趙敏 孫紅剛 蹇潔 賀前松

八一骨科醫(yī)院檢驗科,四川 成都 610000

骨質(zhì)疏松(OP)是一種慢性系統(tǒng)性骨病,以老年人和絕經(jīng)后婦女居多,主要表現(xiàn)為骨微細結(jié)構(gòu)破壞和骨量下降[1]。當(dāng)骨重建失衡時,骨形成少于骨吸收,進而引發(fā)OP[2]。脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)可分化為脂肪細胞、成骨細胞及軟骨細胞,同時具有較低的免疫排斥性[3]。研究表明ADSCs在OP中扮演重要角色[4],如ADSCs能夠促進OP裸鼠骨再生[5],修復(fù)OP大鼠脛骨缺損[6]、顱骨缺損等[7]。然而其成骨機制尚不清楚。miRNA是一種約為20 nt的非編碼RNA,能夠參與細胞增殖、遷移及成骨細胞分化等過程。一些研究表明miR-664的異常表達與細胞分化有關(guān)。如miR-664-5p通過靶向血清應(yīng)答因子和Wnt1促進成肌細胞增殖并抑制成肌細胞分化[8]。miR-664a-5p促進SH-SY5Y細胞的神經(jīng)元分化[9]。miR-664a-5p促進骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨分化[10]。絕經(jīng)后婦女骨組織miRNA表達譜顯示,miR-664a-5p表達顯著下調(diào)[11],這表明miR-664a-5p可能參與ADSCs對OP的成骨分化。Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)控細胞成骨分化、OP發(fā)病和進展中起重要作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷通過激活Wnt/β-catenin通路,促進ADSCs成骨分化[13]。胎盤間充質(zhì)干細胞通過激活Wnt/β-catenin通路,促進OP骨折大鼠成骨[14]。然而ADSCs是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路促進OP骨重建研究較少。

本研究通過觀察過表達miR-664a-5p的ADSCs對OP大鼠骨重建的作用及對Wnt/β-catenin通路的影響,以期為OP骨重建提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

40只8周齡體質(zhì)量為200～220 g的SPF級雌性SD大鼠,購買于四川大學(xué)(實驗動物中心)[SCXK(川)2018-026]。于室溫23～25 ℃、標(biāo)準(zhǔn)濕度55 %～60 %、光照/黑夜各12 h環(huán)境中飼養(yǎng),飲水飲食正常,1周后實驗。本研究通過八一骨科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(20210312),實驗過程遵循3R原則。

1.2 主要試劑和儀器

胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司);CD34、CD45、CD90、CD105抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);茜素紅、油紅O、堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、ALP、骨鈣素(OCN)抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。蛋白電泳儀、熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司);熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);Micro-CT顯微掃描儀(德國Siemens公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1ADSCs的培養(yǎng)與鑒定:ADSCs的分離和培養(yǎng):取大鼠腹部脂肪組織,經(jīng)胰酶消化、100目濾網(wǎng)過濾后收集細胞。用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),每隔48 h換液一次,取第3代ADSCs進行實驗。ADSCs成骨分化:取第3代ADSCs,用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化,3周后進行ALP染色和茜素紅染色,顯微鏡下觀察成骨染色效果。ADSCs成脂分化:取第3代ADSCs,用成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化,待脂滴變得足夠大、圓時進行油紅O染色,顯微鏡下觀察成脂染色效果。ADSCs表面標(biāo)志物的鑒定:取第3代ADSCs,分別加入FITC標(biāo)記的CD34、CD45、CD90及CD105,流式細胞儀檢測細胞相應(yīng)抗原的表達。

1.3.2慢病毒感染ADSCs:將過表達miR-664a-5p及陰性對照的慢病毒加入8 μg/mL polybrene感染ADSCs(記作miR-664a-5p-ADSCs組和ADSCs組)。感染24 h后更換無病毒培養(yǎng)基。用嘌呤霉素篩選陽性細胞。

1.3.3CCK-8法檢測ADSCs增殖:將ADSCs接種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h。將原培養(yǎng)基更換成含有10 % CCK-8溶液的新鮮培養(yǎng)基。并置于37 ℃下孵育1 h。檢測樣品在450 nm處的吸光度。

1.3.4Transwell法檢測ADSCs遷移:Transwell小室上室加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的各組ADSCs,下室加入含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基,并置于37 ℃下孵育24 h。經(jīng)甲醛固定,結(jié)晶紫染色后,顯微鏡下對穿膜細胞進行觀察和統(tǒng)計。

1.3.5ALP染色和茜素紅染色法檢測ADSCs成骨能力:取各組ADSCs,利用ALP染色和茜素紅染色檢測ADSCs成骨能力,方法同1.3.1。

1.3.6OP大鼠模型制作與分組:40只大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham)、卵巢摘除組(OVX)、ADSCs組和miR-664a-5p-ADSCs組,每組各10只。腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,仰臥位固定大鼠、備皮消毒。自恥骨2～3 cm縱向切開皮膚,分離筋膜,切除卵巢(桑葚狀紅色組織),縫合筋膜和皮膚組織。Sham組僅切除卵巢周圍脂肪組織。3個月后,ADSCs組和miR-664a-5p-ADSCs組分別尾靜脈注射感染pHRi-miR-NC的ADSCs和感染pHRi-miR-664a-5p的ADSCs;Sham組和OVX組注射等量生理鹽水。注射1個月后進行指標(biāo)檢測。實驗過程中未有大鼠死亡。

1.3.7micro-CT掃描和重建:造模4個月后處死大鼠,取股骨置于4%多聚甲醛中固定,避光保存。micro-CT對股骨進行掃描和重建,比較骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁間距(Tb.Sp)和骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)等指標(biāo)。

1.3.8HE染色觀察新骨形成:將股骨置于EDTA脫鈣液中脫鈣,每隔2 d更換一次脫鈣液,當(dāng)探針能輕易刺破骨骼時表示脫鈣完成。流水沖洗、脫水包埋,制作石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟、乙醇梯度脫水、HE染色、透明封片,顯微鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)。

1.3.9TRAP染色觀察破骨細胞形成:石蠟切片經(jīng)脫蠟、乙醇梯度脫水、TRAP染色、蘇木精染細胞核、乙醇梯度脫水,透明封片,顯微鏡下觀察破骨細胞染色情況并計數(shù)。

1.3.10免疫組化染色檢測Runx2、ALP、OCN水平:石蠟切片經(jīng)脫蠟、脫水、高溫抗原修復(fù)、血清封閉、加入Runx2、ALP、OCN一抗(1∶400)4 ℃孵育過夜,二抗37 ℃孵育1 h,滴加DAB顯色液、蘇木精復(fù)染、脫水、透明封片,顯微鏡下觀察染色情況并計算陽性面積百分比。

1.3.11RT-qPCR檢測miR-664a-5p、Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA水平:采用Trizol試劑從股骨組織中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR Green法進行擴增,GAPDH作內(nèi)參。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性60 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 50 s,共40個循環(huán)。使用2-ΔΔCT公式計算miR-664a-5p、Runx2、ALP、OCN mRNA相對表達水平。

1.3.12Western blot檢測Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin水平:取各組股骨組織,提取并測定蛋白濃度,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜后,脫脂奶粉中封閉2 h,分別加入Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin一抗(1∶2 000)4 ℃過夜,加入二抗(1∶5 000)4 ℃孵育2 h,ECL顯色劑顯色,凝膠成像儀拍照,分析各組蛋白相對GAPDH的表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的形態(tài)觀察和鑒定

P3代ADSCs呈長梭形,形態(tài)趨于一致。ALP染色可見藍紫色染色結(jié)節(jié);茜素紅染色可見橙紅色鈣化結(jié)節(jié);油紅O染色可見紅色融合變大的脂滴。ADSCs表面標(biāo)志物CD90和CD105呈陽性表達,造血干細胞標(biāo)記物CD34和CD45呈陰性表達。見圖1。

注:A:P3代ADSCs形態(tài);B:ALP染色;C:茜素紅染色;D:油紅O染色;E:流式細胞儀檢測。

2.2 miR-664a-5p促進ADSCs增殖、遷移和成骨能力

pHRi-miR-664a-5p感染ADSCs后,ADSCs中miR-664a-5p表達升高(P<0.05)。CCK-8實驗、Transwell實驗、ALP染色和茜素紅染色結(jié)果顯示,與ADSCs組相比,miR-664a-5p-ADSCs組ADSCs增殖、遷移和成骨能力明顯提高(P<0.05)。見圖2。

注:A:RT-qPCR法檢測miR-664a-5p表達;B:CCK-8法;C:Transwell法;D:ALP染色;E:茜素紅染色;與ADSCs組比較,*P<0.05。

2.3 miR-664a-5p-ADSCs對OP大鼠骨重建的作用

RT-qPCR結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組miR-664a-5p水平明顯降低(P<0.05);與OVX組相比,ADSCs組、miR-664a-5p-ADSCs組miR-664a-5p水平明顯升高(P<0.05);與ADSCs組相比,miR-664a-5p-ADSCs組miR-664a-5p水平明顯升高(P<0.05)。micro-CT結(jié)果和骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)顯示,與Sham組相比,OVX組骨密度明顯降低,橫斷面可見明顯骨髓空腔,Tb.Th、Tb.N和BV/TV明顯減小,Tb.Sp明顯增大(P<0.05);與OVX組相比,ADSCs組、miR-664a-5p-ADSCs組骨密度明顯升高,骨髓空腔減小,Tb.Th、Tb.N和BV/TV明顯增大,Tb.Sp明顯減小(P<0.05);與ADSCs組相比,miR-664a-5p-ADSCs組骨密度升高,骨髓空腔減小,Tb.Th、Tb.N和BV/TV明顯增大,Tb.Sp明顯減小(P<0.05)。HE染色和TRAP染色結(jié)果顯示,Sham組骨小梁完整,破骨細胞較少;OVX組骨小梁稀疏且變薄,破骨細胞較多,說明OVX組大鼠OP嚴(yán)重。與OVX組相比,ADSCs組、miR-664a-5p-ADSCs組骨小梁增加且增厚,破骨細胞較少。見圖3。

注:A:RT-qPCR法檢測miR-664a-5p表達;B:micro-CT;C:骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測;D:HE染色(200×);E:TRAP染色(200×);與Sham組比較,*P<0.05;與OVX組比較,#P<0.05;與ADSCs組比較,△P<0.05。

2.4 miR-664a-5p-ADSCs對OP大鼠成骨相關(guān)基因Runx2、ALP及OCN表達的影響

免疫組化染色、RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組Runx2、ALP及OCN mRNA和蛋白水平明顯降低(P<0.05);與OVX組相比,ADSCs組、miR-664a-5p-ADSCs組Runx2、ALP及OCN mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.05);與ADSCs組相比,miR-664a-5p-ADSCs組Runx2、ALP及OCN mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖4。

2.5 miR-664a-5p-ADSCs對OP大鼠Wnt/β-catenin信號通路的影響

RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明顯降低(P<0.05);與OVX組相比,ADSCs組、miR-664a-5p-ADSCs組Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.05);與ADSCs組相比,miR-664a-5p-ADSCs組Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖5。

注:A:RT-qPCR法檢測Wnt、β-catenin mRNA表達;B:Western blot檢測Wnt、β-catenin表達;與Sham組相比,*P<0.05;與OVX組比較,#P<0.05;與ADSCs組比較,△P<0.05。

3 討論

OP患者全身骨量減少,容易發(fā)生骨折。ADSCs具有快速繁殖和成骨分化的潛力,在治療OP方面比BMSCs更有優(yōu)勢。OVX動物模型中,ADSCs成骨能力不受雌激素缺乏的影響,且成骨能力和健康動物相似,同時能夠促進造血干細胞匯集到骨髓,為自體移植提供了可能[15]。研究表明OP大鼠近端和遠端移植自體ADSCs均能增強骨密度,改善骨微細結(jié)構(gòu),促進骨再生[16-17]。尾靜脈注射ADSCs能夠抑制破骨細胞活性,增加骨密度,改善骨質(zhì)病理結(jié)構(gòu);同時ADSCs還能分泌多種骨細胞激活因子,防止骨量流失[18-19]。另外研究發(fā)現(xiàn)OP患者ADSCs也能進行成骨分化[20]。有學(xué)者分別從年輕和老年絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)患者體內(nèi)獲取ADSCs,發(fā)現(xiàn)ADSCs均可發(fā)生增殖和成骨分化,且將PMOP患者ADSCs放入條件培養(yǎng)液后,其成骨潛能顯著提高[21-22]。另有研究者在臨床上也通過自體移植ADSCs來修復(fù)患者的顱骨缺損[23-24]和上頜骨缺損[25]。由此可見人源ADSCs具有一定的成骨潛能,可考慮作為移植的細胞來源。研究發(fā)現(xiàn)miR-664a-5p能夠促進BMSCs的成骨分化[26],且miR-664a-5p在絕經(jīng)后婦女骨組織中表達顯著下調(diào)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-664a-5p能夠提高ADSCs的增殖、遷移和成骨分化能力,從而為ADSCs的歸巢和成骨分化提供了更大的可能。將miR-664a-5p-ADSCs經(jīng)尾靜脈注入去卵巢OP大鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)OP大鼠骨組織miR-664a-5p水平較低,而miR-664a-5p-ADSCs顯著促進新骨形成,且成骨情況優(yōu)于單純ADSCs組,與Sham組較接近。推測miR-664a-5p可能是影響OP發(fā)病的因素,且miR-664a-5p修飾的ADSCs能夠增強miR-664a-5p表達,使移植后的ADSCs在宿主中存活更久,并分泌對OP有利的特定蛋白,起到治療miR-664a-5p的目的。

Runx2是骨形成和骨重塑的重要轉(zhuǎn)錄因子;ALP、OCN是成骨分化早期標(biāo)志物,直接反映成骨細胞的活性和功能情況,在骨折患者體內(nèi)表達異常升高。成骨細胞活性及其成骨分化能力是骨再生的必要條件。研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后OP患者中成骨標(biāo)志物ALP、OCN的表達顯著降低,通過上調(diào)成骨相關(guān)基因和Runx2的表達能夠緩解OP進展[27-28]。在OP兔右下頜骨牽張成骨過程中,Runx2修飾的ADSCs治療促進了OP性下頜骨牽張成骨期間的新骨形成,并補償了OP對新骨形成的不利影響[29]。本研究在基因和蛋白水平發(fā)現(xiàn),miR-664a-5p-ADSCs組相比ADSCs組和OVX組,更能提高OP大鼠體內(nèi)Runx2、ALP、OCN的表達,同時抑制破骨細胞活性,促進新骨生成。

Wnt/β-catenin信號通路參與成骨細胞增殖和分化,在OP的發(fā)病和進展中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)OP小鼠Wnt、β-catenin表達下調(diào),褪黑素通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進BMSCs成骨分化和延緩OVX小鼠骨量丟失[30]。同樣巴戟天也通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進體內(nèi)、體外MSCs的成骨分化能力[31]。本研究發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠Wnt、β-catenin表達下調(diào),miR-664a-5p-ADSCs組相比ADSCs組明顯提高Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平。說明過表達miR-664a-5p的ADSCs通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進OP大鼠骨重建。

綜上所述,過表達miR-664a-5p的ADSCs通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進OP大鼠骨重建。ADSCs在改善OP方面具有廣泛的應(yīng)用前景。