趙麗洲 勾蓉 王晨 涂小林*

1. 重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院骨發(fā)育與再生實驗室,重慶 400016

2. 重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院體檢中心,重慶 400030

3. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院,重慶 400038

破骨細胞來源于骨髓中的造血干細胞,是由單核細胞/巨噬細胞通過融合形成具有骨吸收功能的多核巨細胞[1],其生理分化需要TNF超家族成員NF-κB配體受體激活劑(receptor activator of nucler factor-κB ligand,RANKL)的介導(dǎo)[2], RANKL與破骨前體細胞膜上的κB受體活化因子(receptor activator of nucler factor-κB,RANK)結(jié)合,通過銜接NF-κB通路導(dǎo)致破骨細胞生成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的誘導(dǎo)和激活[3-5],調(diào)控破骨細胞生成和分化。RANKL主要由骨細胞和成骨細胞分泌[6-7],與促進破骨前體細胞增殖的巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)聯(lián)合使用可以在體外誘導(dǎo)具有骨吸收能力的破骨細胞的形成。

骨細胞是破骨分化必需因子RANKL的主要來源細胞。研究表明,骨細胞中RANKL基因敲除導(dǎo)致小鼠松質(zhì)骨量大增,且同時能增加成骨功能不全小鼠的松質(zhì)骨[8]。體外實驗也驗證,在三維羥基磷灰石/磷酸三鈣支架中,增加靜水壓導(dǎo)致骨細胞樣細胞系MLO-Y4中RANKL高表達,并促進破骨前體細胞系RAW264.7成破骨細胞[9]。前期實驗發(fā)現(xiàn)骨細胞Wnt信號激活小鼠破骨細胞增加,骨吸收能力增強[10],骨細胞的脫細胞基質(zhì)修飾3D打印PCL支架,促進成骨分化、礦化與破骨細胞生成[11]。由此可見,在生理狀態(tài)下,骨細胞具有重要的破骨細胞調(diào)控功能。

骨細胞被包埋在堅硬的礦化骨基質(zhì)中,較難與其他細胞通過直接接觸傳遞信號,所以骨細胞衍生因子的產(chǎn)生與傳遞方式是其調(diào)控破骨細胞的關(guān)鍵。外泌體是一種圓形膜結(jié)合的囊泡,由細胞分泌到細胞外基質(zhì)中,具有與衍生細胞相同的膜成分和一些細胞質(zhì)內(nèi)容物如脂類、蛋白質(zhì)、核酸組成的DNA和RNA等,通過囊泡膜和細胞膜的融合將分泌因子從相關(guān)細胞轉(zhuǎn)移到循環(huán)途徑中的其他細胞[12-15]。

研究顯示,骨細胞外泌體通過miR-181b-5P激活蛋白激酶B(Akt)促進人牙周膜干細胞的成骨分化[16]。肌肉生長抑制素處理的骨細胞其外泌體通過miR-218阻斷Runx2和Wnt途徑以抑制成骨分化[17]。成骨細胞外泌體通過RANKL-RANK信號激活Nfatc1核位移促進破骨細胞分化[18]。但骨細胞來源的外泌體對破骨細胞的作用研究甚少。本研究擬通過提取骨細胞樣細胞MLO-Y4來源外泌體,探討其對破骨細胞分化的影響及分子機制。

1 材料和方法

1.1 動物實驗

4至6周齡C57BL/6J野生型小鼠(WT)獲自重慶醫(yī)科大學(xué)動物設(shè)施(中國)。所有動物實驗均經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)動物護理與使用委員會批準。

1.2 試劑

胎牛血清(FBS)購自加拿大Wisent公司。小鼠RANKL和M-CSF重組蛋白購自美國PeproTech公司。CD63和Alix抗體購自中國萬類生物科技有限公司。α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;青、鏈霉素及胰酶購自中國碧云天公司;TRIzol、反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR試劑盒購自中國艾科瑞公司;PCR引物來自生上海工生物工程股份有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

1.3.1骨細胞系MLO-Y4:骨細胞系MLO-Y4細胞由美國 Lynda Bonewald 教授贈予,在含有10 %FBS和1 %青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),0.25 %的胰酶消化傳代。

1.3.2骨髓單核巨噬細胞:從C57BL/6J野生小鼠股骨和脛骨提取原代骨髓細胞,在含有10 %FBS和1 %青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d,將非粘附細胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中,加入30 ng/mL M-CSF重組蛋白繼續(xù)培養(yǎng)3 d,通過胰蛋白酶消化收集粘附細胞即骨髓巨噬細胞(bone marrow macrophages,BMM),作為破骨前體細胞使用[19]。

1.4 外泌體的分離和鑒定

通過文獻報道的方法提取細胞外泌體[20-21]。使用前將FBS 100 000 g超速離心18 h以去除牛外泌體[22]。收集MLO-Y4的48 h條件培養(yǎng)在4 ℃下依次300 g離心10 min, 2 000 g離心10 min,10 000 g離心30 min去除細胞和細胞碎片,然后通過低溫超速離心機(Beckman Coulter,美國)100 000 g離心70 min以收集外泌體。無菌PBS重懸外泌體沉淀,用于細胞培養(yǎng)和動物實驗。外泌體的蛋白含量通過BCA蛋白檢測試劑盒(Beyotime,中國上海)檢測。透射電子顯微鏡鑒定純化的外泌體大小及形態(tài),Western blot鑒定外泌體標志蛋白表達。

1.5 細胞共培養(yǎng)和TRAP染色

BMM以4×104個/孔的密度混勻接種于48孔板,加入M-CSF(30 ng/mL)+RANKL(30 ng/mL)或M-CSF(30 ng/mL)+RANKL(30 ng/mL)+MLO-Y4-Exo(15 μg/mL)于共培養(yǎng)體系中。培養(yǎng)液每3 d更換1次。5～9 d后,顯微鏡普通光源鏡檢可見大的多核破骨細胞在孔板中形成,即可收獲細胞。細胞用4 %甲醛溶液固定10 min,然后蒸餾水洗2次并晾干,根據(jù)TRAP染色試劑盒說明書(Sigma-Aldrich,美國)對細胞進行染色,顯微鏡鏡檢并計數(shù)每孔TRAP陽性(紅色)細胞數(shù)量。

1.6 RNA 提取及qPCR實驗

使用TRIzol試劑提取細胞RNA,測定濃度后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞,中國)說明書進行反轉(zhuǎn)錄,獲得的 cDNA作為 qRT-PCR 反應(yīng)的模板[23]。相對表達量采用2-ΔCt分析, 以CHoB的表達水平作為標準。所用引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.7 細胞免疫熒光(IF)檢測

單核巨噬細胞細胞用4 %多聚甲醛固定10 min, 然后用0.25 %Triton X-100透化30 min,5 %牛血清白蛋白封閉30 min后與RANKL一抗孵育過夜,然后用Cy3標記的羊抗兔IgG抗體(cell signaling technology,美國)室溫孵育1 h。隨后,用DAPI(碧云天,中國)標記細胞核,熒光顯微鏡觀察RANKL表達量。

1.8 小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染實驗

RANKL小干擾RNA質(zhì)粒(序列:GGATGAAACAAGCCTTTCA)構(gòu)建于RIBOBIO公司,溶解于無菌ddH2O至終濃度20 μmol/L,與Zeta Life轉(zhuǎn)染試劑以體積1∶1比例混勻靜止10～15 min后加入MLO-Y4細胞培養(yǎng)皿,轉(zhuǎn)染24 h 后對細胞正常換液,48 h后Cy3-siRNA轉(zhuǎn)染細胞通過熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率,RANKL-siRNA轉(zhuǎn)染細胞進行RNA檢測或收集外泌體。

1.9 免疫組織化學(xué)檢測(IHC)

4～6周齡C57BL/6J野生型小鼠顱骨皮下注射PBS和MLO-Y4-Exo連續(xù)5 d,在第6 天收獲小鼠顱骨甲醇固定后脫鈣[24-25]。脫水后將顱骨垂直于矢狀縫包埋在石蠟中,并切成5 μm厚的切片。切片脫蠟后分別用于免疫組織化學(xué)和TRAP染色,染色方法如報道所述[11]。切片通過OsteoMeasure TM軟件對TRAP陽性細胞進行分析計數(shù)。

1.10 Western blot

根據(jù)上述方法提取MLO-Y4外泌體,加入適量的 RIPA 裂解液,然后在冰上進行超聲破碎。按照BCA試劑盒說明書測量蛋白濃度,加入上樣緩沖液,金屬浴100 ℃,8 min。使用試劑盒配膠,每孔上樣 30 μg。上層膠采用 70 V 恒壓,樣品進入下層膠后采用 120 V恒壓電泳,210 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h 后,使用5 %脫脂奶粉于室溫搖床封閉 2 h。然后在4 ℃孵育一抗過夜,第 2 天使用 TBST洗膜,室溫下孵育二抗2 h,TBST 洗膜后顯影。

1.11 ELISA實驗

將上述方法獲得的MLO-Y4外泌體,使用RIPA裂解液重懸后利用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測濃度。提前將ELISA試劑盒在室溫平衡30 min,根據(jù)蛋白濃度,每孔加相同蛋白量,然后用緩沖液補充至相同體積,封板膜蓋住反應(yīng)板,37 ℃水浴鍋溫育60 min,然后用洗滌液洗滌5次,然后將底物A和B以1∶1混合后加入反應(yīng)孔中,37 ℃水浴鍋溫育15 min,加入終止液,在酶標儀450 nm波長上測量吸光度,采用四參數(shù)Logistic曲線擬合,創(chuàng)建標準曲線方程。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MLO-Y4來源的外泌體的分離和鑒定

外泌體的鑒定依賴于報道的標準[26],外泌物的大小范圍為30至200 nm,在透射電子顯微鏡下呈杯狀形態(tài),具有特定的標記蛋白如CD63和Alix[27-29]。在我們的研究中,從MLO-Y4細胞培養(yǎng)液中分離的外泌體在離心管中呈白色沉積物(圖1A)。在透射電子顯微鏡觀察下呈圓形,直徑約100～150 nm,具有完整的膜脂雙層,并顯示杯狀形態(tài)(圖1B)。Western blot實驗顯示MLO-Y4-Exo表達CD63和Alix蛋白(圖1C)。

注:A:外泌體離心沉淀圖,B:透射電子顯微鏡觀察外泌體;C:Western blot檢測外泌體標志蛋白表達。

2.2 MLO-Y4來源的外泌體促進破骨細胞分化

MLO-Y4-Exo與BMM共培養(yǎng)5～9 d后進行TRAP染色(圖2A),MLO-Y4-Exo組TRAP陽性的單核細胞和大于三個核的破骨細胞均增多(圖2B),qPCR顯示MLO-Y4-Exo組細胞的破骨細胞標志基因表達增加(圖2C),說明MLO-Y4-Exo促進BMM成破骨細胞分化。

注:A:細胞TRAP染色;B:TRAP陽性細胞(紅色)計數(shù);C:qPCR檢測破骨細胞標志基因mRNA表達量。n=3, 與 Control比較,*P<0.05。

2.3 MLO-Y4來源的外泌體在體內(nèi)促進破骨細胞的形成

在小鼠頂骨皮下連續(xù)注射5 d外泌體后,收獲小鼠顱骨用于TRAP染色(圖3A),并通過OsteoMetrics對破骨細胞進行骨組織形態(tài)學(xué)定量分析。在注射MLO-Y4-Exo的小鼠的顱骨中發(fā)現(xiàn)了豐富的破骨細胞,單位組織面積破骨細胞數(shù)量(N.Oc/T.Ar)、單位骨周長破骨細胞數(shù)量(N.Oc/B.Pm)和單位骨表面的破骨細胞表面(Oc.S/BS)均增加(圖3B)。

注:A:組織TRAP染色;B:破骨細胞計數(shù)。n=5, 與Control比較,*P<0.05。

2.4 MLO-Y4來源的外泌體傳遞RANKL

原代小鼠BMM細胞的RANKL免疫熒光染色結(jié)果顯示,PBS處理組BMM中紅色熒光較少,RANKL表達量極低,MLO-Y4-Exo處理組BMM中RANKL含量增加(圖4A)。小鼠顱骨切片免疫組化檢測顯示,與注射PBS的組相比,注射MLO-Y4-Exo的小鼠顱骨RANKL表達更高(圖4B),這解釋了MLO-Y4-Exo治療組顱骨破骨細胞增多的原因。

注:A:免疫熒光染色檢測BMM細胞中RANKL表達;B:骨組織切片免疫組化染色檢測RANKL表達。

2.5 MLO-Y4來源的外泌體通過RANKL促進破骨細胞分化

siRNA-FAM質(zhì)粒處理MLO-Y4細胞48 h后,在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(圖5A)。siRNA-RANKL轉(zhuǎn)染MLO-Y4后,qPCR檢測顯示細胞RANKL mRNA表達降低(圖5B)。獲取MLO-Y4細胞外泌體,采用RIPA裂解液裂解外泌體囊泡膜,然后采用ELISA測量RANKL含量,發(fā)現(xiàn)siRNA-RNAKL敲低MLO-Y4中RANKL基因后,外泌體囊泡中RANKL蛋白含量降低(圖5C)。細胞外泌體(siRANKL-MLO-Y4-Exo)用于BMM培養(yǎng),TRAP染色顯示siRANKL-MLO-Y4-Exo處理組較MLO-Y4-Exo組和siNC-MLO-Y4-Exo組的TRAP陽性的單核細胞和大于三個核的破骨細胞均減少(圖5D～E)。

注:A:熒光顯微鏡檢測FAM siRNA轉(zhuǎn)染MLO-Y4細胞的效率;B:qPCR檢測RANKL si-RNA的沉默效率;C:ELISA檢測MLO-Y4外泌體中RANKL蛋白的濃度;D:TRAP染色;E:TRAP陽性細胞(紅色)計數(shù)。n=3, 與MLO-Y4-Exo組比較,*P<0.05;與siNC-MLO-Y4-Exo組比較,#P<0.05。

3 討論

骨細胞是一種古老的細胞,最早發(fā)現(xiàn)存在于奧陶紀無頜魚類中,是骨骼中數(shù)量最多的細胞,因為骨細胞包埋在堅硬的礦化基質(zhì)中,極難接近和獲取,也是研究最少的細胞。自從骨細胞從鈣化骨基質(zhì)中的分離成為可能[11],骨細胞相關(guān)的研究越來越多,這些細胞的功能才逐漸為人所知。本研究通過提取骨細胞樣細胞MLO-Y4的外泌體,在體外實驗證實其具有促進破骨細胞分化的能力,小鼠顱骨皮下注射MLO-Y4-Exo也顯示破骨細胞數(shù)量增加。共培養(yǎng)細胞RANKL免疫熒光和顱骨組織免疫組化結(jié)果都證實增多的破骨細胞數(shù)量和RANKL高表達有關(guān),通過小干擾RNA技術(shù)降低MLO-Y4細胞中RANKL表達,MLO-Y4-Exo對破骨細胞分化的促進作用也隨之被逆轉(zhuǎn),說明MLO-Y4-Exo通過向破骨前體細胞傳遞RANKL促進其向破骨細胞分化。

MLO-Y4是第一個應(yīng)用于骨細胞樣研究的細胞系,從在骨鈣素啟動子控制下表達永生化T抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得高度機械敏感性。截至2019年已有270多篇出版物使用MLO-Y4細胞系來研究骨細胞功能[30]。MLO-Y4細胞同原代骨細胞,高表達RANKL,具有支持破骨細胞形成和激活的功能[9]。通過對無骨細胞的轉(zhuǎn)基因小鼠血漿外泌體和MLO-Y4細胞衍生外泌體之間的miRNA表達水平的比較,證實循環(huán)骨細胞的外泌體中包含的miRNA在MLO-Y4細胞外泌體中富集[31]。所以,本研究選用的MLO-Y4細胞具有骨細胞代表性。

本研究的創(chuàng)新點之一是證實了骨細胞外泌體對破骨細胞分化的調(diào)控作用。破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細胞介導(dǎo)的骨形成處于耦合狀態(tài)以維持骨穩(wěn)態(tài),成骨細胞和破骨細胞之間的平衡關(guān)系對健康骨骼的發(fā)展至關(guān)重要,骨細胞作為骨骼中含量最多、壽命最長的細胞,其對成骨細胞和破骨細胞的雙重調(diào)控作用具有重要意義。本課題組前期研究顯示骨細胞脫細胞基質(zhì)不僅具有促骨生成的作用,同時具有促進破骨細胞分化的作用[11],這有利于骨健康,在吸收舊骨同時形成新骨,維持骨骼健康狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)了骨細胞通過外泌體調(diào)控破骨細胞,進而證明骨細胞對骨穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控作用。

其次,骨細胞深埋于骨基質(zhì)中,骨細胞如何調(diào)控破骨細胞還缺乏相關(guān)證據(jù)。一項研究表明,衰老導(dǎo)致的皮質(zhì)骨流失中,骨細胞分泌的RANKL是必要條件,展現(xiàn)了骨細胞對破骨細胞直接調(diào)控的證據(jù)[32]。盡管有實驗證實骨細胞分泌RANKL,對破骨細胞的調(diào)控起到至關(guān)重要的作用[33];但骨細胞深埋于骨基質(zhì)中,骨細胞分泌的RANKL如何調(diào)控破骨細胞還未闡明。但有研究證明,骨細胞嵌在腔隙-小管系統(tǒng)中,小管直徑約210～260 nm[34-35]。所以骨細胞分泌的RANKL可能通過外泌體的方式,經(jīng)過骨細胞小管系統(tǒng),帶出骨基質(zhì),然后參與周圍破骨細胞調(diào)控。這一新的調(diào)控方式為防治骨質(zhì)疏松及骨代謝機制提供有力基礎(chǔ)和新的研究思路。

本研究證實,骨細胞系MLO-Y4來源的外泌體通過向破骨前體細胞傳遞促破骨細胞分化因子RANKL來促進破骨細胞生成。