劉垚，王展，李鑫江，劉湘銘，呂和孺，王寒梅，趙雪*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.青島市中心醫(yī)院內鏡中心，山東青島 266042）

目前研究發(fā)現(xiàn)，廣譜抗生素（甲硝唑、環(huán)丙沙星、青霉素、克林霉素）的濫用會導致腸道微生物群紊亂，增加炎癥性腸病和致病性細菌感染的風險，尤其是艱難梭菌感染，占抗生素相關腹瀉病例的10%～20%[1]。艱難梭菌毒素A（Clostridium difficiletoxin A，TcdA）和艱難梭菌毒素B（Clostridium difficiletoxin B，TcdB）是艱難梭菌產生的主要毒力因子，它可以促進腸道炎癥[2]，從而導致腹瀉、假膜性結腸炎、毒性巨結腸和結腸穿孔。使用萬古霉素和甲硝唑等抗生素進行治療會進一步破壞腸道微生態(tài)，進而引發(fā)復發(fā)率更高和癥狀更嚴重的結腸炎[3-4]，給病人造成極大痛苦和經濟負擔。因此預防艱難梭菌感染對抗生素治療的病人至關重要。目前，艱難梭菌疫苗、腸道菌群移植、益生菌、噬菌體治療法等生物治療方法均存在著一定的不足和危險[5]。因此尋找一種安全、無副作用的抗艱難梭菌侵染的活性物質是目前研究的熱點。

巖藻聚糖是一種天然的由巖藻糖和硫酸根組成的復雜硫酸多糖，具有抗凝血、免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗炎癥、抑制細胞凋亡和抑制病毒感染等生物活性[6-8]。有研究表明，來自奧氏海藻（Cladosiphon okamuranus）和墨角藻（Fucus vesiculosus）的巖藻聚糖在小鼠慢性結腸炎和葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導的急性結腸炎中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗炎活性，同時對腸上皮屏障功能和細胞旁通透性具有良好的保護作用[9-11]。Barreto 等[12]發(fā)現(xiàn)，在由艱難梭菌毒素A 而引發(fā)的結腸炎中，巖藻聚糖可以使結腸組織中炎癥水平顯著降低。相關研究表明，巖藻聚糖的活性與其腸道菌群代謝產物（尤其是短鏈脂肪酸）密切相關，巖藻聚糖在結腸部位被腸道微生物酵解會產生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，提高腸道中的乳酸桿菌、腸桿菌、異丙戊酸桿菌和反芻菌科的數(shù)量，減少機會致病菌的數(shù)量，從而調節(jié)腸道菌群[13-15]。因此，巖藻聚糖在調節(jié)腸道菌群、預防和治療腸道炎癥方面具有較好的潛質。但是抗生素會嚴重破壞腸道菌群，導致擬桿菌、鼠桿菌等多糖利用菌的相對豐度顯著下降，進而改變巖藻聚糖在腸道中的代謝產物[16-17]。但目前沒有相關研究證明，在抗生素造成的腸道菌群紊亂從而導致的艱難梭菌腸炎中，巖藻聚糖是否仍有活性作用。

本研究使用頭孢哌酮誘導的腸道紊亂小鼠模型，探究巖藻聚糖對艱難梭菌感染和產毒、腸道菌群紊亂和炎癥因子表達的影響，旨在揭示巖藻聚糖對抗生素相關艱難梭菌結腸炎的預防作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶：市售；葡聚糖標準品、單糖標準品、頭孢哌酮、克林霉素：美國Sigma 公司；乙腈（色譜純）：德國Merck 公司；艱難梭菌VPI 10463（ATCC43255）：美國ATCC 菌種保藏中心；萬古霉素：大連美侖生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）：武漢賽維爾生物科技有限公司；PowerFecalTMDNA 分離試劑盒：美國MoBio 公司；小鼠TcdA、TcdB 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒：江蘇晶美生物科技有限公司；總RNA抽提試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；熒光定量轉錄試劑盒：上海Abcam 公司；TruSeqTMDNA 樣本制備試劑盒：美國Illumina 公司；醋酸、無水乙醇、硫酸鈉（Na2SO4）、氫氧化鉀（KOH）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Nicolet-Nexus 470 型傅里葉紅外光譜儀、Q Exactive Plus LCMS 質譜儀、Ul-tiMate 3000 型高效液相色譜儀、電噴霧LTQ-Orbitrap XL 型質譜儀、IonPac AS11-HC 分離柱（4 mm×250 mm）：美國Thermo Fisher 公司；1260 型高效液相色譜儀器、ZORBAX EC-C18 分離柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）：美國Agilent 公司；ICS-2000 型離子色譜儀：美國Dionex 公司；TSK-gel G3000 PWx 分析柱（8.0 mm×300 mm，10 μm）：日本東曹株式會社；855-AC 型厭氧操作箱：美國Plas-Labs 公司；Eclipse E10 正置光學顯微鏡：日本Nikon 公司；SIGMA 1-1 型高速冷凍離心機：美國Sigma 公司；FQD-96C 型熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 巖藻聚糖的制備

以海帶為原料，用酸浸泡、熱水提取和醇沉淀，得到巖藻聚糖粗糖[18]，經10 kDa 的透析袋透析，直至透析液pH 值為7 左右，收集透袋內液體，冷凍干燥，得到試驗所需巖藻聚糖。

1.3.2 巖藻聚糖的化學性質檢測

1.3.2.1 巖藻聚糖分子量的測定

采用高效凝膠排阻色譜法（high perfomance size exclusion chromatography，HPSEC）測定巖藻聚糖的分子量。高效液相色譜儀為Agilent 1260，分析柱為TSK-gel G3000 PWx（8.0 mm×300 mm，10 μm），流動相為0.1 mol/L Na2SO4。使用分子量為5 220、11 600、48 600、147 600、273 000 Da 的葡聚糖標準品，以葡聚糖標準品分子量的對數(shù)（lgM）和保留時間（t）作圖，得到回歸方程（y=-0.156 1x+7.181 6，R2=0.980 5），根據(jù)標準曲線計算樣品中硫酸多糖的重均分子量（weight-average molecular weight，Mw）、數(shù)均分子量（number-average molecular weight，Mn）和分散系數(shù)[19]。分散系數(shù)的計算公式如下。

I=W/N

式中：I為分散系數(shù)；W為重均分子量，kDa；N為數(shù)均分子量，kDa。

1.3.2.2 巖藻聚糖硫酸根含量的測定

采用高效陰離子交換色譜法測定巖藻聚糖中硫酸根含量，分離柱為IonPac AS11-HC（4 mm×250 mm），淋洗液及流速為9 mmol/L KOH、1.0 mL/min。

1.3.2.3 巖藻聚糖單糖組成的測定

采用PMP 柱前衍生高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定巖藻聚糖的單糖組成，色譜柱為分離柱ZORBAX EC-C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）。流動相A 為18%乙腈（0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解），流動相B 為35%乙腈（0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解）[20]。

1.3.2.4 巖藻聚糖的紅外光譜掃描

將KBr 在110 ℃烘箱內烘干5 h 徹底脫水后，與巖藻聚糖樣品磨粉、壓制成片，利用傅里葉紅外光譜掃描儀掃描4 000～500 cm-1波數(shù)范圍內的光譜吸收值[21]。

1.3.3 艱難梭菌腸炎小鼠模型的建立和給藥方式

無菌操作臺內，將艱難梭菌加入腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（brain heart infusion ，BHI）中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h 后復蘇。將復蘇菌懸液加入BHI 中進行37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h 活化。將菌液進行1 000×g離心10 min，取沉淀，加入生理鹽水重懸成4×107cfu/mL 懸濁液，待用。

六周齡的SPF 級C57BL/6J 雌性小鼠標準喂食適應性喂養(yǎng)7 d 后開始正式實驗。小鼠隨機分為6 組，分別為空白組、艱難梭菌模型組（簡稱模型組）、萬古霉素組、100、300、500 mg/kg 巖藻聚糖。每組8 只，每籠內不超過4 只，每籠的體質量為（18±2）g。本研究中所有方案和程序由中國海洋大學食品科學與工程學院實驗動物護理倫理委員會的審批通過。

1～10 d，空白組、模型組和萬古霉素組口服10 mL/kg純凈水，巖藻聚糖組分別口服100、300 和500 mg/kg的巖藻聚糖。11～20 d，每次給予巖藻聚糖1 h 后，模型組和萬古霉素組、巖藻聚糖組分別口服280 mg/kg 頭孢哌酮溶液，而空白組口服0.2 mL 超純水。第21 天，休整1 d，空白組、模型組和萬古霉素組口服0.2 mL 超純水，而巖藻聚糖組繼續(xù)口服0.2 mL 100、300、500 mg/kg 的巖藻聚糖。第22 天，模型組、萬古霉素組、巖藻聚糖組注射100 mg/kg 克林霉素。注射克林霉素1 h 后，巖藻聚糖組繼續(xù)口服100、300 和500 mg/kg 的巖藻聚糖。第23 天，模型組、萬古霉素組、巖藻聚糖組口服0.2 mL 4×107cfu/mL艱難梭菌菌液，建立艱難梭菌腸炎模型。24～28 d，萬古霉素組口服0.2 mL 50 mg/kg 的萬古霉素，其余各組口服0.2 mL 超純水。第29 天，處死各組小鼠[22]。

在艱難梭菌腸炎小鼠模型的建立期間，每日觀察小鼠狀態(tài)、體質量，在給予艱難梭菌后，觀察小鼠癥狀、體質量、存活率。艱難梭菌侵染5 d 后，用乙醚安樂死小鼠。

1.3.4 結腸組織病理學觀察

取小鼠結腸組織1 cm 放入4%甲醛固定24 h，石蠟切片脫蠟至水，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，H＆E）染色處理，脫水封片，正置光學顯微鏡鏡檢，在成像系統(tǒng)（NIKON DS-U3）進行圖像采集分析[17，22]。

1.3.5 盲腸內容物中艱難梭菌毒素A 和毒素B 的測定

用1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋收集到的小鼠50～100 mg 盲腸內容物，1 800×g離心20 min 后收集上清液。根據(jù)小鼠毒素TcdA 和TcdB 的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書測定毒素TcdA 與TcdB 的水平。

1.3.6 結腸組織中F4/80 和Ly-6G 的熒光雙標檢測

取小鼠50～100 mg 結腸組織用4%甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片，脫蠟至水后進行抗原修復，雙氧水、血清封閉后，加入第一種一抗、對應的辣根過氧化物酶標記的二抗、Cyanine 3 Tyramide CY3-TSA，在中火8 min 停火8 min 轉中低火7 min 的條件下進行微波處理。加入第二種一抗和對應的二抗。利用4’6-二脒基-2 苯基吲哚（4'6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染細胞核，避光室溫孵育10 min 后，加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。甩干后，用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.7 結腸組織中炎癥因子mRNA 表達的測定

取小鼠結腸組織50～100 mg，采用Trizol 法提取結腸組織中的總mRNA，按照逆轉錄試劑盒提供的標準操作說明書進行逆轉錄反應，獲得cDNA。以逆轉錄后的cDNA 為模板，實時熒光定量PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）以GAPDH基因為定量內參，使用熒光定量試劑盒分別對促炎癥細胞因子腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor alpha，TNF-α）、干擾素-γ（interferon gama，IFN-γ）、白介素-1β（interleukin 1 beta，IL-1β）、白介素-6（interleukin 6，IL-6）和抑炎癥因子白介素-4（interleukin 4，IL-4）、白介素-10（interleukin 10，IL-10）進行相對定量并統(tǒng)計。RT-PCR 反應體系：cDNA 1 μg；primer 1 0.8 μL；primer 2 0.8 μL；SYBR Green I 2 μL；dd H2O 加至20 μL；40 個循環(huán)數(shù)：95 ℃15 s、60 ℃60 s。小鼠引物的序列如表1所示。炎癥相關基因表達的相對定量根據(jù)2-ΔCt法[23]。

1.3.8 小鼠盲腸菌群結構的測定

參考文獻[24]的方法，取小鼠盲腸內容物0.1 mg置于無菌管中，使用PowerFecalTMDNA 分離試劑盒提取結腸基因組DNA，純化后測序。使用TruSeqTMDNA樣本制備試劑盒中提供的說明生成測序文庫。文庫質量檢測后，在Illumina MiSeqPE250 平臺進行擴增測序。原始DNA 片段用FLASH（v1.2.7）進行讀取、合并，QIIME2 （2019.4）軟件去噪，Vsearch （v2.13.4_ linux_x86_64），cutadapt（v2.3）軟件在97%相似度水平對高質量序列聚類。使用RDP 分類器（v2.2），應用70%置信閾值分析每個16S rRNA 基因序列的分類。通過對去除singleton 后的特征表進行統(tǒng)計，實現(xiàn)各樣本在門、綱、目、科、屬、種6 個分類水平上的組成分布可視化。利用QIIME2（2019.4）軟件進行alpha 多樣性分析。使用R packages 2.15 和VennDiagram_（1.6.20）生成韋恩圖。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結果均以平均值±標準差形式表示。利用SPASS Statistics（v22）進行單向方差分析（ANOVA）分析各組間的差異，使用Tukey 進行顯著性差異檢驗，顯著性設置為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 巖藻聚糖化學性質檢測結果

巖藻聚糖的高效凝膠排阻色譜圖如圖1A所示，傅里葉紅外光譜官能團分析結果如圖1B所示。

圖1 巖藻聚糖化學性質檢測結果Fig.1 The chemical properties results of fucoidan

由圖1A 可知，巖藻聚糖的重均分子量（Mw）為126.65 kDa，數(shù)均分子量（Mn）為28.46 kDa，其分散系數(shù)為4.45。由圖1B 可知，在1 250 cm-1（S=O 拉伸振動）和845 cm-1（C-O-S 拉伸振動）處有吸收峰，證實巖藻聚糖中巖藻糖殘基存在大量的硫酸根。

巖藻聚糖硫酸根含量及單糖組成見表2。

表2 巖藻聚糖硫酸根含量和單糖組成結果Table 2 The results of fucoidan sulfate content and monosaccharide composition %

由表2 可知，巖藻聚糖中含有硫酸根（25.93±0.17）%，單糖組成結果得出，巖藻聚糖中巖藻糖（52.57±2.10）%和半乳糖（26.41±3.31）%的含量較高，還含有少量的甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、木糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖。

2.2 巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠腹瀉程度的影響

巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠的體質量和結腸黏膜結構的影響見圖2。

圖2 巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠的體質量和結腸黏膜結構的影響Fig.2 Effects of fucoidan on the bodyweight and histopathology of C.difficile-infected mice

實驗期間，正常組小鼠給予艱難梭菌后，沒有出現(xiàn)腹瀉的癥狀，體質量正常。說明小鼠體內正常的腸道菌群對感染艱難梭菌有很好的防御作用，不會發(fā)生艱難梭菌侵染和腹瀉。模型組小鼠在服用頭孢哌酮10 d 后，體質量沒有明顯下降，精神狀態(tài)良好。但是，在艱難梭菌侵染第2 天，8 只小鼠均出現(xiàn)腹瀉癥狀，并伴隨體質量急劇下降，糞便呈水樣，毛發(fā)豎立，精神狀態(tài)不佳，然而未出現(xiàn)死亡。說明頭孢哌酮破壞了腸道菌群，造成了艱難梭菌侵染和腹瀉。在服用10 d 頭孢哌酮期間，同時分別給予小鼠10 d 100、300、500 mg/kg 的巖藻聚糖，然后再進行艱難梭菌侵染。在艱難梭菌侵染后第2 天，100 mg/kg 巖藻聚糖組的8 只小鼠中，有7 只小鼠出現(xiàn)了腹瀉。而在300、500 mg/kg 巖藻聚糖組的小鼠中，分別有3 只和1 只出現(xiàn)腹瀉癥狀，其余小鼠均不腹瀉，體質量保持穩(wěn)定；在艱難梭菌侵染后第5天，模型組小鼠腹瀉繼續(xù)加重，體質量下降。而萬古霉素治療5 d 后，僅有2 只小鼠輕微腹瀉，6 只小鼠由腹瀉轉為軟便，腹瀉情況得到緩解。100 mg/kg 巖藻聚糖組的小鼠中，仍有7 只小鼠嚴重腹瀉，情況并未好轉。而300、500 mg/kg 巖藻聚糖組小鼠的腹瀉情況明顯好轉，都僅有1 只小鼠產生腹瀉。說明巖藻聚糖可以很好地緩解由感染艱難梭菌引起的腹瀉癥狀。

由圖2A 可知，30 d 時，與模型組相比，萬古霉素組小鼠體質量顯著上升（p＜0.05），但仍有2 只小鼠輕微腹瀉。與模型組相比，口服300、500 mg/kg 巖藻聚糖均能夠顯著提高腸炎小鼠的體質量（p＜0.05），而100 mg/kg巖藻聚糖對小鼠體質量沒有顯著影響（p>0.05）。

采用H＆E 染色技術分析巖藻聚糖對結腸黏膜結構的保護作用，由圖2B 可知，正常組小鼠結腸組織病理學表現(xiàn)為組織黏膜、隱窩和黏膜下層完整，杯狀細胞排列整齊，無或稍有炎癥浸潤現(xiàn)象。而模型組小鼠結腸組織炎癥細胞浸潤嚴重，并伴隨著隱窩丟失，杯狀細胞明顯減少，上皮層不完整。說明艱難梭菌侵染造成結腸腸黏膜嚴重炎癥和黏膜結構損傷。與模型組相比，萬古霉素組小鼠結腸組織炎癥細胞浸潤明顯緩解，隱窩較為完整，杯狀細胞數(shù)量增加并且排列整齊。300、500 mg/kg 巖藻聚糖組小鼠結腸組織中杯狀細胞明顯增多，且排列整齊，隱窩、上皮層和黏膜下層相對完整，炎癥細胞浸潤情況明顯緩解。100 mg/kg 巖藻聚糖組小鼠結腸組織中杯狀細胞明顯增多，但是上皮層和黏膜仍然有嚴重損傷。結果表明，預先口服300、500 mg/kg 巖藻聚糖可以有效地減輕艱難梭菌造成的腸道黏膜損傷和炎癥浸潤。

2.3 巖藻聚糖對艱難腸炎小鼠腸道菌群的影響

上述結果表明，口服300 mg/kg 巖藻聚糖對艱難梭菌誘導的結腸炎具有顯著的保護作用。利用16s RNA 基因檢測技術，進一步分析300 mg/kg 巖藻聚糖對腸道菌群的豐度和結構的影響。實驗中收集了一個由1 014 883 個序列組成的數(shù)據(jù)集，每個樣品的平均讀數(shù)為70 486±15 264。巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠盲腸菌群多樣性的影響見表3。

表3 巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠盲腸菌群多樣性的影響Table 3 Analysis of fucoidan on microbial diversity in cecum of C.difficile infected mice

由表3所示，Good's coverage 指數(shù)可以看出測序對群落中物種的覆蓋度很高，幾乎沒有未檢測出的物種。與正常組相比，模型組OTUs 由7570 下降至699，約為正常組的9.2%，且Chao 1 指數(shù)、Observed_species指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均顯著下降（p＜0.05），這說明抗生素的使用和艱難梭菌感染造成腸道菌群完全紊亂。而口服萬古霉素和巖藻聚糖5 d 后，OTUs 分別上升至933（正常組的12.3%）和1 146（正常組的15.1%）。與模型組相比，萬古霉素組和巖藻聚糖組Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均顯著上升（p＜0.05）。但是，巖藻聚糖組小鼠的OTUs 與正常組相差較大，說明雖然巖藻聚糖對腸道菌群有一定程度的保護作用，但是不能夠使腸道菌群的豐度和多樣性很好的恢復。

從門水平觀察巖藻聚糖巖藻聚糖對腸道菌群結構的影響，結果見圖3。

由圖3 可知，與正常組相比，模型組的厚壁菌門（88.28%）和變形菌門（11.28%）的相對豐度明顯上升，而擬桿菌門（0.30%）明顯下降，軟壁菌門和埃普西隆桿菌門完全消失。與模型組相比，萬古霉素治療使厚壁菌門（13.17%）的相對豐度明顯下降，變形菌門（38.56%）和擬桿菌門（12.21%）明顯上升，并且出現(xiàn)了較高豐度的軟壁菌門（14.57%）和埃普西隆桿菌門（21.19%）。與模型組相比，預先口服巖藻聚糖可以使厚壁菌門（52.85%）的相對豐度明顯下降，與正常組厚壁菌門的相對豐度相似，菌群中變形菌門上升至20.1%，擬桿菌門（0.65%）也略有上升。

圖3 巖藻聚糖在門水平上對艱難梭菌腸炎小鼠盲腸內菌群結構的影響（n=5）Fig.3 Effects of fucoidan on the structure of the cecal microbiota in C.difficile-infected mice at the phylum level（n=5）

進一步從屬水平分析巖藻聚糖對腸道菌群結構的影響，對不同組小鼠的相對豐度最高的50 個屬進行分析比較，結果見圖4。

圖4 巖藻聚糖在屬水平上對艱難梭菌腸炎小鼠盲腸菌群結構的影響Fig.4 Effects of fucoidan on the structure of the cecal microbiota in C.difficile-infected mice at the genus level

由圖4 可知，正常組盲腸中鼠李桿菌和毛螺菌NK4A136 為主要優(yōu)勢菌，分別占30.52%和17.38%，還含有乳酸桿菌（7.41%）、布勞特氏菌屬（2.09%）、瘤胃球菌_UCG-014（1.72%）、脫硫弧菌（1.53%）、Candidatus_Saccharimonas（1.31%）、另枝菌屬（1.26%）、普瑞沃特菌屬（1.20%）、腸桿菌屬（1.09%）等。服用頭孢哌酮和艱難梭菌侵染后，小鼠盲腸中與腸炎相關的腸球菌（45.53%）、艱難梭菌（15.71%）、梭菌_vadinBB60（15.18%）、變形桿菌屬（10.44%）變成了優(yōu)勢菌屬。而有益菌鼠李桿菌（0.08%）、毛螺菌NK4A136（0.02%）、瘤胃球菌_UCG-014（0.01%）均明顯下降，脫硫弧菌、普瑞沃特菌屬和Candidatus_Saccharimonas完全消失。此外，艱難梭菌的相對豐度增長到15.71%，這說明艱難梭菌在盲腸中大量繁殖。

萬古霉素治療5 d 后，發(fā)現(xiàn)小鼠盲腸中優(yōu)勢菌變?yōu)橛拈T螺桿菌（21.19%）、Parasutterella（17.83%）、支原體（14.56%）、擬桿菌（11.99%）、乳酸桿菌（9.25%）、大腸桿菌志賀菌（7.67%）、腸桿菌（2.07%）、Erysipelatoclostridium（1.82%），而艱難梭菌未檢出。以上結果表明，萬古霉素雖然可以有效殺死艱難梭菌，但是會造成幽門螺旋桿菌、大腸桿菌志賀菌等有害菌的增長，小鼠菌群的單一也會造成支原體感染。

預先口服巖藻聚糖使盲腸內腸道菌群的OUTs上升至1 146，細菌結構發(fā)生明顯變化。其中支原體（25.61%）、Parasutterella（18.05%）、活潑瘤胃球菌（13.46%）、乳酸桿菌（8.17%）、布勞特氏菌屬（6.28%）、腸球菌（5.80%）、Erysipelatoclostridium（5.44%）成為優(yōu)勢菌。與模型組相比，腸炎相關致病菌腸球菌和艱難梭菌的相對豐度明顯下降，而有益菌扭鏈瘤胃球菌（0.47%）、鼠李桿菌（0.39%）、高氏瘤胃球菌（0.29%）、羅姆布茨菌（0.18%）、不動桿菌（0.13%）、假交替單胞菌屬（0.12%）的相對豐度明顯上升。以上結果說明，口服巖藻聚糖可以提高有益菌的相對含量，降低腸炎和腹瀉相關的有害細菌的相對含量。但是，口服巖藻聚糖無法避免頭孢哌酮對腸道細菌的傷害，腸道菌群的豐度和多樣性均明顯低于正常組小鼠，這說明巖藻聚糖只能有限地保護腸道菌群的豐度和多樣性。

2.4 巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠盲腸內艱難梭菌毒素A 和毒素B 含量的影響

圖5 顯示了300 mg/kg 巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠盲腸中毒素TcdA 和TcdB 水平的影響。

圖5 巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠盲腸中毒素Tcd A 和Tcd B含量的影響Fig.5 Effect of fucoidan on Tcd A and Tcd B toxins content in the cecum of mice with C.difficile colitis

由圖5 可知，與正常組相比，小鼠艱難梭菌感染后盲腸中毒素TcdA 和TcdB 水平顯著升高（p＜0.05），說明模型組小鼠遭到了艱難梭菌的侵染，并且產生毒素。與模型組相比，萬古霉素和巖藻聚糖巖藻聚糖均可以使毒素TcdA 和TcdB 水平顯著降低（p＜0.05），說明口服萬古霉素和巖藻聚糖均可以抑制盲腸中艱難梭菌毒素TcdA 和TcdB 的產生。

2.5 巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠結腸組織中巨噬細胞和中性粒細胞浸潤的影響

圖6 為巖藻聚糖對結腸中F4/80 和Ly-6G 水平的影響。

圖6 巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠結腸中F4/80 和Ly-6G 水平的影響Fig.6 Effect of fucoidan on the level of F4/80 and Ly-6G in C.difficile infected mice

通過免疫熒光雙標法檢測巨噬細胞標記物F4/80和中性粒細胞標記物Ly-6G 相對熒光強度，來反映巨噬細胞和中性粒細胞浸潤情況。由圖6 可知，與正常組相比，模型組小鼠結腸組織中F4/80 和Ly-6G 的相對熒光強度顯著增加（p＜0.05），說明艱難梭菌侵染導致巨噬細胞和中性粒細胞數(shù)量增加。與模型組相比，萬古霉素和巖藻聚糖組小鼠結腸組織的F4/80 和Ly-6相對熒光強度均顯著降低（p＜0.05），其中，巖藻聚糖組F4/80 明顯低于萬古霉素組，說明巖藻聚糖可以顯著抑制艱難梭菌侵染導致的結腸組織中巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤，尤其對巨噬細胞有很好的抑制作用。

2.6 巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠結腸組織中炎癥因子mRNA 相對表達水平的影響

圖7 為q-PCR 對4 種促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6以及2 種抗炎因子IL-10、IL-4的mRNA表達的影響。

圖7 巖藻聚糖對艱難梭菌腸炎小鼠盲腸組織中炎癥因子mRNA 水平表達的影響Fig.7 Effect of fucoidan on the mRNA expression of inflammatory cytokines in the colon of C.difficile infected mice

由圖7 可知，與正常組相比，模型組結腸組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ 3 種炎癥因子mRNA 表達量均顯著升高（p＜0.05），但是炎癥因子IL-6的mRNA 表達量沒有顯著變化。與模型組相比，萬古霉素組TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表達量均顯著下降（p＜0.05），IL-4的mRNA 表達量顯著上升，而IFN-γ 和IL-6的mRNA表達量沒有顯著差異。這說明萬古霉素有一定的抑制結腸炎癥因子基因過度表達的作用。與模型組相比，巖藻聚糖組小鼠結腸組織中的TNF-α、IL-1β、IFN-γ 和IL-64 種炎癥因子的mRNA 表達量均顯著下降（p＜0.05），這說明預先口服巖藻聚糖可以有效地抑制艱難梭菌所造成的結腸炎癥因子的過度表達。與正常組相比，模型組結腸中抗炎癥因子IL-10下降，IL-4無顯著性變化（p>0.05）。與模型組相比，萬古霉素組IL-10上升顯著（p＜0.05），且高于正常組，而IL-4無顯著性變化（p>0.05）。與模型組相比，巖藻聚糖組IL-10和IL-4的mRNA 表達量均顯著增加，尤其是IL-4的表達量顯著高于正常組。這說明預先口服巖藻聚糖可以顯著提高抗炎因子IL-10和IL-4的基因表達。

3 討論

頭孢哌酮是目前臨床常用的抗生素，會造成的腸道微生物紊亂的時間長達4～6 個月[22]。本研究利用頭孢哌酮誘導的腸道菌群紊亂小鼠模型，評價巖藻聚糖預防艱難梭菌侵染和腸炎的活性。在服用頭孢哌酮期間，每日口服300 mg/kg 巖藻聚糖可以顯著緩解艱難梭菌引起的腹瀉，結腸黏膜損傷和炎性細胞浸潤，降低艱難梭菌、腸球菌的相對豐度，增加盲腸中的有益細菌Parasutterella、活潑瘤胃球菌、乳酸桿菌和布勞特氏菌屬，并使艱難梭菌毒素TcdA 和TcdB 含量下降。這說明巖藻聚糖能夠抑制艱難梭菌侵染和毒素，調整腸道菌群結構。但是，巖藻聚糖組小鼠的腸道菌群的OUTs 從9.2%增加到15.1%，菌群多樣性仍然很低，而且支原體和腸球菌等有害細菌的相對豐度仍然很高，說明巖藻聚糖對腸道菌群的保護有限，并不能恢復正常的腸道菌群。有研究表明，巖藻聚糖可以通過與細胞表面硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）競爭結合病毒來抑制細胞的病毒感染[8]。由此推測巖藻聚糖可以直接抑制艱難梭菌對腸上皮細胞的感染，或抑制艱難梭菌毒素的產生，從而預防艱難梭菌腸炎。

本研究發(fā)現(xiàn)，口服巖藻聚糖在艱難梭菌腸炎小鼠中表現(xiàn)出很好的抗炎癥作用，顯著降低結腸組織中巨噬細胞和中性粒細胞浸潤，抑制TNF-α、IFN-γ 和IL-1β 基因過度表達，促進抗炎因子IL-10和IL-4的基因表達，實驗結果與巖藻聚糖抑制DSS 和艱難梭菌毒素A 誘導的腸道炎癥效果相似[10，12]。綜合研究結果推測，巖藻聚糖預防頭孢哌酮誘導的艱難梭菌感染和結腸炎的機制，與其直接抑制艱難梭菌侵染和毒素產生、抗炎活性、保護腸道黏膜結構有關。因此，巖藻多糖有潛力成為抗生素治療患者避免艱難梭菌相關性結腸炎的功能性食品。

4 結論

在口服頭孢哌酮導致的腸道菌群失調小鼠中，預先口服巖藻聚糖可以有預防艱難梭菌侵染和毒素TcdA 和TcdB 的產生，同時，巖藻聚糖可有效抑制盲腸中結腸炎相關細菌艱難梭菌和腸球菌等細菌的相對豐度，促進有益菌的生長，從而預防艱難梭菌誘導的腹瀉和結腸黏膜結構損傷，但是不能夠完全恢復腸道菌群的豐度和結構。巖藻聚糖具有較好的抗炎活性，能夠抑制炎癥細胞浸潤，下調炎性因子的基因表達，上調抗炎因子的基因表達。因此，巖藻聚糖在預防抗生素相關艱難梭菌腸炎方面具有很好的潛質。