王宏偉 卜曉潔 戰(zhàn)祥芹 陳福蓮 王燕 楊延民*

1.山東省日照市人民醫(yī)院保健/老年醫(yī)學(xué)科,山東 日照 276800

2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院,山東 濰坊 262500

3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科, 山東 泰安 271000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于長期雌激素缺乏導(dǎo)致的骨穩(wěn)態(tài)失調(diào)[1]。它是絕經(jīng)后婦女最常見的骨病,主要表現(xiàn)為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)異常,以及骨折風(fēng)險增加[2]。POMP及其相關(guān)骨折對全球絕經(jīng)后婦女的健康構(gòu)成重大威脅[3],導(dǎo)致身體殘疾和生活質(zhì)量下降[4]。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,50歲以上的女性有一半容易發(fā)生骨質(zhì)疏松相關(guān)骨折,髖部骨折的死亡率與乳腺癌相當(dāng),比子宮內(nèi)膜癌高4倍[5]。先前的研究發(fā)現(xiàn),PMOP主要是卵巢功能下降和雌激素水平下降共同導(dǎo)致的結(jié)果,因此雌激素補充被廣泛用作傳統(tǒng)的治療策略。然而,最近的研究表明,激素療法在預(yù)防骨折方面并不是很有效,而且可能會增加某些類型癌癥的風(fēng)險,如乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌[6]。因此,開發(fā)更有效、不良反應(yīng)更小的替代治療藥物是改善PMOP的關(guān)鍵。

內(nèi)臟脂肪組織特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑(Vaspin)是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子,與骨代謝密切相關(guān)。高飛等[7]發(fā)現(xiàn)Vaspin可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。Bao等[8]發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)患者血清Vaspin水平明顯低于正常人群,體外實驗證實Vaspin可降低軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。動物實驗證實,關(guān)節(jié)內(nèi)注射Vaspin對關(guān)節(jié)軟骨也有抗炎、抗降解作用[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射重組Vaspin蛋白可改善雄性SD大鼠高脂飲食引起的骨損傷,并在體外促進原成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[9]。此外,我們之前的臨床研究也發(fā)現(xiàn)老年男性骨質(zhì)疏松癥患者血清Vaspin水平降低,高血清Vaspin水平可能是老年男性骨質(zhì)疏松癥的保護因素。Tanna等[10]發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女的血清Vaspin水平與股骨頸和髖關(guān)節(jié)骨密度(BMD)顯著正相關(guān)。這些研究表明Vaspin可能代償性增加從而對骨代謝發(fā)揮積極的調(diào)節(jié)作用。然而,目前尚無研究報道Vaspin干預(yù)治療對雌激素缺乏引起的PMOP的作用及機制。腹腔注射外源性Vaspin是否對OVX大鼠骨代謝也有保護作用尚不清楚。本研究旨在觀察Vaspin對去卵巢大鼠骨代謝的影響,并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑與材料

實驗動物:16周齡的雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(京) 2019-0006],在封閉的SPF級動物房中飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件是12 h的明暗周期,濕度50 %～60 %,溫度23 ℃左右。大鼠可以自由地獲得食物和水。

試劑與材料:重組人Vaspin 蛋白溶液(C192)購自上海近岸蛋白科技有限公司;P1NP 測定試劑盒(貨號CSB-E12774r),OCN測定試劑盒(貨號CSB-E05128r),TRAP測定試劑盒(貨號CSB-E08492 m),CTX-1測定試劑盒(貨號CSB-E12776r),IL-1β ELISA試劑盒(貨號CSB-E08055r),TNF-α測定試劑盒(貨號CSB-E11987r)均購自武漢華美生物技術(shù)有限公司;4 %多聚甲醛購自武漢塞維爾生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol 試劑、引物合成、SYBR Premix EX TAQ II試劑盒試劑盒均購自大連寶生物工程公司;RIPA緩沖液購自上海博彩生物科技有限公司;BCA蛋白分析試劑盒購自上海碧云天生物有限公司;PVDF膜購自美國Millipore公司;強化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Santa公司;SkyScan-1176 μCT(比利時布魯克公司);動態(tài)疲勞實驗機BoseElectroForce?3230(美國博士公司);10×光學(xué)顯微鏡(德國 Zeiss公司);實時熒光定量 PCR 儀(LightCycler480,瑞士羅氏公司);實驗用抗體:GAPDH(稀釋比例1∶1 000,51332)、OPG(稀釋比例1∶1 000,#8486 s)及RANKL(稀釋比例1∶1 000,#3959)均購自Cell Signaling (CST)公司;二抗購自Abcam公司;Flurochem Q化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)。

1.2 方法

1.2.1去卵巢手術(shù)構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型:適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,隨機分為模型組和實驗組:模型組分為去卵巢組(OVX)組和假手術(shù)組(Sham)組,每組6只,用于驗證OVX 術(shù)后 OP 模型構(gòu)建的成功;實驗組分為Sham 組、OVX組和 OVX+Vaspin組3組,每組10只。術(shù)前采用戊巴比妥鈉進行麻醉處理,劑量為50 mg/kg,OVX組采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型,Sham組在卵巢周圍切除少量脂肪,術(shù)后所有大鼠均在同等條件下單籠飼養(yǎng),自由飲水、活動,標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)。

1.2.2動物分組及干預(yù)治療:術(shù)后6周處死模型組大鼠,取一側(cè)股骨行microCT檢測,對OVX大鼠OP模型進行驗證,造模成功評價標(biāo)準(zhǔn):OVX組大鼠BMD峰值較Sham組降低≥2.5 SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。造模成功后,OVX+Vaspin組大鼠均每天給予重組人Vaspin蛋白溶液1 μg/kg腹腔注射,Sham組及OVX組給予等量生理鹽水腹腔注射,干預(yù)12周后,用戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠,收集血清和骨骼樣本進行分析。

1.2.3骨代謝指標(biāo)及炎癥因子檢測:采用ELISA試劑盒檢測各實驗組大鼠血清標(biāo)本中P1NP、OCN、TRAP、CTX、IL-1β和TNF-α的水平。所有操作均嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進行操作,操作前將所需要的血清樣品、試劑盒及酶標(biāo)板孔在室溫下平衡1 h,并按照試劑盒說明書配制實驗所需試劑。最后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值,應(yīng)用Curve Expert軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后根據(jù)公式分別計算出樣本P1NP、OCN、TRAP、CTX、IL-1β及TNF-α的濃度水平。

1.2.4骨組織學(xué)分析:解剖大鼠左側(cè)脛骨,用4 %多聚甲醛固定48 h。用10 %的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣4周。隨后,將骨標(biāo)本置于乙醇中逐漸脫水,石蠟包埋,二甲苯脫蠟,再用不同濃度乙醇脫水,滴加蘇木精染色3 min,自來水沖洗1 min,1 %鹽酸乙醇分化2 s,自來水沖洗返藍(lán)3 min,梯度酒精切片脫水,用伊紅染色液染色1.5 min,骨切片脫水、透明、封片,最后在10×光學(xué)顯微鏡下觀察骨切片的視野圖像。

1.2.5骨生物力學(xué)分析:取大鼠右側(cè)股骨,用鹽水浸泡紗布保持濕潤,-20 ℃保存。采用動態(tài)疲勞實驗機進行三點彎曲試驗,以評估骨強度。測量前將骨置于儀器中,置于兩個軸承的中心位置,以確保彎曲軸與加載長軸對準(zhǔn)。在2 mm/min的恒定變形速率下,加載5～6 N直至發(fā)生斷裂,確定載荷和斷裂參數(shù)。記錄數(shù)據(jù)后,生成載荷-變形曲線,計算最大載荷、最大斷裂負(fù)荷、韌性、能量吸收、彈性模量、極限拉伸強度等骨生物力學(xué)參數(shù)。

1.2.6MicroCT分析:左股骨分離,4 %多聚甲醛固定,75 %乙醇保存。使用Skyscan 1176 μCT掃描儀分析骨質(zhì)量和骨小梁微結(jié)構(gòu),掃描精度17.93 μm,掃描旋轉(zhuǎn)角度180 °,1 mm A1濾波器,掃描電壓70 kV,電流278 μA,曝光時間450 ms;然后將掃描圖像處理成2D和3D圖像。所有3D圖像處理和分析均使用MicroView,v.2.1軟件進行。計算分析骨小梁體積骨密度(Tb.vBMD)、骨小梁體積/總體積(Tb.BV/TV)、骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)。

1.2.7RNA提取和實時定量PCR(qRT-PCR):使用TRIzol試劑從右脛骨標(biāo)本中提取總RNA,將總RNA溶解在DEPC水中,測定其濃度。取5 μg總RNA,使用Prime Script?RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用10 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備總RNA,37 ℃孵育30 min,85 ℃孵育5 min。使用SYBR Premix EX TAQ II試劑盒,在LightCycler480上進行實時PCR。按照說明書進行PCR反應(yīng),引物列于表1。PCR條件為93 ℃ 1次循環(huán)2 min(初始變性),然后93 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min 40次循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT法,以β-actin為內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.8免疫印跡分析:將大鼠腰椎骨從液氮中取出,用錘子迅速敲碎,放入液氮臼中研磨。使用RIPA緩沖液按說明書提取腰椎骨總蛋白。細(xì)胞懸浮在冰冷的RIPA緩沖液中,在冰上裂解10 min,然后以14 000 r/min 離心10 min。含總蛋白裂解液的上清液用BCA蛋白分析試劑盒定量。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質(zhì)分離到10 %聚丙烯酰胺凝膠中,并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5 %脫脂牛奶封閉1 h后,在4 ℃下用一抗孵育過夜。用TBST緩沖液清洗3次,室溫下二抗孵育1 h。蛋白條帶使用增強化學(xué)發(fā)光試劑盒進行可視化,并使用Flurochem Q化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行檢測。以GAPDH作為對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨代謝指標(biāo)和炎性因子比較

與Sham組相比,OVX組血清P1NP和OCN水平顯著降低,TRAP、CTX、IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)。而與OVX組相比,OVX+Vaspin組血清P1NP和OCN水平顯著升高,TRAP、CTX、IL-1β、TNF-α水平明顯降低(P<0.05),見表1。

2.2 大鼠骨組織形態(tài)變化

與Sham組相比,OVX組骨微結(jié)構(gòu)受損,骨小梁數(shù)量明顯減少,OVX+Vaspin組與OVX組相比,骨顯微結(jié)構(gòu)明顯改善,骨小梁數(shù)量明顯增加,見圖1。

圖1 各組大鼠的骨組織病理學(xué)(HE染色10×,標(biāo)尺:50 μm)

2.3 大鼠骨生物力學(xué)變化

與Sham組相比較,OVX組最大負(fù)荷、最大斷裂負(fù)荷、韌性、能量吸收、彈性模量、最大強度等生物力學(xué)參數(shù)均明顯受損(P<0.05)。與骨組織學(xué)分析一致,OVX+Vaspin組大鼠OVX誘導(dǎo)的骨生物力學(xué)損害明顯改善,見表2。

表2 各組大鼠骨代謝指標(biāo)和炎性因子比較

表3 各組大鼠骨生物力學(xué)參數(shù)比較

2.4 大鼠Micro CT分析

Micro CT分析顯示,Vaspin干預(yù)治療可以保護大鼠免受OVX誘導(dǎo)的骨小梁和皮質(zhì)骨骨量丟失,股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖2A所示。骨小梁的定量分析方面,與Sham組相比,OVX組Tb.vBMD、Tb.BV/TV、Tb.N和Tb.Th水平均顯著下降(P<0.05),Tb.Sp和SMI水平顯著升高(P<0.05),而OVX+Vaspin組這些指標(biāo)在很大程度上得到了改善(P<0.05),見圖2B～2G。

注:與Sham相比,* P<0. 05;與OVX相比,#P<0. 05。

2.5 大鼠骨組織骨代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的變化

與Sham組相比,OVX組骨組織中OPG的mRNA水平顯著降低(P<0.05),而RANKL的mRNA水平顯著升高(P<0.05)。而與OVX組相比,OVX+Vaspin組骨組織中OPG的mRNA水平顯著升高(P<0.05),而RANKL的mRNA水平顯著降低(P<0.05),見圖3A、3B。

圖3 大鼠骨組織骨代謝相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平的變化

2.6 大鼠骨組織骨代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化

我們進一步檢測了右脛骨標(biāo)本中OPG及RANKL的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果與mRNA定量觀察結(jié)果一致,見圖3C～3E。

3 討論

去卵巢大鼠模型是目前世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的POMP最常用的動物模型,該模型能較好地模擬絕經(jīng)后婦女雌激素缺乏的臨床特征及其對藥物替代治療的反應(yīng),對研究大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生過程和病理生理機制非常有利[11]。我們的研究發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,OVX組術(shù)后12周骨微結(jié)構(gòu)明顯受損,骨小梁數(shù)量明顯減少,骨強度明顯下降,說明卵巢摘除后POMP建模成功。Vaspin干預(yù)可以通過提高OVX大鼠的骨量和骨密度,改善骨骼微觀結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性,從而對OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥具有改善作用。

骨代謝指標(biāo)是骨形成或骨吸收過程中血液中釋放的生化指標(biāo),能準(zhǔn)確反映早期全身骨代謝情況,臨床上常用于評價骨質(zhì)疏松癥的治療效果。P1NP是成骨細(xì)胞在骨形成過程中產(chǎn)生的,可以反映膠骨的形成速度。CTX是破骨細(xì)胞在骨基質(zhì)降解過程中產(chǎn)生的碎片和分泌產(chǎn)物,可以反映骨吸收的狀態(tài)。血清P1NP和CTX檢測是國際骨質(zhì)疏松基金會提出的反映骨形成和骨吸收的敏感指標(biāo)[12]。OCN是一種廣泛應(yīng)用的骨形成指標(biāo)。Vaspin的干預(yù)可提高OVX大鼠血清P1NP和OCN水平,降低CTX水平,說明Vaspin可在一定程度上促進OVX大鼠骨形成,降低OVX大鼠骨轉(zhuǎn)化率。

正常骨量的維持依賴于成骨細(xì)胞相關(guān)骨形成和破骨細(xì)胞相關(guān)骨吸收之間的動態(tài)平衡,當(dāng)這種穩(wěn)態(tài)因任何原因被破壞時,破骨細(xì)胞的骨吸收比成骨細(xì)胞更強,導(dǎo)致骨質(zhì)流失,這也是OP的主要發(fā)病機制。既往研究發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏可導(dǎo)致絕經(jīng)后婦女破骨細(xì)胞分化增加,骨吸收能力增強,近期研究發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子也參與了PMOP的病理生理機制[13]。研究證實IL-1β和TNF-α可通過激活炎癥信號通路促進骨吸收,抑制骨形成[14]。我們的實驗也證實了OVX組血清中IL-1β和TNF-α水平明顯高于Sham組,說明OVX組大鼠炎癥因子被激活,而Vaspin可以抑制炎癥反應(yīng)和骨吸收,降低骨代謝的高轉(zhuǎn)換水平,從而在一定程度上起到抗骨質(zhì)疏松的作用。

骨的生物力學(xué)分析是評價骨強度和抗骨質(zhì)疏松藥物療效的黃金指標(biāo)[15],而骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)通常被認(rèn)為是預(yù)測骨量丟失和結(jié)構(gòu)破壞最理想的指標(biāo)[16]。Micro CT可為股骨干干骺端骨小梁的顯微結(jié)構(gòu)提供直觀、定量的數(shù)據(jù)。通過三維重建和三維圖像,不僅可以更直觀地觀察骨小梁的結(jié)構(gòu),還可以通過Tb.vBMD、Tb.BV/TV、Tb.N和Tb.Th等定量數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確地檢測骨小梁參數(shù)的細(xì)微變化。因此Micro CT獲得的數(shù)據(jù)對于骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療更加具體和全面[17]。我們的研究也證實了OVX大鼠骨生物力學(xué)性能下降,骨微觀結(jié)構(gòu)受損,而Vaspin干預(yù)可以改善骨生物力學(xué)性能,改善骨微觀結(jié)構(gòu),并在骨組織中產(chǎn)生新的骨小梁。

在骨組織中,骨保護素(osteoprotectin, OPG)主要由成骨細(xì)胞產(chǎn)生,進一步促進成骨細(xì)胞的分化和成熟。目前研究發(fā)現(xiàn)OPG對破骨細(xì)胞有直接的負(fù)向調(diào)節(jié)作用[18]。OPG/RANKL/RANK信號通路是參與骨代謝和骨質(zhì)疏松的主要信號通路,也是目前研究的熱點。有研究發(fā)現(xiàn)OPG/RANKL/RANK信號通路部分分子通路的改變直接參與了POMP的病理生理過程[19-21]。我們的研究發(fā)現(xiàn),Vaspin干預(yù)OVX大鼠12周后,骨組織中OPG mRNA水平和蛋白水平均升高,而RANKL表達(dá)的mRNA和蛋白水平均下降。提示Vaspin對OVX組大鼠骨質(zhì)疏松的保護作用可能是通過激活OPG/RANKL信號通路介導(dǎo)的,為我們今后進一步的細(xì)胞實驗提供了方向。

由于實驗條件限制,本研究未在體外進一步證實Vaspin對OPG/RANKL信號通路表達(dá)及相關(guān)下游因子的影響。在接下來的研究中,我們將在細(xì)胞實驗中加入OPG/RANKL信號通路抑制劑,觀察Vaspin對其下游相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響,并進一步研究其相關(guān)分子機制。

綜上所述,我們的研究證實Vaspin可以促進OVX大鼠骨形成,抑制炎癥反應(yīng),抑制破骨細(xì)胞分化,優(yōu)化骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡,改善骨微觀結(jié)構(gòu)和骨強度,從而在體內(nèi)發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用,而這種作用可能是通過上調(diào)OPG表達(dá)和下調(diào)RANKL表達(dá)介導(dǎo)的。因此,在未來的研究中,我們將通過體外細(xì)胞實驗進一步驗證Vaspin對OPG/RANKL通路的調(diào)控作用。