張高林 張成俊 夏亞一 韻向東 姜金 敏思聰

1. 甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州730050

2. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院,甘肅 蘭州 730030

軟骨是存在于肢體關(guān)節(jié)表面的一種結(jié)締組織,其主要由軟骨細胞、基質(zhì)及膠原纖維和軟骨膜構(gòu)成,具有協(xié)助關(guān)節(jié)無摩擦運動和承受壓力負荷的作用[1]。由于軟骨內(nèi)無直接的血液及淋巴供應(yīng),關(guān)節(jié)軟骨極易發(fā)生損傷進而引起骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)等關(guān)節(jié)退行性病變,其中以膝關(guān)節(jié)軟骨損傷最為多見,髖關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)次之。據(jù)最新的數(shù)據(jù)報道,全球范圍內(nèi)超過30 %以上的人因關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生損傷導(dǎo)致相關(guān)病患嚴重影響正常生活,且發(fā)病率呈不斷上升趨勢[2-3]。先前的研究雖然已在分子層面上對關(guān)節(jié)軟骨損傷的原因做出報道,但關(guān)于軟骨損傷發(fā)生及預(yù)后的分子間調(diào)控機制了解并不充分[4]。近年來,包括長鏈非編碼 (long noncoding RNA,lncRNA )、環(huán)狀 RNA (circle RNA,circRNA )、微小 RNA (microRNA,miRNA )在內(nèi)的非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)對關(guān)節(jié)軟骨的影響引起了廣大研究人員的極大興趣,而由此3者及信使RNA(message RNA, mRNA)和假基因構(gòu)成的競爭性內(nèi)源RNA(ceRNAs)網(wǎng)絡(luò)倍受關(guān)注,該機制可影響相關(guān)基因的表達,對關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生重要影響。本文就有關(guān)ceRNAs在關(guān)節(jié)軟骨中的作用機制及潛在性應(yīng)用展開綜述,以期為關(guān)節(jié)軟骨損傷的防治提供新的思路和方向。

1 ceRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的組成及機制

ceRNAs網(wǎng)絡(luò)是一種全新的基因表達調(diào)控機制,由Salmena 等[5]在2011年首先提出,相比與其他調(diào)控機制,ceRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更為精細和復(fù)雜。該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要由miRNA、lncRNA、circRNA以及mRNA和假基因構(gòu)成,其中核心分子為miRNA,lncRNA、circRNA及假基因可作為“海綿”吸附 miRNA 并在結(jié)合位點與之結(jié)合,從而對mRNA的轉(zhuǎn)錄和表達產(chǎn)生影響[6-7]。miRNA是由大約20～22個核苷酸組成,在基因的轉(zhuǎn)錄及表達過程中具有重要作用的非編碼RNA,研究發(fā)現(xiàn),機體內(nèi)超過50 %的蛋白質(zhì)編碼基因受其調(diào)控,其通過與靶基因mRNA上的3’-非翻譯區(qū)上的miRNA反應(yīng)元件(miRNA response elements, MRE)互補堿基配對,進而降解靶基因或在轉(zhuǎn)錄后水平上對抑制靶基因的翻譯,在細胞內(nèi)構(gòu)建了全方位多層次的基因表達調(diào)控系統(tǒng),參與細胞分裂、增殖和凋亡等過程[8]。lncRNA是一類長度超過 200 個核苷酸并高度結(jié)構(gòu)化的RNA分子,具有非編碼蛋白質(zhì)的特性,其存在于細胞核和細胞質(zhì)中,主要通過直接與脫氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白質(zhì)相互作用,成為機體眾多重要生理和病理過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,雖然lncRNA不具備編碼蛋白質(zhì)的功能,但其含有與編碼基因轉(zhuǎn)錄物一樣的MREs,因此可與mRNA競爭性結(jié)合相同的miRNA產(chǎn)生相關(guān)調(diào)控作用[9-10]。存在于絕大數(shù)生物中的circRNA是一種特殊結(jié)構(gòu)的非編碼RNA,由于其不存在3′-端與 5′-端并通過外顯子環(huán)化或內(nèi)含子環(huán)化將3′和5′末端連接形成完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu),從而不易被核酸外切酶影響,相對于線狀RNA更具穩(wěn)定性,在疾病的發(fā)展過程中具有關(guān)鍵作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA中富含miRNA結(jié)合位點,可通過與靶基因競爭性結(jié)合影響靶基因的表達[12]。假基因又稱偽基因,雖然它與正?；蛳嗨?但在結(jié)構(gòu)上存在缺失或插入和外顯子內(nèi)含子鄰接區(qū)順序變化,以及在5′端啟動區(qū)域的缺陷等致使其不能形成正常的mRNA,但其轉(zhuǎn)錄物可競爭性結(jié)合miRNA靶基因并對其表達進行干預(yù)[13]。

MRE是miRNA與mRNA結(jié)合位點,理論上任何含有與 miRNA靶基因3′-非翻譯區(qū)上相同MRE的各種轉(zhuǎn)錄本均可通過競爭性結(jié)合相同的 miRNA 來調(diào)控靶 mRNA 的表達水平,從而構(gòu)成龐大的ceRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 ceRNAs在關(guān)節(jié)軟骨中的作用機制

2.1 lncRNA 作為 ceRNA 與關(guān)節(jié)軟骨

既往的研究已經(jīng)報道lncRNA作為一種重要的生理和病理過程調(diào)節(jié)因子廣泛參與多種骨與關(guān)節(jié)疾病的發(fā)病過程,但其具體的調(diào)控機制仍不完全清楚,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,研究人員發(fā)現(xiàn)lncRNA作為一種ceRNA通過競爭性結(jié)合miRNA對關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖、凋亡以及細胞外基質(zhì)降解產(chǎn)生影響[14-15]。

2.1.1lncRNA與軟骨細胞:Wang等[16]通過構(gòu)建關(guān)節(jié)軟骨損傷模型研究lncRNA-HOTAIR對軟骨細胞的影響及作用機制時發(fā)現(xiàn),lncRNA-HOTAIR在該模型中表達上調(diào)并加劇了軟骨細胞的凋亡和炎癥反應(yīng),同時發(fā)現(xiàn)lncRNA-HOTAIR可作為miR-1277-5p的海綿對軟骨細胞凋亡和炎癥產(chǎn)生影響。Luo等[17]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA-MFI2-AS1在損傷的軟骨細胞中表達增加,其可加速軟骨細胞的凋亡等過程,而沉默lncRNA-MFI2-AS1可抑制軟骨細胞凋亡發(fā)生,其機制可能為lncRNA-MFI2-AS1沉默后miR-130a-3p水平增加與靶基因轉(zhuǎn)錄因子4(TCF4)共同作用抑制軟骨細胞發(fā)生損傷。Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA-TNFSF10的高表達可誘導(dǎo)軟骨細胞增殖和炎癥反應(yīng)的發(fā)生,而此過程可部分被miR-376-3p所逆轉(zhuǎn),原因在于lncRNA-TNFSF10作為一種ceRNA與miR-376-3p存在負相關(guān)關(guān)系。Ni等[19]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA-LUADT1可與miR-34a相互作用對軟骨細胞的凋亡產(chǎn)生影響,當miR-34a含量增多時其可與下游調(diào)節(jié)因子SIRT1結(jié)合促進軟骨細胞的凋亡,而lncRNA-LUADT1與SIRT1過表達時軟骨細胞凋亡率下降,表明lncRNA-LUADT1可通過miR-34a/SIRT1軸調(diào)控軟骨細胞的凋亡。Jiang等[20]在研究軟骨損傷中l(wèi)ncRNA-SNHG5的作用及機制時發(fā)現(xiàn),lncRNA-SNHG在損傷的軟骨細胞中低表達,同時發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p表達上調(diào),當敲除lncRNA-SNHG5時增強了軟骨細胞的凋亡,通過救援實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA-SNHG5可通過海綿化miR-10a-5p抑制軟骨細胞的凋亡,由此表明lncRNA-SNHG5可作為ceRNA對軟骨細胞分化起調(diào)控作用。

2.1.2lncRNA與軟骨細胞外基質(zhì):Liu等[21]在探討lncRNA-MALAT1/miR-145在軟骨損傷過程中的作用時發(fā)現(xiàn),lncRNA-MALAT表達上調(diào),miR-145下調(diào),lncRNA-MALAT1的過度表達促進了軟骨細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)ECM的降解,而當上調(diào)miR-145的表達時抵消了lncRNA-MALAT的作用,最終表明調(diào)控lncRNA-MALAT1/miR-145軸可能是防治關(guān)節(jié)軟骨損傷的一種方法。Chen等[22]在研究lncRNA-MEG3對軟骨細胞ECM降解中的調(diào)節(jié)功能和潛在分子機制時發(fā)現(xiàn),當lncRNA-MEG3的表達不足時可加速ECM發(fā)生降解及細胞凋亡,同時發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)lncRNA-MEG3可以作為miR-93的ceRNA激活生長因子-β(TGF-β)信號通路,進而調(diào)控軟骨細胞ECM的降解等過程。Tang等[23]研究發(fā)現(xiàn),LncRNA-TUG1可通過LncRNA-TUG1/miR-195/MMP-13軸調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)細胞外基質(zhì)的降解,他們發(fā)現(xiàn)lncRNA-TUG1在損傷軟骨中的表達水平高于正常軟骨,lncRNA-TUG1的過度表達降低了miR-195、膠原和聚集蛋白聚糖的表達,但增加了MMP-13的表達加速ECM降解。lncRNA-PCGEM1已被發(fā)現(xiàn)參與了軟骨損傷的發(fā)病過程,然而其對軟骨損傷的分子機制尚未完全闡明,Zeng等[24]研究發(fā)現(xiàn),在損傷的軟骨中l(wèi)ncRNA-PCGEM1存在過度表達,且促進了軟骨細胞ECM的降解及軟骨凋亡,進一步研究發(fā)現(xiàn)其機制為lncRNA-PCGEM1通過競爭抑制miR-142-5p的表達和Runt轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)促進軟骨細胞ECM的降解及軟骨凋亡。Qian等[25]通過RT-qPCR技術(shù)研究評估損傷軟骨組織中l(wèi)ncRNA-LINC00707、miR-330-5p和卵泡刺激素受體(FSHR)表達時發(fā)現(xiàn),lncRNA-LINC00707和FSHR升高,而miR-330-5p降低,高表達的lncRNA-LINC00707及FSHR加速了軟骨細胞凋亡及軟骨細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解,當敲低lncRNA-LINC00707表達時可緩解軟骨的損傷,并發(fā)現(xiàn)lncRNA-LINC00707可作為一種ceRNA通過調(diào)節(jié)miR-330-5p抑制FSHR來減輕軟骨損傷。

綜上,lncRNA在關(guān)節(jié)軟骨中的正常表達對關(guān)節(jié)軟骨的健康至關(guān)重要,當其表達異常時可通過ceRNA機制影響軟骨細胞增殖、凋亡以及加速軟骨細胞外基質(zhì)降解及炎癥反應(yīng)促進軟骨發(fā)生損傷,值得一提的是同一lncRNA可同時影響一種及多種病理過程加速軟骨的損傷。不同lncRNA在軟骨損傷中的作用及機制見表1。

表1 lncRNA作為ceRNA在軟骨損傷中的作用

表2 circRNA作為ceRNA在軟骨損傷中的作用

2.2 circRNA作為 ceRNA 與關(guān)節(jié)軟骨

circRNA在1976年首次被發(fā)現(xiàn),其在生物的生長發(fā)育,疾病進展及診斷標記等方面具有重要作用,2013年因被研究者證實circRNA可作為ceRNA參與基因的表達調(diào)控再次給circRNA的研究提供了新的曙光,隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)circRNA通過競爭性結(jié)合miRNA機制對關(guān)節(jié)軟骨的損傷及改善方面有調(diào)控作用[26-27]。

2.2.1circRNA與軟骨細胞:Zhou等[28]研究發(fā)現(xiàn),circRNA-33186在損傷的軟骨組織中表達明顯上調(diào),而抑制circRNA-33186表達可促進軟骨細胞的增殖和減少凋亡,機制研究表明,circRNA-33186直接結(jié)合并抑制miR-127-5p表達從而增加基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-13)的水平導(dǎo)致軟骨損傷的發(fā)生。Huang等[29]通過定量實時PCR檢測circRNA-0092516在膝關(guān)節(jié)OA患者關(guān)節(jié)組織中的表達時發(fā)現(xiàn)circRNA-0092516表達增加,并發(fā)現(xiàn)circRNA-0092516可與miR-337-3p結(jié)合,通過miR-337-3p/ PTEN基因軸調(diào)控circRNA-0092516表達進而促進軟骨細胞增殖,抑制細胞凋亡改善OA軟骨損傷。Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn),在損傷的關(guān)節(jié)軟骨組織中circRNA-UBE2G1的表達明顯增加,miR-373的表達下調(diào),在機制方面,他們發(fā)現(xiàn)circRNA-UBE2G1作為ceRNA通過調(diào)節(jié)miR-373/HIF-1a軸促進了關(guān)節(jié)軟骨細胞損傷的發(fā)展。Bao等[31]在研究circRNA-FAM160A2/miR-505-3p/SIRT3軸在軟骨損傷中的作用及機制時發(fā)現(xiàn),circRNA-FAM160A2的表達減少,miR-505-3p表達增加,而增加circFAM160A2的表達時可抑制軟骨細胞的凋亡和改善線粒體功能障礙,其機制可能為circRNA-FAM160A2通過靶向miR-505-3p和SIRT3促進軟骨細胞的線粒體穩(wěn)定和細胞凋亡減少。此外Shen等[32]研究發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)軟骨中低表達的circRNA-CDK14可抑制軟骨的凋亡、促進軟骨的增生對關(guān)節(jié)軟骨具有保護作用,同時發(fā)現(xiàn)circRNA-CDK14的保護作用是由通過海綿化miR-125a-5p介導(dǎo)的,由此為軟骨損傷提供了潛在的分子治療策略。

2.2.2circRNA與軟骨細胞外基質(zhì):Li等[33]研究發(fā)現(xiàn),相較于正常軟骨circRNA-0000423在損傷的軟骨組織中表達上調(diào),并發(fā)現(xiàn)其可作為ceRNA海綿化miRNA-27b-3p,通過調(diào)控MMP-13和II型膠原的表達影響關(guān)節(jié)軟骨的正常功能。Wu等[34]研究發(fā)現(xiàn),circRNA-PDE4D在維持關(guān)節(jié)軟骨ECM起著重要作用,在損傷軟骨組織中其表達明顯下調(diào),進而導(dǎo)致包括MMP3、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5等在內(nèi)的促進細胞外基質(zhì)降解的物質(zhì)產(chǎn)生進一步損害正常關(guān)節(jié)軟骨,進一步研究發(fā)現(xiàn)circRNA-PDE4D是作為miR-103a-3p的海綿通過ceRNA機制發(fā)揮其作用。Bai等[35]在研究circRNA-TMBIM6/miR-27A/MMP13軸在關(guān)節(jié)損傷中的作用及機制時發(fā)現(xiàn),circRNA-TMBIM6在受損的關(guān)節(jié)中呈表達上調(diào),circRNA-TMBIM6的過表達降低了miR-27A的表達,而增加MMP13的含量加速軟骨ECM降解加重病情。circRNA-PRKCH已被證明在損傷的軟骨細胞中表達上調(diào),Que等[36]在研究circRNA-PRKCH產(chǎn)生損傷作用分子機制發(fā)現(xiàn),軟骨細胞ECM降解及凋亡與circRNA-PRKCH表達上調(diào)有關(guān),而當抑制circRNA-PRKCH的表達時其通過調(diào)節(jié)miR-145/HGF軸來減少細胞ECM降解及凋亡。Wu等[37]構(gòu)建關(guān)節(jié)軟骨損傷模型研究circRNA-0134111在骨關(guān)節(jié)炎中的作用時發(fā)現(xiàn),circRNA-0134111在OA軟骨組織中過度表達導(dǎo)致軟骨細胞ECM降解、細胞凋亡及加劇炎癥反應(yīng),其機制為circRNA-0134111作為miR-515-5p海綿使miR-515-5p的表達下調(diào),同時當miR-515-5p表達恢復(fù)時可抑制上述病理過程的發(fā)生。

總之,關(guān)節(jié)軟骨中circRNA對關(guān)節(jié)軟骨的損傷及預(yù)后具有重要影響,其含量異常時可通過競爭性結(jié)合miRNA最終促進軟骨發(fā)生損傷,抑制或促進circRNA的表達使其處于平衡態(tài)可改善關(guān)節(jié)軟骨損傷,因此研究探尋調(diào)控circRNA表達的物質(zhì)有望成為治療軟骨損傷的潛在藥物。不同circRNA在軟骨損傷中的作用及機制見表1。

3 干預(yù)ceRNAs與軟骨損傷的診療

基于ncRNA在關(guān)節(jié)軟骨損傷過程中的異常表達,篩選與病情正相關(guān)的ncRNA可作為診斷和預(yù)后的生物標志物,通過干預(yù)ceRNA網(wǎng)絡(luò)抑制對軟骨損傷有促進作用的ncRNA表達或促進對軟骨損傷有抑制作用的ncRNA表達是延緩軟骨損傷進一步發(fā)展的潛在治療點。Li等[38]通過基因?qū)W研究方法驗證正常和損傷的軟骨細胞中差異表達的miRNAs和差異表達的靶基因表達水平,共鑒定了26個差異表達的miRNAs及259個差異表達基因,最終發(fā)現(xiàn)其中27個miRNA-mRNA與關(guān)節(jié)損傷關(guān)系最為密切,并構(gòu)建了一個有5 505個lncRNA-miRNA-mRNA相互作用的ceRNA網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)B細胞易位基因2(BTG2)、阿貝爾森相關(guān)基因(ABL2)和血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)被確定為具有良好預(yù)測性能的中心基因,同時表明阿尼霉素、毒胡蘿卜素、石蒜堿及MG-132為治療軟骨損傷的潛在候選藥物。Luo等[17]研究發(fā)現(xiàn)高表達的lncRNA-MFI2-AS1與軟骨損傷有關(guān),其可能與lncRNA-MFI2-AS1/miR-130a-3p軸的平衡失調(diào)有關(guān),陶銀偉等[39]研究發(fā)現(xiàn)從白樺樹中提取的樺木酸(betulinic acid)可通過抑制lncRNA-MFI2-AS1的表達而促進細胞增殖及抑制炎癥反應(yīng)、凋亡以及軟骨基質(zhì)膠原的破壞,進而減輕關(guān)節(jié)軟骨細胞的損傷。中藥干預(yù)ceRNAs網(wǎng)絡(luò)防治軟骨損傷的研究也廣泛開展,李濤[40]研究發(fā)現(xiàn),中藥方劑益氣養(yǎng)血方能通過干預(yù)LncRNA-UFC1/miR-34a/MMP-13軸上調(diào)LncRNA-UFC1mRNA的表達,抑制miR-34a mRNA的表達,進而抑制MMP13的表達起保護軟骨的作用。lncRNA-BLACAT1的高表達不利于關(guān)節(jié)軟骨的健康,陳晨等[41-42]研究發(fā)現(xiàn),從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體青藤堿可下調(diào)lncRNA-BLACAT1的表達,抑制LPS誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡、促進軟骨細胞增殖,有緩解軟骨細胞損傷的作用,其機制可能與青藤堿干預(yù)LncRNA-BLACAT/miR-142-5p軸有關(guān)。

4 總結(jié)與展望

隨著人們運動意識的普遍提高,關(guān)節(jié)發(fā)生損傷性改變的患者呈明顯上升趨勢,這不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量,而且給社會醫(yī)療資源也帶來了新的壓力。存在于關(guān)節(jié)表面的軟骨損傷是導(dǎo)致此類疾患的直接原因,因此尋找有效防止軟骨損傷的方法是臨床及科研工作者的研究方向。受助于分子學(xué)技術(shù)的發(fā)展,研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)ncRNA與關(guān)節(jié)軟骨的損傷密切相關(guān),而更為復(fù)雜及精細的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制在關(guān)節(jié)軟骨損傷及診治過程中具有重要作用,該機制認為lncRNA、circRNA、miRNA等ceRNA分子通過MRE競爭結(jié)合相同的miRNA對關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖、凋亡及軟骨細胞外基質(zhì)降解等過程影響關(guān)節(jié)軟骨的健康,同時發(fā)現(xiàn)通過藥物干預(yù)該機制可起到治療損傷的軟骨的作用。但是問題也伴隨存在,如①ceRNA網(wǎng)絡(luò)在關(guān)節(jié)軟骨中的作用的研究以miRNA與lncRNA-miRNA軸偏多,circRNA-miRNA軸研究較少。②lncRNA、circRNA對軟骨細胞損傷的影響是是否存在更多途徑?③目前大多研究都局限于機理研究層面,藥物干預(yù)及臨床研究較少。因此,進一步闡明ceRNA網(wǎng)絡(luò)在軟骨損傷中的作用機制并研發(fā)藥物應(yīng)用于臨床將是未來工作的重點。