徐夏萌, 沈麗麗, 閆佳麗, 王 勇, 徐正銀, 陳功友*

(1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2. 光明食品集團(tuán)上海川東農(nóng)場有限公司種植業(yè)中心，鹽城 224133)

水稻是中國第一大糧食作物,其產(chǎn)量占中國糧食產(chǎn)量的40%左右。由稻黃單胞菌稻致病變種Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)引起的水稻白葉枯病(bacterial leaf blight,BLB)是水稻三大病害(稻瘟病、白葉枯病和稻紋枯病)之一,由稻黃單胞菌稻生致病變種Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xoc)引起的水稻細(xì)菌性條斑病(bacterial leaf streak,BLS)已發(fā)展成為水稻的第四大病害。水稻細(xì)菌性條斑病應(yīng)簡稱為條斑病,不應(yīng)簡稱為細(xì)條病,因?yàn)槲覈参锊『Φ拿Q是根據(jù)病害癥狀特點(diǎn)而命名的,即因受平行葉脈限制而形成的條形病斑是條斑病的典型特點(diǎn)。白葉枯病“老病重發(fā)”,條斑病“新病暴發(fā)”和兩種病害混合發(fā)生,成為我國南方水稻產(chǎn)區(qū)重要致災(zāi)病害。常發(fā)年份水稻減產(chǎn)10%～30%,暴發(fā)年份減產(chǎn)50%以上。據(jù)統(tǒng)計,我國兩種致災(zāi)病害重發(fā)年份發(fā)生面積200萬hm2左右,嚴(yán)重威脅我國糧食安全生產(chǎn)[1]。我國水稻受白葉枯病和條斑病危害的主要原因在于病害的綠色防控依然存在3個短板。1)病害成災(zāi)機(jī)制不清楚:對我國水稻產(chǎn)區(qū)兩種病菌毒性組成的分子基礎(chǔ)不清楚,無法有效監(jiān)控預(yù)警,也不能針對性地布局抗病品種;2)精準(zhǔn)抗病育種新技術(shù)匱乏:現(xiàn)利用的抗病基因正不斷地被病菌克服抗性,缺乏科學(xué)預(yù)見和新的抗病育種技術(shù);3)綠色農(nóng)藥和防控技術(shù)短缺:田間病害發(fā)生時防控方法老套,缺乏綠色防控農(nóng)藥。

1 兩種水稻細(xì)菌病害的差異

目前已經(jīng)鑒定的白葉枯病抗病基因(R)約47個[1-2],而這些R基因絕大多數(shù)不抗條斑病;相應(yīng)地,抗條斑病的R基因不抗白葉枯病。這主要與兩種水稻細(xì)菌病害的發(fā)生特點(diǎn)和病菌致病因子的差異有關(guān)。白葉枯病是系統(tǒng)性維管束侵染病害,而條斑病是局部性薄壁細(xì)胞侵染病害[3]。Xoo和Xoc雖均為稻黃單胞菌X.oryzae,但是兩個不同的致病變種(pathovar)。除都能通過傷口侵染水稻外,Xoo還能通過水孔侵染水稻,在維管束中繁殖擴(kuò)展危害,造成白葉枯病害癥狀;而Xoc則還能通過氣孔侵染,在薄壁細(xì)胞間繁殖擴(kuò)展危害,受平行葉脈的限制,造成水浸狀長條形病害癥狀。Xoo和Xoc的侵染途徑和引起的病害癥狀差異可能與它們從水稻上獲得營養(yǎng)的方式有關(guān),例如Xoo主要獲取蔗糖等[4-6],而Xoc主要獲取硫化物等[7]。

2 稻黃單胞菌tal基因是毒性變異的主要決定因子

因稻黃單胞菌所致水稻細(xì)菌病害在生產(chǎn)上的重要性,其被認(rèn)為是模式植物水稻上的模式病原菌[3]。稻黃單胞菌組學(xué)和致病因子揭示,Xoo和Xoc存在類似的致病性因子,例如相似的分泌系統(tǒng)[8]、群體感應(yīng)系統(tǒng)[9]、第二信使c-di-GMP[10]等,而在效應(yīng)蛋白上存在差異,例如Xoc缺少與抗病基因Xa21對應(yīng)的PAMP分子RaxX[11],Xoo缺少蛋白水解酶活性[12]、缺少匹配抗病基因Rxo1的Ⅲ型效應(yīng)子AvrRxo1[13]以及缺少與水稻氣孔免疫互作的Xop蛋白XopC2[14]和XopAP[15]。重要的是,它們均擁有數(shù)量比較多的tal(transcription activator-like)基因編碼的TALE(TAL effector)蛋白[16-17]。稻黃單胞菌產(chǎn)生的TALE蛋白,借助Ⅲ 型分泌系統(tǒng)分泌進(jìn)入水稻細(xì)胞核與水稻中相應(yīng)的R或S基因啟動子的特定DNA序列結(jié)合(TAL effector-binding element, 簡稱EBE),起轉(zhuǎn)錄因子作用,激活R或S基因表達(dá),從而水稻表現(xiàn)抗病性或感病性[16-17]。稻黃單胞菌 TALE蛋白高度保守,N-端和C-端幾乎相同,不同的是由34個氨基酸構(gòu)成的重復(fù)單元數(shù)量不同,每個重復(fù)單元的第12和13位氨基酸種類可變(repeat-variable diresidues,RVDs);這2個位點(diǎn)的氨基酸可識別1個堿基;RVDs的種類和數(shù)量不同,TALE識別水稻中相應(yīng)基因啟動子中的EBE序列不同[18-19]。雖然根據(jù)TALE蛋白的RVD可以預(yù)測其結(jié)合的EBE序列,從而發(fā)現(xiàn)TALE蛋白作用的植物靶標(biāo)基因[20],但至今稻黃單胞菌的許多TALE蛋白在水稻中的靶標(biāo)基因并不清楚,還需要通過生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)掘。

遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn),稻黃單胞菌的TALE蛋白存在2種類型[21-22](圖1)。一類為典型結(jié)構(gòu)的TALE蛋白(typical TALE,tTALE),TALE蛋白間的差異性主要在中央重復(fù)區(qū)(CRR)的重復(fù)單元數(shù)量上,例如Xoo菲律賓6號小種PXO99A的TALE蛋白PthXo1的CRR中重復(fù)單元數(shù)量為23.5個[6]。已知作用于水稻靶標(biāo)基因的TALE蛋白其CRR中重復(fù)單元的數(shù)量不同(表1),最少的重復(fù)單元僅有1.5個[12]。一般認(rèn)為,重復(fù)單元在8個以上才能保證TALE蛋白發(fā)揮正常的功能[12]。另一類為截短類型的干擾性TALE蛋白(interfering TALE,iTALE),與tTALE相比,iTALE蛋白N-端缺失58個氨基酸,C-端缺失部分核定位信號和酸性轉(zhuǎn)錄激活域[22]。

表1 稻黃單胞菌TALE蛋白與水稻R/S基因?qū)?yīng)關(guān)系Table 1 Rice R/S genes targeted by TALEs of Xanthomonas oryzae

圖1 稻黃單胞菌TALE蛋白類型Fig.1 TALE proteins of Xanthomonas oryzae

稻黃單胞菌tal基因的發(fā)現(xiàn)以及TALE蛋白在病害中的作用,揭示了稻黃單胞菌tal基因是病菌毒性變異的主要決定因子。

3 稻黃單胞菌TALE蛋白調(diào)控水稻的抗(感)病性

現(xiàn)有證據(jù)表明,稻黃單胞菌TALE蛋白通過結(jié)合水稻中靶標(biāo)基因啟動子的EBE序列,激活靶標(biāo)基因表達(dá)。根據(jù)TALE蛋白在水稻中的靶標(biāo)基因功能,TALE蛋白有以下4種功能:

3.1 主要毒性因子(major virulence factor),靶向水稻感病基因

目前發(fā)現(xiàn),非洲Xoo菌株含有7～8個tal基因,而亞洲菌株多達(dá)18個左右。因白葉枯病菌主要從水稻中獲得蔗糖和果糖等營養(yǎng),病菌TALE蛋白作用于水稻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的啟動子上,利于病菌獲得營養(yǎng)。水稻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因主要是Clade Ⅲ家族的OsSWEET11a、OsSWEET13和OsSWEET14,分別被白葉枯病菌的PthXo1、PthXo2和PthXo3激活[5-6, 23],并且人工合成的TALE蛋白也可以激活OsSWEET12和OsSWEET15基因的表達(dá)[4](表1)。PthXo1僅在菲律賓6號小種PXO99A中發(fā)現(xiàn);而靶向OsSWEET13的PthXo2有5個變異的版本,相應(yīng)地,水稻中被PthXo2識別的EBE存在10個類型[24];靶向OsSWEET14的TALE蛋白,在亞洲菌株中為PthXo3和AvrXa7[25]。非洲栽培水稻的歷史不長,非洲菌株的TalF和TalC也可靶向OsSWEET14,但其結(jié)合的EBE不同于PthXo3[4, 26]。對OsSWEET11a、OsSWEET13和OsSWEET14基因的啟動子中被TALE蛋白識別的EBE同時進(jìn)行基因編輯,所創(chuàng)制的水稻材料廣譜抗水稻白葉枯病[24-25]。

白葉枯病菌的TALE蛋白還靶向水稻轉(zhuǎn)錄因子,例如PthXo7靶向OsTFIIAγ1[27],PthXo6和TalBMAI1靶向OsTFX1[27],TalBMAI1靶向OsERF#123[28](表1)。需要強(qiáng)調(diào)的是,雖然這些轉(zhuǎn)錄因子是感病基因,但它們被TALE蛋白激活后轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游基因并不清楚。

水稻條斑病菌的tal基因數(shù)量多達(dá)24～33個[16, 29]?？赡軛l斑病菌對營養(yǎng)的需求不同于白葉枯病菌,靶向水稻感病基因的TALE蛋白目前已知的有2個:一是Tal2g和Tal5d,都靶向硫化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因OsSULRT3;6[7, 30];另一是Tal2b和Tal2c,靶向2-酮戊二酸依賴型氧化酶基因OsF3H03g和OsF3H04g[31-32]。通過基因編輯技術(shù)突變OsSULRT3;6和OsF3H03g基因啟動子的EBE位點(diǎn),均提高了水稻對條斑病的抗性[30-31, 33]。目前還沒有發(fā)現(xiàn)誘捕水稻條斑病菌TALE蛋白的R基因,不過有意思的是在非寄主煙草中存在誘捕AvrXa10的R基因[34],提示可在水稻遠(yuǎn)緣種或非寄主植物中發(fā)掘抗條斑病的R基因,以期解決水稻中無抗條斑病抗源問題。

3.2 無毒因子(avirulence factor),激活執(zhí)行者(executor)基因

稻黃單胞菌除條斑病菌的Xop蛋白AvrRxo1被來自玉米的Rxo1識別[35],以及XopQ被本氏煙Nicotianabenthamiana中的ROQ1 [TNL,a nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein with a Toll-like interleukin-1 receptor (TIR) domain]識別[36]外,還沒有發(fā)現(xiàn)其他可識別Xop蛋白的R基因。白葉枯病菌抗病基因啟動子中的EBE可作為TALE蛋白的陷阱,如果TALE被捕捉,則該TALE蛋白為無毒因子。這種R基因產(chǎn)物也稱為執(zhí)行者(executor)(表1),定位于植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。這種“基因?qū)颉标P(guān)系的“抗病基因-無毒因子”包括:Xa7-AvrXa7[37-38]、Xa10-AvrXa10[39]、Xa23-AvrXa23[40]和Xa27-AvrXa27[41]。非常有意思的是,這些R基因介導(dǎo)的抗性對條斑病并不起作用[42]。目前認(rèn)為,Xa7和Xa23抗譜較廣,在水稻育種中已被普遍使用[1]。不過研究發(fā)現(xiàn),Xa7和Xa23抗性可被少數(shù)白葉枯病菌克服,應(yīng)當(dāng)在生產(chǎn)上結(jié)合病菌tal基因型檢測,合理利用Xa7和Xa23抗性[1,43]。

3.3 逃逸子(decoy),逃逸NLR類抗病性

水稻Xa1抗病基因是水稻上第一個被克隆的NLR類R基因[46],約20年后人們才發(fā)現(xiàn)稻黃單胞菌多種典型結(jié)構(gòu)的tTALE蛋白均可激活Xa1使水稻表現(xiàn)出抗性,而iTALE可抑制其抗性[21-22]。后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了Xa1的等位基因Xa2、Xa14、Xa45(t)、Xo1等NLR類R基因,它們的差異主要在93個氨基酸組成的LRR單元的重復(fù)數(shù)不同[47-48]。iTALE的發(fā)現(xiàn)揭示了白葉枯病菌和條斑病菌利用iTALE逃逸Xa1抗性的原因,并且iTALE在95%以上的病菌群體中存在[22, 48]。更為重要的是,不同于胞質(zhì)內(nèi)的NLRs,Xa1等NLR類蛋白定位在植物細(xì)胞核,并且tTALE激活Xa1不依賴于TALE與EBE的結(jié)合。揭示細(xì)胞核中NLR類抗性機(jī)制,有助于利用Xa1類R基因培育抗兩種細(xì)菌病害的水稻新品種。

3.4 轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor),與水稻基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子γ亞基形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體

稻黃單胞菌TALE蛋白識別水稻R或S基因啟動子中的EBE,轉(zhuǎn)錄調(diào)控R或S基因的表達(dá),前提是TALE蛋白需要與水稻基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子γ5亞基(OsTFIIAγ5)形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,才能保證R或S基因精準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄[45, 49-50]。OsTFIIAγ5也稱為Xa5,當(dāng)其39位氨基酸由纈氨酸變成為谷氨酸時(xa5),既抗白葉枯病[51],又抗條斑病[16],原因在于TALE蛋白不能與xa5結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體[45, 49]。當(dāng)水稻中存在xa5時,含有PthXo7的白葉枯病菌仍能導(dǎo)致病害發(fā)生,原因在于PthXo7誘導(dǎo)了OsTFIIAγ1的表達(dá),彌補(bǔ)了xa5的缺陷[49]。因此,含有xa5抗病基因的水稻,例如‘IRBB5’‘白香占’‘白絲占’和‘白粳占’,可抗白葉枯病和條斑病兩種水稻細(xì)菌病害[1,52]。

4 用于水稻白葉枯病和條斑病防控的殺菌劑

我國使用農(nóng)用鏈霉素、葉枯唑、噻枯唑、噻菌銅、壬菌銅等農(nóng)藥防治水稻白葉枯病和條斑病已近30年,病原菌已產(chǎn)生了抗藥性[53]。隨后噻唑鋅問世,并在此基礎(chǔ)上組合5%春雷霉素和35%噻唑鋅研發(fā)的40%春雷·噻唑鋅懸浮劑,解決了水稻細(xì)菌和真菌病害兼治問題[54-55]。同時利用生物農(nóng)藥防控水稻白葉枯病和條斑病的研究也取得突破性進(jìn)展,解淀粉芽胞桿菌BacillusamyloliquefaciensLx-11已被登記生產(chǎn)和使用[56]。最近報道,從水稻稻樁上分離的摩氏假單胞菌Pseudomonasmosselii923菌株,產(chǎn)生一種新型的小分子化合物咪唑三嗪(pseudoiodinine),對水稻稻瘟病、白葉枯病和條斑病均顯示了較好的生物防治效果,有望發(fā)展為綠色農(nóng)藥[57]。

5 水稻白葉枯病和條斑病綠色防控策略

根據(jù)稻黃單胞菌tal基因型與水稻抗病基因型的對應(yīng)關(guān)系[1]以及與感病基因型的對應(yīng)關(guān)系(表1),我國白葉枯病和條斑病的防控,應(yīng)遵循以下三種防控模式(圖2)。模式1:白葉枯病發(fā)生區(qū),種植Xa7或Xa23抗病水稻品種。模式2:條斑病發(fā)生區(qū)或兩種細(xì)菌病害混合發(fā)生區(qū),種植xa5高抗水稻品種。經(jīng)過多年多點(diǎn)實(shí)踐,模式1和2對水稻兩種細(xì)菌病害的防控效果達(dá)94%以上,無需使用農(nóng)藥,或在病害零星發(fā)生時安慰性使用1次藥劑(Lx-11解淀粉芽胞桿菌懸浮劑或40%春雷·噻唑鋅懸浮劑)進(jìn)行防控。模式3:無xa5、Xa7和Xa23抗病水稻品種種植區(qū),兩種細(xì)菌病害發(fā)病初期使用40%春雷·噻唑鋅懸浮劑或Lx-11解淀粉芽胞桿菌懸浮劑1次,滅點(diǎn)保片;多雨季節(jié),兩種農(nóng)藥交替使用1～2次,防病效果也可達(dá)70%以上。

圖2 綠色防控水稻白葉枯病和條斑病模式Fig.2 Green control strategies for bacterial leaf blight and bacterial leaf streak in rice