彭靜靜，盧華娟，孫毓，劉辰星，王玲鈺，岳世陽，方鈺輝，劉小玲，王成華

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧 530004）

如何通過便利而經(jīng)濟的生產(chǎn)方式得到有機硒或單質(zhì)硒已成為近些年的研究熱點[1]。本課題組前期通過基因工程方法構建了一株谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）基因重組乳酸菌NZ9000/pNZ8148-GPx（簡稱NG1），利用了微生物廉價易得、方便培養(yǎng)、生長較快、產(chǎn)率較高的優(yōu)勢。雖然無機形態(tài)的Na2SeO3通過微生物的內(nèi)部代謝可轉(zhuǎn)化為有利于人體吸收的成分[2]，但高濃度的Na2SeO3會影響菌株的正常生長[3]；因NG1 應用了乳酸菌中最具代表性的乳酸鏈球菌素誘導控制的基因表達系統(tǒng)（nisin-inducible controlled gene expression，NICE）[4]，故乳酸鏈球菌素（Nisin）的誘導量是影響菌株發(fā)酵生產(chǎn)力的重要因素[5]；再者，每種細菌都有最適合自身生長的溫度和pH 值[6]，而pH 值是乳酸菌在發(fā)酵生產(chǎn)上得以應用的重要影響因素[7]。因此，以上4 個因素的優(yōu)化問題將成為NG1 工程菌得以開展后續(xù)發(fā)酵和應用研究的前提。

因乳酸菌具有富硒能力[8]，而益生菌富有維持腸道菌群生態(tài)平衡、抑菌、抗氧化等益生功能，故富硒乳酸菌具有益生菌和補硒的雙重功效[9]。Fuller[10]最早提出了“最好的菌種來源是分離自同種動物的胃腸道”的觀點。鑒于動物胃內(nèi)高膽鹽、強酸性的環(huán)境，勢必要求益生菌種具備相應的抗逆功能。由于谷胱甘肽過氧化物酶本身具有抗氧化、抗炎等作用[11-12]，本試驗所用GPx 重組乳酸菌有望成為集乳酸菌、乳酸菌代謝物和谷胱甘肽過氧化物酶三者優(yōu)勢于一體的新菌株。通過NG1 菌株體外的H2O2、膽鹽和酸度耐受試驗可評估其抗逆功能；通過與未導入GPx 基因的重組乳酸菌NZ9000/pNZ8148（簡稱NG0）的對比，可判斷外源GPx基因的導入對乳酸菌抗逆性能的影響?？傊疚膶Px 基因重組乳酸菌NG1 的培養(yǎng)溫度、初始pH 值、Na2SeO3濃度和Nisin 濃度4 個生長條件進行優(yōu)化，并對其體外抗逆功能指標進行分析，以期為后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)以及定殖于人體胃腸道內(nèi)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳酸菌NG1：廣西大學輕工學院食品生物技術實驗室保存的NZ9000/pNZ8148-GPx 重組乳酸菌；乳酸菌NG0：廣西大學輕工學院食品生物技術實驗室保存的NZ9000/pNZ8148 重組乳酸菌。

1.1.2 試劑

牛肉粉、酵母浸粉、大豆胨、蛋白胨、酪蛋白胨、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸鈉、硫酸鎂（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；氯霉素、乳酸鏈球菌素（均為生物級）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；亞硒酸鈉（生物級）：美國Sigma-Aldrich 公司；膽汁酸鹽（生物級）：大連美侖生物技術有限公司；30%過氧化氫（優(yōu)級純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

pH 計（A111）：美國Thermo Fisher Scientific 公司；立式自動壓力蒸汽滅菌器（GI80TW）：廈門致微儀器有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2F）：蘇州安泰空氣技術有限公司；酶標儀（M200 PRO）：瑞士TECAN 公司；超純水機（Mili-QAdvantageA10）：美國Millipore 公司；振蕩培養(yǎng)箱（ZQZY-85CS）：上海知楚儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082）：上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基和試劑的配制

1.3.1.1 培養(yǎng)基的配制

M17 培養(yǎng)基：5 g/L 牛肉粉、2.5 g/L 酵母浸粉、5 g/L大豆胨、2.5 g/L 蛋白胨、2.5 g/L 酪蛋白胨、19 g/L β-甘油磷酸鈉、0.5 g/L 抗壞血酸鈉和0.25 g/L 硫酸鎂，pH7.0～7.4。配制固體平板時在此基礎上加15 g/L 瓊脂粉。各成分按照比例加入后用蒸餾水定容至所需體積，并經(jīng)103.4 kPa、115 ℃高壓滅菌20 min 后使用。

GM17 培養(yǎng)基：將已滅菌冷卻的葡萄糖和M17 培養(yǎng)基混合，使葡萄糖終濃度為0.5%。

GM17（Cr+）培養(yǎng)基：添加了氯霉素（終濃度為12.5 μg/mL）的GM17 培養(yǎng)基。

1.3.1.2 試劑的配制

25 mg/mL 氯霉素：將氯霉素按配比溶于無水乙醇中，過膜除菌，凍藏待用。

100 mg/mL Na2SeO3：將Na2SeO3按配比溶于無菌超純水中，過膜除菌，凍藏待用。100 μg/mL Nisin：將Nisin 按配比溶于0.05%醋酸中，過膜除菌，凍藏待用。

1.3.2 菌株的常規(guī)活化培養(yǎng)

取實驗室保存的NG1 和NG0 原始菌種，均采用分區(qū)劃線法接種于GM17（Cr+）平板上，30 ℃、過夜靜置培養(yǎng)；挑取單菌落并接種至GM17（Cr+）液體培養(yǎng)基中，裝液量為7 mL/30 mL 直型瓶，30 ℃、過夜靜置培養(yǎng)，活化2～3 代后即可作為菌液使用。

1.3.3 生長曲線的測定

以1%接種量將活化后的NG1 菌液接種于GM17（Cr+）液體培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h；每隔2 h 取樣測定一次發(fā)酵液中乳酸菌NG1 在600 nm 處的吸光值（OD600值）；以菌株培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制菌株的生長曲線。

1.3.4 生長條件的單因素優(yōu)化試驗

以GM17（Cr+）為基礎培養(yǎng)基，分別考察培養(yǎng)溫度（30、35、37、40 ℃）、液體培養(yǎng)基的初始pH 值（3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0）、Na2SeO3濃度（0、20、40、60、80、100、120 μg/mL）、Nisin 濃度（0、1、5、10、20、30、40、50 μg/mL）對乳酸菌NG1 生長的影響，即通過該菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長后期（即按1%接種量擴培后養(yǎng)菌至18 h）能達到的最大OD600值來獲取最優(yōu)的單因素培養(yǎng)條件。

1.3.5 響應面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

在單因素試驗的基礎上，選取對乳酸菌NG1 生長影響較顯著的三因素三水平，繼續(xù)以培養(yǎng)溫度（A）、初始pH 值（B）和Na2SeO3濃度（C）為考察變量，以菌液OD600值（Y）為響應值，并通過Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken 設計完成響應面分析試驗[13-14]。因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface method

1.3.6 體外耐受試驗

用30% H2O2原溶液及其稀釋液配制含H2O2濃度分別為0、0.1、0.4、0.7、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L 的GM17（Cr+）液體培養(yǎng)基；配制含膽汁酸鹽濃度分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%的GM17（Cr+）液體培養(yǎng)基；用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 分別調(diào)配pH 值為2.0、3.0、4.0、5.0 和6.0 的GM17（Cr+）液體培養(yǎng)基。分別取以上3 種模擬胃腸道極端環(huán)境[15]的培養(yǎng)基200 μL 于酶標板孔中，將NG1 以1%的接種量完成接種，做兩組平行；30 ℃靜置脅迫培養(yǎng)約18 h，測定菌液對數(shù)后期的OD600值；以NG0 為空白對照，同時以響應面試驗篩選出的最優(yōu)生長條件脅迫培養(yǎng)NG1作為對照組。

1.3.7 菌體耐受能力測定

測定不同脅迫條件下的菌液對數(shù)生長后期（即按1%接種量擴培后養(yǎng)菌至18 h）的OD600值，計算菌種不同脅迫條件下的耐受能力，公式[16]如下。

N=（X/K）×100

式中：N為耐受能力，%；X為脅迫條件下菌液的OD600值；K為空白培養(yǎng)基的OD600值。

2 結果與分析

2.1 生長條件的單因素優(yōu)化結果

培養(yǎng)溫度、初始pH 值、Na2SeO3濃度和Nisin 濃度對乳酸菌NG1 的生長影響如圖1所示。

圖1 不同培養(yǎng)溫度、初始pH 值、Na2SeO3 濃度、Nisin 濃度下乳酸菌NG1 的生長曲線Fig.1 NG1 growth curves under different temperatures，pH values，Na2SeO3 concentrations，and Nisin concentrations

由圖1a 可知，在14 h 前，乳酸菌NG1 在37 ℃的培養(yǎng)溫度下生長略有滯后，40 ℃下生長明顯滯后；30 ℃和35 ℃

條件下生長趨勢比較一致；但培養(yǎng)至18 h 時，37 ℃培養(yǎng)的菌體在對數(shù)末期的OD600值最大。故確定NG1 的最適生長溫度為37 ℃。

由圖1b 可知，乳酸菌NG1 在pH3.0 和pH4.0 條件下生長被嚴重抑制；隨著培養(yǎng)基初始pH 值升高，NG1生長狀況越來越好；至pH7.5 時，NG1 生長速率和OD600值均為最高，在18 h 也是最高值；而pH 值高于7.5后，隨著堿度增大，菌體生長速率逐漸減緩；在pH 值為10.0 的培養(yǎng)基中，NG1 也能正常生長。綜上，pH7.5 為NG1 的最適生長初始pH 值，且NG1 適宜生長培養(yǎng)基為弱堿性，即菌體對堿性環(huán)境的耐受能力強于酸性環(huán)境。

由圖1c 可知，前20 h 內(nèi)，不同Na2SeO3濃度（0～120 μg/mL）對乳酸菌NG1 的生長影響整體呈抑制趨勢，但相對于其它組，40 μg/mL 的富硒濃度下NG1 生長狀況最好；故確定NG1 最適生長的Na2SeO3濃度為40 μg/mL。這比乳桿菌株JZ-07[17]和鼠李糖乳桿菌ATCC 53103[18]的最佳富硒誘導劑量10 μg/mL 高，但與布氏乳桿菌922-11[19]的最佳富硒誘導劑量43～46 μg/mL相近。

由圖1d 可知，Nisin 的加入量為0～50 μg/mL 時對NG1 生長影響不明顯，生長趨勢大體一致，OD600值也相差不大。因此，Nisin 濃度不作為后續(xù)響應面優(yōu)化和驗證的考察因素。

2.2 響應面試驗設計結果與分析

2.2.1 響應面試驗的設計與方差分析

NG1 生長條件的響應面設計分析結果見表2。

表2 NG1 生長條件優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and result of response surface method for growth condition optimization of NG1

對表2 數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程為Y=0.76-0.15A+0.071B+0.073C+0.055AB+0.12AC+0.052BC-0.10A2-0.12B2+0.046C2。對上述回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表3 模型回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表3 結果表明：模型P=0.001 6<0.01，失擬項P=0.107 9＞0.05，說明模型顯著；判定系數(shù)R2=0.940 5，接近于1，即實際值和預測值接近，說明模型擬合性較好；調(diào)整判定系數(shù)R2Adj=0.864 0，說明該模型能夠解釋86.40%試驗數(shù)據(jù)的變化；變異系數(shù)為9.46%（<10%），說明模型的可信度和精確度較高。因此，可用此模型分析與預測NG1 在不同條件下的生長狀況。一次項A、交互項AC、二次項B2影響極顯著（P<0.01）；一次項B和C、二次項A2影響顯著（P<0.05）；交互項AB和BC、二次項C2影響不顯著（P>0.05）。

2.2.2 響應面的交互作用分析

培養(yǎng)溫度、初始pH 值、Na2SeO3濃度3 個因素兩兩之間交互作用的響應面圖如圖2所示。

圖2 不同培養(yǎng)溫度、初始pH 值、Na2SeO3 濃度交互作用對NG1生長影響的響應曲面與等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between different cultivation temperatures，initial pH values，and Na2SeO3 concentrations on the growth of NG1

由圖2 可知，隨著單因素培養(yǎng)溫度或培養(yǎng)基初始pH 值的升高，乳酸菌NG1 生長均呈現(xiàn)先加快后放緩的趨勢，且均存在極高值點；隨著單因素Na2SeO3濃度升高，菌體生長狀況越來越好。此外，因響應面3D 曲面圖坡度和等高線反映了因素間交互作用的強弱[20]，那么通過對比可以判斷三因素間只有AC交互作用極顯著，且與模型方差分析結果一致。

2.2.3 最優(yōu)生長條件的確定

運用Design-Expert 8.0.6 軟件設計三因素三水平試驗方案，以及分析試驗數(shù)據(jù)和建立模型后，對回歸方程求解得到模型最大值，即最優(yōu)生長條件：培養(yǎng)溫度36 ℃，初始pH7.6，Na2SeO3濃度59 μg/mL，此時菌體OD600值預測為0.86。在預測最佳培養(yǎng)條件下進行誘導試驗，做3 個重復，所得菌體的實際OD600值為0.87，與預測值接近，說明該模型合理可行的。

2.3 乳酸菌NG1 的富硒強度和色差

不同濃度Na2SeO3對乳酸菌富硒色澤的影響如圖3所示。

圖3 添加不同濃度的Na2SeO3 對乳酸菌富硒色澤的影響Fig.3 Effect of different concentrations of Na2SeO3 on Se-enriched colour of lactic acid bacteria

由圖3 可知，在單因素和響應面試驗過程中，在不同無機硒（Na2SeO3）濃度的富硒培養(yǎng)條件下，隨著菌體生長，不同菌液培養(yǎng)體系因為析出紅色單質(zhì)硒而呈現(xiàn)不同程度的紅色[21]。在其他培養(yǎng)條件統(tǒng)一時，即在培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)基初始pH7.3 和不加Nisin 條件下，菌體的紅色會隨加入的Na2SeO3濃度升高而變深，即富硒作用加強。

2.4 NG1 抗逆功能的測定結果

NG1 在不同濃度H2O2、膽汁酸鹽以及不同酸度下的耐受力和生長OD600值分別如表4～表6 和圖4所示。

表4 NG1 在不同濃度H2O2 下的耐受力Table 4 Tolerance of NG1 in different concentrations of H2O2

表6 NG1 在不同酸度下的耐受力Table 6 Tolerance of NG1 in different acidity

由表4 和圖4a 可知，相對于NG0，0～1.5 mmol/L H2O2濃度梯度下，NG1 的生長幾乎不受影響；當H2O2濃度高于1.5 mmol/L 后，OD600值降低明顯，NG1 在兩種培養(yǎng)條件下的生長均受到抑制，說明其H2O2最高耐受濃度為1.5 mmol/L。當H2O2濃度低于1.0 mmol/L時，優(yōu)化培養(yǎng)的NG1 對H2O2耐受能力比空白對照組明顯增強。這個結果與酸粥中篩選出的乳酸菌在含1.0 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基中仍生長良好的情況[22]一致。

圖4 NG1 在不同濃度H2O2、膽汁酸鹽及不同酸度下的生長OD600 值Fig.4 Growth OD600 of NG1 at different concentrations of H2O2，bile acid salts，and acidity

由表5 和圖4b 可知，膽汁酸鹽濃度為0.10%～0.20%時，隨著膽汁酸鹽濃度的升高，NG1 耐受力逐漸降低；當膽汁酸鹽濃度高于0.20%時，OD600值降低明顯，優(yōu)化培養(yǎng)的NG1 生長受到明顯的抑制，常規(guī)培養(yǎng)的NG1 生長率也略微降低，說明其膽汁酸鹽最高耐受濃度為0.20%。優(yōu)化培養(yǎng)的NG1 在膽汁酸鹽0.05%～0.20%濃度下耐受能力達到39.5%～55.8%，較對照組有明顯增強。因此，NG1 同其它乳酸菌[23-24]一樣對膽汁酸鹽的耐受力比較高。

由表6 和圖4c 可知，當pH 值低于6.0 時，OD600值降低明顯，NG0 和NG1 的生長均受到抑制，說明其酸度的最大耐受值為pH6.0；而且NG0 在pH6.0 時對酸度的耐受能力比NG1 明顯增強，說明NG1 耐酸性能較弱。這一結果與李利等[25]對幾株乳酸菌篩選出的pH6.0的耐酸度一致；而來自動物的很多乳酸菌在pH4.0 下仍能保持活力[26]，表示出更強的耐酸性。

綜上，NG1 對H2O2濃度、膽汁酸鹽濃度、酸度的最大耐受值分別為1.5 mmol/L、0.20%、pH6.0；耐受能力排序為優(yōu)化培養(yǎng)NG1>常規(guī)培養(yǎng)NG1>常規(guī)培養(yǎng)NG0，說明GPx 基因的導入對乳酸菌的抗H2O2和膽汁酸鹽脅迫功能有增強作用，且在最優(yōu)培養(yǎng)條件下得到強化，但對酸度耐受性無明顯增強作用。據(jù)悉，人體小腸液因含有胰蛋白酶、膽汁酸等，其pH 值約為7.6，膽汁酸鹽質(zhì)量分數(shù)在0.03%～0.3%之間波動[27]。故腸道pH 值并不是乳酸菌進入消化道發(fā)揮作用的阻礙因素，更多的是胰蛋白酶和膽汁酸鹽的存在影響了乳酸菌的生長[28]。而人體胃液pH 值在空腹和進食后在0.9～5.0 之間波動。故胃液的強酸環(huán)境才是脅迫乳酸菌生長的主要因素。因此，乳酸菌NG1 一定程度上具備了食用價值和定植于腸道的潛能。

3 結論

本研究采用單因素試驗和響應面分析法優(yōu)化GPx基因重組乳酸菌NG1 的生長條件，確定了NG1 的最適生長條件為培養(yǎng)溫度36 ℃、初始pH7.6、Na2SeO3濃度59 μg/mL。此外，通過3 項模擬胃腸道環(huán)境的體外抗逆功能研究，確定了NG1 對各脅迫因素的最高耐受值為H2O21.5 mmol/L、膽汁酸鹽0.20%、pH6.0。由于耐受能力排序為優(yōu)化培養(yǎng)NG1>常規(guī)培養(yǎng)NG1>常規(guī)培養(yǎng)NG0，說明GPx 基因的導入對乳酸菌的抗H2O2和膽汁酸鹽脅迫功能有增強作用，且在最優(yōu)培養(yǎng)條件下得到強化，但對酸度耐受性無明顯增強作用。綜上所述，該研究結果表明NG1 具有被食用和定植于腸道的極大潛能，同時可為更多來源的硒蛋白及富硒乳酸菌的基礎研究及其在食藥方面的市場應用提供重要參考。