李章獻 王慶* 陳泰祥 戴哲浩 王麓山

1.南華大學附屬第三醫(yī)院脊柱外科,湖南 衡陽 421900

2.南華大學附屬第三醫(yī)院骨科,湖南 衡陽 421900

3.中南大學湘雅二醫(yī)院脊柱外科,湖南 長沙 421142

4.南華大學附屬第一醫(yī)院脊柱外科,湖南 衡陽 421000

絕經(jīng)后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是絕經(jīng)后女性常見的疾病之一,表現(xiàn)為雌激素缺乏后出現(xiàn)的骨量減少、骨微結構破壞并伴有骨脆性增加,容易發(fā)生脆性骨折[1]。骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)具有自我更新和定向分化的潛能、能夠發(fā)生成骨分化和成脂分化,BMSCs的成骨分化在維持骨代謝平衡、保證骨量及骨微結構正常中發(fā)揮重要作用。在PMOP的發(fā)病過程中,BMSCs的成骨分化和成脂分化失衡與骨質丟失密切相關[2-3]。因此,深入研究PMOP的BMSCs成骨分化調(diào)控機制有助于深入認識PMOP的發(fā)病機制并為疾病的防治提供新靶點。表觀遺傳學調(diào)控機制在間充質干細胞分化中的作用倍受關注,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miR)能夠在轉錄后實現(xiàn)對基因表達的表觀遺傳學調(diào)控,其中miR-19a-3p具有促進BMSCs成骨分化的生物學作用[4],而lncRNA分化非蛋白編碼 RNA(differentiation antagonizing nonprotein coding RNA,DANCR)位于miR-19a-3p的上游、以“分子海綿”的形式吸附miR-19a-3p并削弱其生物學作用[5]。為初步揭示PMOP BMSCs成骨分化的調(diào)控機制,本研究通過細胞實驗對lncRNA DANCR靶向miR-19a-3p調(diào)控PMOP BMSCs成骨分化的作用及機制展開分析。

1 材料和方法

1.1 受試者資料

選擇健康女性志愿者4例和PMOP患者4例。健康女性年齡<35歲、骨密度Z值>-2 SD,排除有骨折病史、自身免疫性疾病、惡性腫瘤的受試者;PMOP患者均符合指南中PMOP的診斷標準且并發(fā)股骨頸骨折、行髖關節(jié)置換術,排除合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤的患者。健康女性自愿接受骨髓穿刺、取髂骨內(nèi)骨髓;PMOP患者于髖關節(jié)置換術中取髂骨內(nèi)骨髓。

1.2 試劑與儀器

地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C購自美國Sigma公司,陰性對照(negative control,NC)siRNA、lncRNA DANCR siRNA、miR-NC、miR-19a-3p、miR-NC抑制物、miR-19a-3p抑制物上海吉瑪生物科技公司,總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司,PTEN的特異性一抗購自美國Abcam公司,堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活力檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技公司,野生型和突變型lncRNA DANCR報告基因及檢測試劑盒購自丹麥Promega公司。

1.3 實驗方法

1.3.1BMSCs的分離培養(yǎng):取髂骨骨髓約5～10 mL、肝素化后與等體積培養(yǎng)基混合,1 000 r/min離心5 min,小心棄去脂肪層和血清層,保留沉淀并緩慢注入Ficoll細胞分離液,2 500 r/min離心25 min,抽取中間懸浮的乳白色云霧狀單核細胞層,用磷酸鹽緩沖液洗滌、離心3次,用含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基重懸沉淀,調(diào)節(jié)細胞密度至6×103/mL,接種在培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng),每3 d更換1次培養(yǎng)基、當細胞匯合至單層后用0.25 %胰蛋白酶進行消化、1∶2傳代繼續(xù)培養(yǎng)。取第3代BMSCs用于后續(xù)實驗。

1.3.2BMSCs的分組處理:配置培養(yǎng)成骨誘導培養(yǎng)液如下:0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、10 %胎牛血清。取POMP患者的第3代BMSCs進行分組,方法如下:si-NC組轉染NC siRNA,si-DANCR組轉染lncRNA DANCR siRNA,si-NC+miR-NC抑制物組共轉染NC siRNA和NC抑制物,si-DANCR+miR-NC抑制物組共轉染lncRNA DANCR siRNA和NC抑制物,si-DANCR+miR-19a-3p抑制物組共轉染lncRNA DANCR siRNA和miR-19a-3p抑制物。各組轉染過程中均使用成骨誘導培養(yǎng)基、按照轉染試劑說明書配置轉染體系。

1.3.3BMSCs中l(wèi)ncRNADANCR、miR-19a-3p表達的檢測:采用培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒提取BMSCs中的RNA,采用lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒以lncRNA為模板合成cDNA;采用lncRNA熒光定量檢測試劑盒配置lncRNA DANCR表達的PCR檢測體系:cDNA 2 μL、反應預混液10 μL、10 μmol/L上游引物及下游引物各0.4 μL、去離子水補足至20.0 μL。采用miRcute miR提取分離試劑盒提取BMSCs的miR,采用miRcute增強型miR cDNA第一鏈合成試劑盒以miR為模板合成cDNA;采用miRcute增強型miR熒光定量檢測試劑盒配置miR-19a-3p的PCR檢測體系:cDNA 2 μL、試劑盒內(nèi)反應液10 μL、10 μmol/L上游引物0.4 μL、試劑盒中的通用下游引物0.4 μL、去離子水補足至20.0 μL。將lncRNA DANCR、miR-19a-3p的檢測體系放入PCR儀,按照如下程序進行PCR反應:95 ℃預變性10 min后95 ℃變性5 s、60 ℃退火/延伸15 s并重復40個循環(huán)。完成PCR反應后在軟件中生成循環(huán)曲線及Ct值,按照公式2-△△Ct計算表達水平,以U6為內(nèi)參計算lncRNA DANCR、miR-19a-3p的表達水平。

1.3.4BMSCs中PTEN表達的檢測:采用裂解液提取BMSCs中的蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,根據(jù)蛋白濃度取30 μg蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行Western blot實驗,電泳后電轉移至硝酸纖維素膜,孵育1∶1 000稀釋的PTEN一抗或1∶3 000稀釋的β-actin一抗過夜。次日洗膜3次后室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h,洗膜3次后在凝膠成像系統(tǒng)中進行化學發(fā)光,得到PTEN和β-actin的蛋白條帶,掃描蛋白條帶的灰度值并以β-actin為內(nèi)參、計算PTEN的表達水平。

1.3.5BMSCs成骨分化后的茜素紅染色:成骨誘導第21 d時,棄去培養(yǎng)基、用磷酸鹽沖洗細胞后加入0.1 %茜素紅中染色30 min,觀察茜素紅染色情況并拍照記錄,而后加入10 %氯化十六烷基吡啶溶解鈣結節(jié)溶解,震蕩后吸取50 μL液體加入96孔培養(yǎng)板內(nèi),在酶標儀上檢測405 nm的光密度值OD405。

1.3.6BMSCs成骨分化后ALP活力的檢測:成骨誘導第3、5、7 d時,棄去培養(yǎng)基、用磷酸鹽沖洗細胞后采用ALP活力檢測試劑盒進行實驗,按照試劑盒說明書進行操作,在酶標儀上分別對標準品和待測樣品510 nm波長的光密度值進行檢測,根據(jù)標準品的光密度值繪制標準曲線,計算待測樣品的ALP活力。

1.3.7BMSCs成骨分化后成骨標志基因表達的檢測:成骨誘導第7 d時,棄去培養(yǎng)基、用磷酸鹽沖洗細胞后采用總RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA,采用cDNA第一鏈合成試劑盒對細胞中的總RNA進行反轉錄、合成cDNA,最后采用熒光定量檢測試劑盒對OCN、OPN的mRNA表達水平進行熒光定量PCR檢測,PCR反應體系如下:cDNA 1 μL、熒光定量檢測試劑盒內(nèi)的反應液10 μL、上游引物和下游引物各0.6 μL,加入去離子水補足20.0 μL。在熒光定量PCR儀中設置反應程序如下:95 ℃預變性3 min后95 ℃ 15 s、特異性退火溫度25 s、72 ℃ 30 s重復40個循環(huán),完成PCR反應結束后得到得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct),以β-actin為內(nèi)參、按照公式2-△△Ct計算OCN、OPN的mRNA表達水平。

1.3.8雙熒光素酶報告基因實驗:取POMP患者的第3代BMSCs,將lncRNA DANCR報告基因與miR-NC或miR-19a-3p共轉進入細胞,48 h后采用試劑盒檢測細胞中報告基因的螢火蟲熒光值和海腎熒光值,計算螢火蟲熒光值/海腎熒光值的比值作為報告基因的熒光活力。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理,實驗數(shù)據(jù)均為計量資料、以均數(shù)±標準差表示并進行t檢驗或方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PMOP女性和健康女性BMSCs成骨分化的比較

成骨誘導21D時,PMOP女性和健康女性BMSCs均可見大小不等的鈣結節(jié),與健康女性比較,PMOP女性BMSCs鈣結節(jié)的染色淺、數(shù)量少、范圍小。經(jīng)酶標儀檢測,PMOP女性BMSCs成骨誘導后的OD405水平低于健康女性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。成骨誘導3、5、7 d時,PMOP女性BMSCs的ALP活力低于健康女性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。成骨誘導7 d時,PMOP女性BMSCs中OCN、OPN的mRNA表達水平低于健康女性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注:與健康女性比較,*P<0.05。

2.2 PMOP女性和健康女性BMSCs中l(wèi)ncRNA DANCR、miR-19a-3p、PTEN表達水平的比較

PMOP女性BMSCs中l(wèi)ncRNA DANCR、PTEN的表達水平高于健康女性,miR-19a-3p的表達水平低于健康女性(P<0.05)。見圖2。

注:與健康女性比較,*P<0.05。

2.3 PMOP女性BMSCs中l(wèi)ncRNA DANCR對miR-19a-3p的靶向調(diào)控作用

轉染48 h時,miR-19a-3p組BMSCs中l(wèi)ncRNA DANCR野生型報告基因的熒光活力低于miR-NC組(P<0.05),lncRNA DANCR突變型報告基因的熒光活力與miR-NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

注:與miR-NC組比較,*P<0.05。

2.4 敲低lncRNA DANCR對PMOP女性BMSCs成骨分化的影響

PMOP女性BMSCs成骨誘導21 d時,si-NC組和si-DANCR組均可見大小不等的鈣結節(jié),與si-NC組比較,si-DANCR組的鈣結節(jié)染色深、數(shù)量多、范圍小廣。經(jīng)酶標儀檢測,si-DANCR組成骨誘導后的OD405水平高于si-NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PMOP女性BMSCs成骨誘導3、5、7 d時,si-DANCR組的ALP活力高于si-NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PMOP女性BMSCs成骨誘導7 d時,si-DANCR組的OCN、OPN mRNA表達水平低于si-NC,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注:與si-NC組比較,*P<0.05。

2.5 敲低lncRNA DANCR對PMOP女性BMSCs中miR-19a-3p/PTEN軸的調(diào)控作用

PMOP女性BMSCs成骨誘導7 d時,si-DANCR組的miR-19a-3p的表達水平高于si-NC組,PTEN的表達水平低于si-NC,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

注:與si-NC組比較,*P<0.05。

2.6 miR-19a-3p抑制物對敲低lncRNA DANCR促進PMOP女性BMSCs成骨分化的影響

PMOP女性BMSCs成骨誘導7 d時,si-DANCR+miR-NC抑制物組的miR-19a-3p表達水平高于si-NC+miR-NC抑制物組,PTEN表達水平低于si-NC+miR-NC抑制物組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);si-DANCR+miR-19a-3p抑制物組的miR-19a-3p表達水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物,PTEN表達水平高于si-DANCR+miR-NC抑制物,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PMOP女性BMSCs成骨誘導21 d時,si-DANCR+miR-NC抑制物組的OD405水平高于si-NC+miR-NC抑制物組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);si-DANCR+miR-19a-3p抑制物組的OD405水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PMOP女性BMSCs成骨誘導3、5、7 d時,si-DANCR+miR-NC抑制物組的ALP活力高于si-NC+miR-NC抑制物組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);si-DANCR+miR-19a-3p抑制物組的ALP活力低于si-DANCR+miR-NC抑制物,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PMOP女性BMSCs成骨誘導7 d時,si-DANCR+miR-NC抑制物組的OCN、OPN mRNA表達水平高于si-NC+miR-NC抑制物組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);si-DANCR+miR-19a-3p抑制物組的OCN、OPN mRNA表達水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

注:與si-NC+miR-NC抑制物組比較,*P<0.05;與si-DANCR+miR-NC抑制物組比較,#P<0.05。

3 討論

PMOP是常見的骨質疏松類型,因絕經(jīng)后雌激素水平降低導致骨量減少、骨微結構改變,患者發(fā)生脆性骨折的風險大大增加、嚴重者甚至會發(fā)生死亡[6-8]。PMOP的發(fā)生與雌激素水平降低有關,但具體的分子生物學機制尚不明確。BMSCs具有成骨和成脂分化能力,成骨和成脂分化的平衡有利于維持正常的骨量及骨微結構,其失衡會導致骨量減少、骨微結構改變并參與PMOP的發(fā)生發(fā)展。本研究的結果及既往其他學者的結果均顯示,與健康育齡期女性比較,PMOP患者的BMSCs成骨分化能力明顯減弱[9-10]。基于此,本研究將深入探索PMOP患者BMSC成骨分化能力減弱的分子機制。

LncRNAs和miRs是廣泛分布于全身各個臟器和組織的非編碼RNA,前者能夠通過“分子海綿”的作用與miRs結合、削弱miRs的生物學作用;后者能夠以堿基互補配對的方式與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)結合,水解mRNA或抑制其翻譯,進而在轉錄后水平實現(xiàn)基因表達的負調(diào)控。已有不同的研究表明lncRNA/miR/靶基因軸參與干細胞成骨分化的調(diào)控、POMP的發(fā)病[11-13]。LncRNA DANCR是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,一項臨床研究證實POMP患者外周血中l(wèi)ncRNA DANCR的表達增加且與骨密度呈負相關[14],提示lncRNA DANCR低表達與POMP的發(fā)病有關。本研究在POMP患者的BMSCs中檢測到lncRNA DANCR的表達水平明顯增加;轉染siRNA敲低lncRNA DANCR的表達后,POMP患者BMSCs的成骨分化能力明顯增強,表現(xiàn)為成骨誘導后鈣結節(jié)增多、ALP活力及多種成骨標志基因表達增加。以上結果提示lncRNA DANCR在POMP患者BMSCs的成骨分化中起到抑制作用,POMP發(fā)病過程中高表達的lncRNA DANCR可能通過抑制BMSCs成骨分化的方式導致骨量丟失和骨微結構改變。

LncRNA通過靶向miR發(fā)揮生物學作用,在多種組織損傷模型中l(wèi)ncRNA DANCR通過靶向miR-19a-3p的途徑促進炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等,進而加重組織損傷的程度[5,15]。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗在PMOP患者的BMSCs中證實lncRNA DANCR靶向結合miR-19a-3p;在PMOP患者的BMSCs成骨誘導過程中轉染siRNA敲低lncRNA DANCR后,細胞中miR-19a-3p的表達增加、PTEN的表達降低。miR-19a-3p是一種具有保護作用的miR,PTEN是已知的miR-19a-3p靶基因之一[16-17]。已有研究報道m(xù)iR-19a-3p在BMSCs成骨分化中起促進作用、而PTEN在BMSCs成骨分化中起抑制作用。據(jù)此推測,lncRNA DANCR可能通過靶向miR-19a-3p/PTEN軸的方式在PMOP患者的BMSCs中調(diào)控成骨分化。

進一步探究受到lncRNA DANCR調(diào)控的miR-19a-3p/PTEN軸在PMOP患者BMSCs成骨分化中的作用。POMP患者的BMSCs中miR-19a-3p表達降低,PTEN表達增加,符合miR-19a-3p促進成骨、PTEN抑制成骨的生物學特征。在PMOP患者的BMSCs成骨誘導過程中,轉染siRNA敲低lncRNA DANCR的同時共轉染miR-19a-3p抑制物后,敲低lncRNA DANCR增加miR-19a-3p表達、降低PTEN表達的作用以及促進PMOP患者BMSCs成骨分化的作用被逆轉,這一結果證實 lncRNA DANCR對PMOP患者BMSCs成骨分化的調(diào)控作用與靶向miR-19a-3p/PTEN軸有關。

綜上所述,lncRNA DANCR靶向miR-19a-3p/PTEN軸參與PMOP患者BMSCs成骨分化的調(diào)控;PMOP患者BMSCs中l(wèi)ncRNA DANCR及PTEN表達增加、miR-19a-3p表達降低、成骨分化能力減弱,敲低lncRNA DANCR使的成骨分化能力增加、miR-19a-3p表達增加、PTEN表達降低。以上分析為今后深入認識PMOP患者BMSCs成骨分化的調(diào)控機制以及PMOP的發(fā)病機制提供了新靶點。