劉喆，周俊男，黃琬婷，王哲，劉家裕，那廣寧

（沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順 113122）

玉米須，禾本科植物，在我國各地均有種植，存在于玉米柱頭處，通常呈黃綠色或紅棕色，光澤暗淡，無不良異味。一般以松散的方式纏繞在一起，呈現(xiàn)團(tuán)狀，完整的玉米須長度可達(dá)20～30 cm。玉米須性味味甘、淡。有利尿消腫、清肝利膽的功效[1]。隨著玉米加工產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，玉米須也逐漸受到了廣泛的關(guān)注。

水芹，又名水芹菜、野芹菜，多年生傘形科草本植物，莖直立，基生葉有柄，部有葉鞘；子葉形狀為三角形，花期6月份～7月份，一般采用無性繁殖。水芹具有清熱利尿、解毒消腫、止血和降壓等功效[2]。

玉米須水芹酒將二者進(jìn)行混合發(fā)酵，豐富酒品口感同時(shí)富有一定的生理功能。玉米須水芹酒中富含黃酮、皂苷、甾醇、多糖等有效成分，能恢復(fù)和提高胰島的分泌功能，還具有降低血壓、利尿、抗氧化等效果。有研究者利用有機(jī)溶劑將玉米須中的黃酮進(jìn)行萃取，考察其對自由基的清除效果，發(fā)現(xiàn)萃取物均具有抗氧化性，且抗氧化性與黃酮含量呈正相關(guān)[3-5]。本試驗(yàn)以玉米須和水芹為主要發(fā)酵原料，探究不同水芹汁和玉米須汁體積比、菌種添加量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對其品質(zhì)的影響，為發(fā)酵酒的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

玉米須、野生水芹、白砂糖：市售；釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（5 萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；偏重亞硫酸鉀：上海展云化工有限公司；FeSO4、H2O2、水楊酸（均為分析純）：山東三元生物科技股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

MC 型電子天平：上海民橋精密科技儀器有限公司；LYT-980 型酒精測量儀：河北青縣儀器有限公司；SPX-150 型恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SB25-12DTDN 型超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UV-721 型分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；ANS-978 打漿機(jī)：廣東奧諾斯電器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

新鮮水芹→清洗、挑選→破碎榨汁→添加果膠酶→取上清液與玉米須汁混合→加入活化菌種→加糖→主發(fā)酵→倒罐→后發(fā)酵→過濾→成品。

1.2.2 操作要點(diǎn)

原料挑選：挑選新鮮完整、粗纖維含量少的綠色水芹；無蟲蛀、無病斑的玉米須，剔除其中的不良雜質(zhì)，洗去表面污漬。

破碎榨汁：將新鮮水芹切成1 cm3大小的塊狀，與純凈水以1 ∶30 體積比混合，置于打漿機(jī)中打漿備用，制得水芹汁，并將其與玉米須汁按照一定的體積比混合。

主發(fā)酵：用20 mL 的溫水（20 ℃左右）活化釀酒酵母，加入混合汁中裝罐密封發(fā)酵。

后發(fā)酵：發(fā)酵7 d 后，玉米須汁與水芹汁的殘?jiān)呀?jīng)明顯沉到罐底，應(yīng)及時(shí)過濾掉殘?jiān)?，更換發(fā)酵罐，在10 ℃的條件下繼續(xù)陳釀。

過濾裝瓶：將發(fā)酵完成的酒進(jìn)行精濾，靜置12 h后取上清液進(jìn)行裝瓶。裝瓶前每100 L 加入10～20 g 偏重亞硫酸鉀，貯存一段時(shí)間后，進(jìn)行感官評價(jià)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

分別控制水芹汁與玉米須汁體積比（1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1）、菌種添加量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）、發(fā)酵溫度（15、20、25、30、35 ℃）以及發(fā)酵時(shí)間（5、10、15、20、25 d），以酒精度、感官評分為評價(jià)指標(biāo)，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對發(fā)酵酒品質(zhì)的影響。

1.2.4 感官評定

選取30 名食品專業(yè)人員根據(jù)GB 2758—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵酒及其配制酒》對玉米須水芹酒的外觀、香氣、口感和典型性4 個(gè)方面進(jìn)行感官評分，滿分100 分，感官評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria

1.2.5 測定指標(biāo)

應(yīng)用LYT-980 型酒精測量儀測定玉米須水芹酒的酒精度。

1.2.6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合Design-Expert 軟件進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以感官評分為考察指標(biāo)，選用水芹汁與玉米須汁體積比（A）、菌種添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）和發(fā)酵溫度（D）進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)[6-8]，發(fā)酵因素水平見表2。

表2 發(fā)酵因素水平Table 2 Levels and factors of fermentation

1.2.7 玉米須水芹酒對羥自由基清除率的測定

將玉米須水芹酒稀釋后，分別配制成不同質(zhì)量濃度的樣液（0.40、0.70、1.00、1.30、1.60 g/L），吸取1.5 mL 樣品溶液于試管中并依次加入5 mL 2.5 mmol/L FeSO4溶液、5 mL 1 mmol/L H2O2溶液，搖勻后，再向其加入5 mL 5 mmol/L 水楊酸溶液，在38 ℃水溶鍋中加熱55 min，冷卻至室溫（25 ℃），測得吸光度A1，重復(fù)上述操作，用5 mL 蒸餾水代替5 mL H2O2溶液測定其吸光度，記錄為A2，用蒸餾水代替樣液作為空白對照，吸光度為A0，同時(shí)以VC作陽性對照試驗(yàn)[9-10]。羥基自由基清除率（Y，%）計(jì)算公式如下。

Y=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，應(yīng)用SPSS 16 和Origin Pro 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，不同處理間的數(shù)據(jù)采用多重比較方法，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同水芹汁與玉米須汁體積比對酒品質(zhì)的影響

不同水芹汁與玉米須汁體積比對酒品質(zhì)的影響見圖1。

圖1 不同水芹汁與玉米須汁體積比對酒品質(zhì)的影響Fig.1 Influence of different proportions of cress juice and corn whisker juice on wine quality

由圖1 可知，隨水芹汁與玉米汁比例的增大，酒精度與感官評分均呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，并在體積比為1 ∶1 時(shí)評分最高，說明此時(shí)發(fā)酵效果最佳，此時(shí)酒精度為10.7%vol，感官評分為87。在水芹汁與玉米須汁體積比為1 ∶1～2 ∶1 時(shí)，發(fā)酵酒的感官評分開始呈現(xiàn)下降的趨勢，說明酒已經(jīng)超過了最佳的發(fā)酵時(shí)間，過度發(fā)酵導(dǎo)致其感官品質(zhì)有所下降，使酒體苦澀。因此，選擇水芹汁與玉米須汁體積比為1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 不同菌種添加量對酒品質(zhì)的影響

不同菌種添加量對酒品質(zhì)的影響見圖2。

圖2 不同菌種添加量對酒品質(zhì)的影響Fig.2 Influence of different bacteria addition amount on wine quality

由圖2 可知，隨著菌種添加量的增加，酒精度整體呈穩(wěn)步上升至最高點(diǎn)后趨于穩(wěn)定，感官評分先上升后略有下降趨勢，可能是由于菌種添加量過大而沒有完全被利用，使過量的菌種沉到罐底，影響了整體感官評分。菌種添加量在0.5%～0.6%變化最明顯，上升幅度最大，并在添加量為0.6%時(shí)達(dá)到峰值。此時(shí)酒體清澈透亮，濃郁純正。因此，選擇菌種添加量0.5%、0.6%、0.7%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 不同發(fā)酵時(shí)間對酒品質(zhì)的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對酒品質(zhì)的影響見圖3。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of different fermentation time on wine quality

由圖3 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酒精度與感官評分先大幅度升高至最高點(diǎn)后緩慢下降，并在發(fā)酵時(shí)間為20～25 d 時(shí)趨于穩(wěn)定狀態(tài)，說明此時(shí)發(fā)酵已經(jīng)結(jié)束。在發(fā)酵時(shí)間為10 d 時(shí)，感官評分最高，為88，酒精度為11.5% vol，此時(shí)原料香與酒香的融合協(xié)調(diào)，層次分明。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為5、10、15 d 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 不同發(fā)酵溫度對酒品質(zhì)的影響

不同發(fā)酵溫度對酒品質(zhì)的影響見圖4。

圖4 不同發(fā)酵溫度對酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effects of different fermentation temperatures on wine quality

由圖4 可知，隨著發(fā)酵溫度的逐步升高，酒精度逐漸增大，當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，酒精度為11.4% vol，此時(shí)感官評分達(dá)到最大值，為86。此時(shí)酒體色澤澄清透亮，香氣悠長。當(dāng)發(fā)酵溫度高于25 ℃時(shí)，酒精度緩慢升高并逐漸趨于平緩，感官評分下降，說明在發(fā)酵溫度較高時(shí)，釀酒酵母發(fā)酵速度過快，導(dǎo)致酒香流失，酵母味厚重，酒體渾濁不清，酒味不純。綜合考慮，選擇發(fā)酵溫度20、25、30 ℃進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 玉米須水芹酒響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 3 Box-Behnken test scheme and results

表4 響應(yīng)面方差分析Table 4 Response surface ANOVA

續(xù)表4 響應(yīng)面方差分析Continue table 4 Response surface ANOVA

應(yīng)用Design-Expert 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立感官評分（Y）與A（水芹汁與玉米須汁體積比）、B（菌種添加量）、C（發(fā)酵時(shí)間）和D（發(fā)酵溫度）之間的模型，從而得到二次回歸方程為Y=86.20-0.58A+0.83B+1.25C+1.83D-0.75AB-2.25AC-0.25AD+1.00BC-3.25BD-2.50CD-0.39A2-2.27B2-10.14C2-6.27D2。

由表4 可知，該模型影響高度顯著（P＜0.001），各因素之間存在顯著的差異，失擬項(xiàng)（P=0.059 8＞0.05）差異不顯著，說明此模型穩(wěn)定性較好。決定性系數(shù)R2=0.961 0，校正系數(shù)R2adj=0.921 9，說明感官評定的結(jié)果與預(yù)測值結(jié)果有相對較好的穩(wěn)合性。二次項(xiàng)C2和D2影響高度顯著（P＜0.001），一次項(xiàng)D、交互項(xiàng)BD和二次項(xiàng)B2對感官評分的影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)AC、CD對感官評分的影響顯著（P＜0.05），各因素能夠明確反映響應(yīng)值的變化。

2.3 響應(yīng)面交互作用分析

以感官評分為評價(jià)指標(biāo)，分析BD、CD間的交互作用對玉米須水芹酒感官評分的影響，見圖5、圖6。坡面傾斜程度越大，說明影響因子對響應(yīng)值的影響越大；坡面傾斜程度越小，則說明影響因子對響應(yīng)值影響?。坏雀呔€越趨近于橢圓形，說明交互項(xiàng)之間作用顯著；等高線趨近于圓形，說明交互項(xiàng)之間不顯著，交互作用幾乎可以忽略。

圖5 菌種添加量和發(fā)酵溫度交互作用對感官評分的影響Fig.5 Effects of the interaction of strain addition amount and fermentation temperature on sensory score

圖6 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度交互作用對感官評分的影響Fig.6 Effects of interaction of fermentation time and temperature on sensory score

通過三維響應(yīng)面作圖，可以直觀地觀察到BD、CD間交互作用對酒感官評分的影響。由圖5 可知，隨著菌種添加量（B）和發(fā)酵溫度（D）的增加，感官評分整體先逐步上升達(dá)到最高值后又趨于下降，D的曲面傾斜坡度較大，說明D對整體感官評分的影響相對較大，等高線呈橢圓形，說明B與D之間的交互作用對酒的感官評分有顯著影響。由圖6 可知，感官評分隨發(fā)酵時(shí)間（C）及發(fā)酵溫度（D）的增加而增加，至峰值后逐漸降低，說明感官評分已經(jīng)接近最大值，且存在一定的傾斜，CD交互作用相對顯著。

2.4 最佳工藝條件的預(yù)測與檢驗(yàn)

利用響應(yīng)面軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳生產(chǎn)工藝條件為水芹汁∶玉米須汁=1 ∶2（體積比）、菌種添加量0.64%、發(fā)酵時(shí)間10.93 d、發(fā)酵溫度25.17 ℃。感官評分為87.04?？紤]到試驗(yàn)操作的實(shí)際可行性，更改工藝條件為水芹汁∶玉米須汁=1 ∶2（體積比）、酵母添加量0.6%、發(fā)酵時(shí)間11 d、發(fā)酵溫度25 ℃。在此工藝條件下，進(jìn)行5 次平行試驗(yàn)，制得玉米須水芹酒的酒色光亮、香氣馥郁、口味純正，其感官評分為87.13，與預(yù)期值存在差異較小。結(jié)果表明，響應(yīng)面法對玉米須水芹酒工藝條件的優(yōu)化值可靠。

2.5 抗氧化活性分析

以VC作為對照試驗(yàn)，將玉米須水芹酒進(jìn)行不同程度的稀釋，計(jì)算不同質(zhì)量濃度酒的所對應(yīng)的羥基自由基清除率，如圖7所示。

圖7 羥自由基清除能力Fig.7 Scavenging capacity of hydroxyl radical

由圖7 可知，隨著酒質(zhì)量濃度的增加，對·OH 清除能力呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢，表明玉米須水芹酒對·OH 有一定的清除作用。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對與水芹汁與玉米須汁體積比、菌種添加量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果表明：在水芹汁∶玉米須汁=1 ∶2（體積比），酵母添加量0.6%，發(fā)酵時(shí)間11 d，發(fā)酵溫度25 ℃時(shí)，制得的玉米須水芹酒顏色呈淡黃色，酒體澄清，酒香醇厚，感官評分為87.13。以VC作為陽性對照，以羥基自由基的清除率作為玉米須水芹酒的抗氧化活性指標(biāo)，結(jié)果顯示，玉米須水芹酒具有一定的抗氧化能力。