郭偉　范帥華　杜鵬程　郭軍

摘要：血流感染（BSI）是由細(xì)菌、真菌和病毒等微生物引起的血液播散性疾病，可導(dǎo)致菌血癥、敗血癥、感染性休克，嚴(yán)重危及人類生命健康。明確病原體是精準(zhǔn)治療BSI的重要核心。傳統(tǒng)血培養(yǎng)是病原體診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其不足是耗時(shí)長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果等，在臨床實(shí)踐中具有一定的局限性。納米孔測(cè)序作為新一代測(cè)序技術(shù)，能快速檢測(cè)病原體，完成耐藥基因、毒力基因檢測(cè)，可優(yōu)化臨床治療。本文就納米孔測(cè)序技術(shù)在BSI中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：納米孔測(cè)序；血流感染；高通量核苷酸測(cè)序

中圖分類號(hào)： R446.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1000-503X（2023）02-0317-05

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.14995

Application and Prospect of Nanopore Sequencing Technology in Etiological Diagnosis of Blood Stream Infection

GUO Wei FAN Shuaihua DU Pengcheng GUO Jun1，3

ABSTRACT：Blood stream infection （BSI），a blood-borne disease caused by microorganisms such as bacteria，fungi，and viruses，can lead to bacteremia，sepsis，and infectious shock，posing a serious threat to human life and health.Identifying the pathogen is central to the precise treatment of BSI.Traditional blood culture is the gold standard for pathogen identification，while it has limitations in clinical practice due to the long time consumption，production of false negative results，etc.Nanopore sequencing，as a new generation of sequencing technology，can rapidly detect pathogens，drug resistance genes，and virulence genes for the optimization of clinical treatment.This paper reviews the current status of nanopore sequencing technology in the diagnosis of BSI.

Key words：nanopore sequencing；blood stream infection；high-throughput nucleotide sequencing

Acta Acad Med Sin，2023，45（2）：317-321

血流感染（bloodstream infection，BSI）是指細(xì)菌、真菌和病毒等病原微生物進(jìn)入血流引起的播散感染，可導(dǎo)致菌血癥、敗血癥和膿毒癥，嚴(yán)重者可引起休克、多臟器功能衰竭乃至死亡。近年來(lái)，隨著艾滋病患者和移植術(shù)后患者等免疫力低下患者的人數(shù)增多、醫(yī)療侵襲性操作項(xiàng)目的不斷增加和廣譜抗菌藥物、皮質(zhì)激素等藥物的廣泛應(yīng)用，BSI的發(fā)病率及病死率逐年上升［1］。一項(xiàng)覆蓋了3.2億人口、基于國(guó)家死亡檢測(cè)系統(tǒng)系統(tǒng)的回顧性分析發(fā)現(xiàn)：2015年標(biāo)化BSI相關(guān)死亡率為6.67/萬(wàn)，相當(dāng)于全國(guó)BSI死亡例數(shù)達(dá)到102.6萬(wàn)例（通過(guò)2015年的普查人口估算）。2019年末開始的由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型導(dǎo)致的新型冠狀病毒感染疫情的暴發(fā)，再次敲響了公共衛(wèi)生警鐘，提示著感染性疾病，尤其是病毒引起的呼吸道傳染病仍嚴(yán)重威脅人類的生命健康。Li等［2］指出，在臨床中許多嚴(yán)重或危重新型冠狀病毒感染患者特有典型的休克癥狀，常常是BSI中的病毒性敗血癥臨床表現(xiàn)。BSI已經(jīng)成為了嚴(yán)峻的臨床和公共衛(wèi)生安全問(wèn)題，嚴(yán)重影響了人們的生命安全，給公共衛(wèi)生健康帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)［3］。

明確病原體是治療BSI的核心，病原體是實(shí)施精準(zhǔn)治療的靶標(biāo)，目前血培養(yǎng)依然是診斷BSI的金標(biāo)準(zhǔn)，但這通常需要2～7 d才能完成病原菌鑒定和抗生素敏感性試驗(yàn)［4］，導(dǎo)致依據(jù)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果優(yōu)化和精準(zhǔn)實(shí)施抗菌藥物治療的嚴(yán)重延誤，在最初24 h內(nèi)仍未接受治療或接受不適當(dāng)抗菌治療的膿毒癥患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)會(huì)因此而增加［5］，此外病原學(xué)診斷的延遲促進(jìn)了廣譜抗菌藥物的不當(dāng)使用和過(guò)度使用，使得病原菌耐藥性增強(qiáng)、高耐藥病原體在臨床流行，導(dǎo)致患者發(fā)生醫(yī)院感染的風(fēng)險(xiǎn)升高，進(jìn)一步增加了抗菌治療的難度，形成惡性循環(huán)［6］。此外，還有許多病原微生物，如病毒、支原體等無(wú)法在常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)和檢測(cè)。因此為了探索建立簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷方法，微生物學(xué)家、臨床檢驗(yàn)學(xué)家等開展了大量研究建立新型病原檢測(cè)方法，根據(jù)方法學(xué)原理的不同可分為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、血清抗體檢測(cè)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）、二代宏基因組測(cè)序等［7］。這些方法有優(yōu)勢(shì)的同時(shí)也存在明顯不足，比如結(jié)果容易受干擾、假陰性高，測(cè)序讀長(zhǎng)相對(duì)較短，設(shè)備成本高昂、體積大，操作復(fù)雜，應(yīng)用受到限制，特別是報(bào)告病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間一般會(huì)超過(guò)24 h。近年來(lái)迅速發(fā)展的納米孔測(cè)序技術(shù)很好地解決這些問(wèn)題，由于其具有測(cè)序讀長(zhǎng)較長(zhǎng)、數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)產(chǎn)出（“邊解鏈邊測(cè)序”）等特點(diǎn)，為快速檢測(cè)病原微生物提供了可能，本文就納米孔測(cè)序技術(shù)在BSI病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及在病原檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

1977年，Sanger等［8］描述了一種測(cè)定 DNA 核苷酸序列的方法——雙脫氧末端終止法，即Sanger法。這種方法現(xiàn)在稱為一代測(cè)序，在后來(lái)的人類基因組研究計(jì)劃中起到了主導(dǎo)作用。但一代測(cè)序能夠測(cè)定的DNA序列長(zhǎng)度（即讀長(zhǎng)：是測(cè)序反應(yīng)所能測(cè)得序列的長(zhǎng)度，如果DNA序列長(zhǎng)度高于讀長(zhǎng)，那么必須把DNA序列分割成長(zhǎng)度在讀長(zhǎng)以內(nèi)短序列才能測(cè)序）和范圍都很有限，且費(fèi)用高昂。2004年，美國(guó)國(guó)家人類基因研究所提出了在10年內(nèi)達(dá)成以1000美元成本對(duì)人類基因組測(cè)序的目標(biāo)，促進(jìn)了新一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）的研發(fā)。NGS也稱為二代測(cè)序、高通量測(cè)序、深度測(cè)序等，NGS能實(shí)現(xiàn)更大范圍基因組的檢測(cè)，在一次運(yùn)行中能夠并行進(jìn)行數(shù)百萬(wàn)至數(shù)萬(wàn)億次測(cè)定［9-10］；目前，二代宏基因組測(cè)序病原檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)臨床樣本中病原微生物的快速直接檢測(cè)，無(wú)需進(jìn)行病原培養(yǎng)，可在24～36 h左右獲得檢測(cè)結(jié)果，極大推進(jìn)了臨床感染性疾病的精準(zhǔn)診斷，在控制感染和疾病暴發(fā)方面效果明顯。但由于NGS設(shè)備成本高昂、體積大，操作維護(hù)復(fù)雜，在臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用受到限制，此外由于NGS讀長(zhǎng)相對(duì)較短，在病原微生物檢測(cè)中一般采用單端75 bp測(cè)序方案，因此序列特異性相對(duì)較低，且NGS設(shè)備單次運(yùn)行時(shí)間目前約需10 h，已相對(duì)穩(wěn)定，因此檢測(cè)時(shí)間難以進(jìn)一步縮短［11］。而具有邊解鏈邊測(cè)序特性和長(zhǎng)讀長(zhǎng)特點(diǎn)的納米孔測(cè)序技術(shù)能很好解決這些問(wèn)題。

納米孔測(cè)序的原理及主要亮點(diǎn)

雖然早在1980年就出現(xiàn)了納米孔測(cè)序技術(shù)的概念，但直到2014年才出現(xiàn)第1個(gè)實(shí)用化的納米測(cè)序技術(shù)產(chǎn)品，由牛津納米孔技術(shù)公司推出的MinION納米測(cè)序儀，體積只有60 cm 重量只有90 g，可以通過(guò)USB接口與控制計(jì)算機(jī)連接并受其控制［12］。MinION納米測(cè)序儀主要由運(yùn)動(dòng)蛋白、通道蛋白、特定的集成電路板組成。在運(yùn)動(dòng)蛋白作用下雙鏈DNA（或RNA-DNA雙鏈）分子被解開，單鏈的DNA或RNA通過(guò)通道蛋白會(huì)引起特征性的電流變化，而不同的電流變化對(duì)應(yīng)的堿基序列不同，集成電路板能測(cè)量電流變化并轉(zhuǎn)換輸出成fastq格式序列文件，從而被特定的軟件識(shí)別分析［13］。納米孔測(cè)序主要有以下幾方面的優(yōu)勢(shì)：（1）檢測(cè)速度快：在感染性疾病中，納米孔測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序能夠在10 min確定病原體，其快速實(shí)時(shí)檢測(cè)病原體的優(yōu)勢(shì)得到了充分發(fā)揮，此外其對(duì)于快速準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)菌、真菌耐藥基因及點(diǎn)突變也具有優(yōu)勢(shì)［13］。（2）實(shí)時(shí)測(cè)序：能夠在測(cè)序開始后持續(xù)獲得測(cè)序結(jié)果，結(jié)合同時(shí)開展的快速分析，能夠極大縮短病原體檢測(cè)時(shí)間，這些優(yōu)勢(shì)促使了納米孔測(cè)序儀在基礎(chǔ)研究和現(xiàn)場(chǎng)測(cè)序中得到了廣泛應(yīng)用。（3）長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度：讀段長(zhǎng)度范圍在數(shù)百bp到數(shù)Mb之間，因此為在鑒別病原體的同時(shí)也為有效檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因、毒力基因等提供了可靠依據(jù)。（4）原生單分子檢測(cè)：能夠在單分子水平上實(shí)現(xiàn)DNA/RNA及修飾的直接檢測(cè)，直接組裝RNA病毒基因組。（5）MinION納米測(cè)序儀體積小、攜帶方便、單次運(yùn)行成本低，便于臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室使用。

納米孔測(cè)序在BSI病原體檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

應(yīng)用納米孔測(cè)序快速檢測(cè)BSI病原體 因?yàn)榧{米孔測(cè)序可以實(shí)時(shí)產(chǎn)出數(shù)據(jù)，所以搭配實(shí)時(shí)病原識(shí)別軟件后，即可對(duì)實(shí)時(shí)獲得的序列進(jìn)行分析從而快速解析樣本中的病原信息。納米孔測(cè)序技術(shù)實(shí)用化后，即被嘗試應(yīng)用于BSI病原快速檢測(cè)，顯示了實(shí)時(shí)測(cè)序所帶來(lái)的時(shí)效性優(yōu)勢(shì)。2015年，Greninger等［14］首次使用MinION納米孔測(cè)序儀和新開發(fā)的實(shí)時(shí)生物學(xué)分析管道MatePORE在6 h內(nèi)完成了4份病毒感染患者血液樣本的核酸提取到病原體鑒定。在107～108 copies/ml的滴度下，來(lái)自2例急性出血熱患者的埃博拉病毒讀數(shù)和來(lái)自1名無(wú)癥狀獻(xiàn)血者的基孔肯雅病毒讀數(shù)在數(shù)據(jù)采集的4～10 min內(nèi)被檢測(cè)出來(lái)，而較低滴度的丙型肝炎病毒（1×105 copies/ml）在40 min內(nèi)被檢測(cè)出來(lái)。這項(xiàng)研究首次展示了納米孔測(cè)序在BSI病原快速檢測(cè)中潛在的優(yōu)勢(shì)。

此后，更多研究者對(duì)納米孔測(cè)序檢測(cè)各類BSI病原的時(shí)效性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了深入驗(yàn)證。2018年，Ashikawa等［15］使用MinION平臺(tái)對(duì)血培養(yǎng)獲得的細(xì)菌、真菌進(jìn)行了16SrRNA基因和ITS序列擴(kuò)增檢測(cè)，在測(cè)序10 min后即可鑒定病原菌。與MALDI-TOF MS質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果比對(duì)顯示，除了2種細(xì)菌由于16SrRNA測(cè)序的局限被錯(cuò)誤鑒定，其余檢測(cè)到的細(xì)菌和真菌同MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析的結(jié)果一致。和一代測(cè)序?qū)Ρ?，?0個(gè)標(biāo)本在測(cè)序10 min時(shí)的平均序列一致性高達(dá)99.03%。這項(xiàng)研究證明了納米孔測(cè)序在檢測(cè)導(dǎo)致BSI的臨床常見(jiàn)細(xì)菌和真菌時(shí)的準(zhǔn)確性。

同時(shí)，納米孔測(cè)序檢測(cè)也被嘗試應(yīng)用于指導(dǎo)常規(guī)方法難以診斷的罕見(jiàn)病原感染的臨床治療。2019年，Bialasiewicz等［16］報(bào)道，1例62歲的女性患者，在被狗咬傷后的第6天因?yàn)槟摱景Y休克和多器官功能衰竭收入重癥監(jiān)護(hù)病房，根據(jù)其被狗咬傷的病史和中性粒細(xì)胞中棒狀包裹體的顯微外觀，懷疑是細(xì)菌病因?qū)е碌腂SI，但作為金標(biāo)準(zhǔn)的血培養(yǎng)法3 d依然是陰性結(jié)果，隨后使用MinION平臺(tái)對(duì)患者的血液樣本進(jìn)行強(qiáng)化檢測(cè)，在19 h后就確定了病原菌是犬嗜二氧化碳嗜血桿菌，而檢測(cè)出的弓形蟲考慮污染所致。該患者最初接受了哌拉西林-他唑巴坦、林可霉素和多西環(huán)素的治療，隨后根據(jù)MinION檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果，調(diào)整后續(xù)14 d的用藥為美羅培南，并在使用美羅培南3 d后病情好轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)出重癥監(jiān)護(hù)病房，隨后順利出院。犬嗜二氧化碳嗜血桿菌是BSI罕見(jiàn)的病原體，該案例提示納米孔實(shí)時(shí)檢測(cè)使快速確定罕見(jiàn)、血培養(yǎng)陰性的病原體成為可能，在改善診斷流程，優(yōu)化臨床抗菌藥物的使用以及降低BSI患者的病死率、改善預(yù)后等方面具有巨大潛能。

應(yīng)用納米孔測(cè)序檢測(cè)BSI病原體及其耐藥性和毒力特征 除實(shí)時(shí)獲取數(shù)據(jù)外，納米孔測(cè)序還具有長(zhǎng)讀長(zhǎng)的特點(diǎn)，因此相對(duì)于短讀長(zhǎng)的NGS，在完整基因序列的獲取和分析中更具優(yōu)勢(shì)，能夠從臨床樣本中直接獲得更為完整的耐藥基因、毒力基因等序列，為臨床治療提供更豐富的信息。Sakai等［17］較為系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了納米孔測(cè)序在血液樣本中直接檢測(cè)導(dǎo)致BSI的細(xì)菌及其耐藥基因中的效果。使用MinION測(cè)序儀及對(duì)38個(gè)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中的樣本進(jìn)行了納米孔測(cè)序，使用WIMP軟件檢測(cè)病原，ARMA軟件檢測(cè)耐藥基因，并依據(jù)培養(yǎng)獲得菌株的16SrRNA測(cè)序、MALdI-ToF MS質(zhì)譜分析和藥敏鑒定結(jié)果進(jìn)行比較驗(yàn)證。納米孔測(cè)序30 min獲得的序列分析結(jié)果顯示，18份革蘭陰性細(xì)菌感染樣本均被正確鑒定，但對(duì)于20份革蘭陽(yáng)性菌感染樣本，由于受人源化核酸背景干擾，被鑒定為病原的序列讀段比例較低，革蘭陽(yáng)性菌感染樣本鑒定的正確率僅有60%，提示需優(yōu)化革蘭陽(yáng)性菌的核酸提取方法。此外，在2份樣本中檢測(cè)到超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因，與基因PCR擴(kuò)增和藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，但對(duì)四環(huán)素、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果與藥敏表型并不相符。

Zhou等［18］使用MinION測(cè)序儀，在2 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)含有高毒力耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析；其中3個(gè)樣本為混入肺炎克雷伯菌的模擬BSI樣本，細(xì)菌濃度是30 CFU/ml（樣本1），將10 ml的模擬血樣分別加入到厭氧血培養(yǎng)瓶（樣本2）和需氧血培養(yǎng)瓶（樣本3）中培養(yǎng)直到陽(yáng)性，并以純菌落作為對(duì)照（樣本4）。在使用MinION測(cè)序2 h后對(duì)1～3號(hào)樣本都實(shí)現(xiàn)檢出，并檢測(cè)到了20余條支持耐藥基因和毒力基因鑒定的讀段；測(cè)序20 h后，對(duì)樣本2～4的耐藥基因檢出率達(dá)到了82.4%，該研究中毒力基因檢出率更是高達(dá)96.1%。

值得注意的是，部分研究中使用的是基于網(wǎng)絡(luò)的免費(fèi)開放軟件WIMP，與不同數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)就能自動(dòng)識(shí)別細(xì)菌種類并預(yù)測(cè)對(duì)抗菌藥物的敏感性，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以用1個(gè)由筆記本計(jì)算機(jī)控制的便攜式設(shè)備進(jìn)行，初始成本低，適用于不同層級(jí)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，具有很強(qiáng)的普適性。早期明確感染病原的耐藥性和毒力，對(duì)于降低BSI發(fā)病率、病死率，縮短住院時(shí)長(zhǎng)，降低住院費(fèi)用，減少國(guó)家醫(yī)療財(cái)政支出具有重要作用。以上結(jié)果顯示納米孔測(cè)序在BSI病原檢測(cè)中能夠具有較好的輔助臨床診療效果和較高的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)效益，但仍需在實(shí)驗(yàn)技術(shù)和結(jié)果解讀中進(jìn)行更進(jìn)一步優(yōu)化。

應(yīng)用納米孔測(cè)序精確分析BSI病原基因組特征 通過(guò)納米孔測(cè)序獲得長(zhǎng)讀長(zhǎng)序列，進(jìn)而進(jìn)行病原基因組組裝，能夠獲得BSI感染病原體的完整基因組，這對(duì)明確病原基因組特征、更好識(shí)別耐藥基因、毒力基因及其所在的基因環(huán)境具有重要意義。Zheng等［19］從BSI患者血液中培養(yǎng)得到1株多重耐藥的大腸埃希菌2D菌株，該菌株具有對(duì)氨基糖苷類、第3代頭孢菌素類、碳青霉烯類、喹諾酮類和四環(huán)素類藥物的多藥耐藥特性。該研究采用MinION和Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行了全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該菌株擁有6個(gè)耐藥基因，最具特點(diǎn)的是此菌株的耐藥基因blaNDM-5位于質(zhì)粒上，blaCTX-M-14同時(shí)存在染色體和質(zhì)粒中；測(cè)序結(jié)果解釋了細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制，并通過(guò)基因組分析揭示了該菌的耐藥性動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。除了耐藥基因，明確病原體編碼毒力基因的基因元件序列特點(diǎn)也具有重要的公共衛(wèi)生意義。Gu等［20］在全基因組水平對(duì)耐碳青霉烯類藥物的高毒力肺炎克雷伯菌進(jìn)行了流行病學(xué)研究，表明經(jīng)典的ST11型肺炎克雷伯菌在獲得了1個(gè)約170 kbp的毒力質(zhì)粒后，具有了高致病性、多重耐藥性和高傳播力的特性，引起了經(jīng)呼吸道傳播的醫(yī)院獲得性肺炎暴發(fā)，從分子水平上揭示了該菌株的高毒力和高耐藥的產(chǎn)生機(jī)制。

以上研究顯示了納米孔測(cè)序技術(shù)在BSI病原基因組測(cè)序、耐藥和毒力分子機(jī)制研究等方面的前沿應(yīng)用，同時(shí)展示出了該技術(shù)在臨床病原體監(jiān)測(cè)、指導(dǎo)臨床實(shí)踐、促進(jìn)公共健康方面的廣闊應(yīng)用前景。

不足和展望

納米孔測(cè)序技術(shù)及平臺(tái)具有以上優(yōu)勢(shì)，但依然存在以下不足：（1）當(dāng)前測(cè)序錯(cuò)誤率（6%～15%）仍然顯著高于NGS平臺(tái)（0.1%～1%）；（2）文庫(kù)構(gòu)建（在核苷酸片段兩端連接上特定序列的接頭，讓文庫(kù)在測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序）需要的樣本核酸投入量較大，限制了對(duì)部分臨床樣本的直接測(cè)序［13］；（3）在相同測(cè)序數(shù)據(jù)量下，納米孔宏基因組測(cè)序的病原基因組覆蓋率通常較低［17］；（4）盡管納米孔測(cè)序單次運(yùn)行成本低，但由于單次測(cè)序通量較NGS偏低，目前和NGS相比在獲得相同數(shù)據(jù)量時(shí)運(yùn)行成本更高，限制了納米孔測(cè)序的廣泛使用。

錯(cuò)誤率高是納米孔測(cè)序的突出問(wèn)題，可能導(dǎo)致將測(cè)序讀段錯(cuò)誤識(shí)別為基因組序列相似的病原體［17］，不過(guò)隨著納米孔測(cè)序技術(shù)的更新，測(cè)序準(zhǔn)確率正在得到不斷提高，例如近期牛津納米孔技術(shù)公司推出的R10.4納米孔和Kit12試劑盒，其原始讀長(zhǎng)準(zhǔn)確度可超過(guò)99%，并且還可以根據(jù)需求選擇不同的堿基識(shí)別方式——快速模式、高精度識(shí)別模式、超高精度識(shí)別模式，從而獲得最高的準(zhǔn)確度。在文庫(kù)構(gòu)建核酸投入量問(wèn)題上，可以聯(lián)合PCR技術(shù)，對(duì)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，如Ashikawa等［15］在研究中使用了PCR擴(kuò)增，并預(yù)先使用了QIAamp PowerFecal DNA試劑盒，結(jié)合磁珠純化系統(tǒng)預(yù)處理，提取和純化DNA，進(jìn)而很好地解決了病原體核酸量少以及PCR抑制劑的問(wèn)題。

目前以牛津納米孔平臺(tái)為代表的納米孔測(cè)序技術(shù)依然是此領(lǐng)域主導(dǎo)產(chǎn)品，我國(guó)也已經(jīng)在自主研發(fā)納米孔測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域取得重大突破。2021年12月10日，中國(guó)成都齊碳科技有限公司發(fā)布了我國(guó)自主研發(fā)的量產(chǎn)納米孔單分子基因測(cè)序儀、配套芯片和試劑公告。從成本上分析，隨著納米測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步成熟及納米孔測(cè)序技術(shù)國(guó)產(chǎn)化平臺(tái)的推出，單次測(cè)序成本能得到顯著下降［21］。

納米孔測(cè)序技術(shù)快速檢測(cè)病原體的能力已在實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)，但由于納米孔測(cè)序技術(shù)在臨床實(shí)際應(yīng)用時(shí)間較短，目前積累臨床測(cè)序原始樣本仍較少，其臨床實(shí)際應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。相信隨著相關(guān)技術(shù)的不斷革新完善，納米孔測(cè)序有望成為一種可靠的臨床常規(guī)使用病原學(xué)檢測(cè)方法，改變感染性疾病的診斷和治療實(shí)踐。

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（收稿日期：2022-03-21）

基金項(xiàng)目：清華大學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃（QT201901）和北京市自然科學(xué)基金‐海淀原始創(chuàng)新聯(lián)合基金（前沿項(xiàng)目）（L192069）