。

COX-2/PGE2信號通路在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡、骨代謝與轉(zhuǎn)換等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[20]。PGE2經(jīng)過COX-2催化形成后,與G蛋白受體家族EP結(jié)合,促使cAMP水平升高,cAMP水平升高進一步刺激COX-2、VEGF表達(dá)增加,VEGF可促進新生血管的生成及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移,加速軟骨的鈣化及骨組織的改建[21-22]。研究顯示,在老年小鼠骨折中,COX-2的缺乏會導(dǎo)致骨折愈合延遲[23];董萬濤等[24]發(fā)現(xiàn),在新西蘭大耳白兔尺骨3 mm骨缺損模型中,消定膏可通過激活COX-2/PGE2/cAMP信號通路,促使骨折的愈合及骨重建。本研究結(jié)果顯示,在骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型中,骨組織COX-2、PGE2、cAMP、VEGF表達(dá)水平降低;使用蟲草素治療后,大鼠骨組織COX-2、PGE2、cAMP、VEGF表達(dá)水平顯著升高,推測蟲草素促進骨折愈合的作用可能與COX-2/PGE2信號通路的激活有關(guān)。為了驗證此推測,本研究在蟲草素干預(yù)的基礎(chǔ)上,使用COX-2抑制劑NS-398與蟲草素共同治療大鼠,發(fā)現(xiàn)NS-398可部分逆轉(zhuǎn)蟲草素對骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的促進作用。提示蟲草素可能通過激活COX-2/PGE2信號通路,促進骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合。

綜上所述,蟲草素可能通過激活COX-2/PGE2信號通路,促進骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合。此外,有研究報道稱COX-2催化產(chǎn)生的PGE2可直接刺激成骨細(xì)胞分化,并通過刺激成骨細(xì)胞中的RANKL間接刺激破骨細(xì)胞分化[25]。蟲草素對骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的影響是否與COX-2/PGE2信號通路介導(dǎo)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化有關(guān),有待進一步分析。