張鑫愉,劉萌,唐湘云,李維民,馬峰,李巖,王瑩瑩,安寧,路新利,

Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type one,HIV-1)在復制過程中極易發(fā)生突變,產(chǎn)生耐藥毒株,并成為抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy,ART)成功的主要障礙。目前我國標準化的一線和二線方案分別為替諾福韋/齊多夫定+拉米夫定+依非韋倫/奈韋拉平(TDF/AZT+3TC+EFV/NVP)和替諾福韋/齊多夫定+拉米夫定+克力芝(TDF/AZT+3TC+LPV/r)［1］,隨著“發(fā)現(xiàn)即治”等抗病毒治療策略的廣泛實施,HIV-1耐藥毒株不斷出現(xiàn),并可能在人群中傳播,為艾滋病防治工作帶來了新的挑戰(zhàn)［2］。如在治療前和治療不佳時進行耐藥檢測,及早發(fā)現(xiàn)耐藥毒株、了解因治療引起的突變情況,就可及時調(diào)整治療方案,抑制耐藥毒株的傳播。本研究采用耐藥基因型檢測方法對河北省HIV-1感染者抗病毒治療后失敗人群進行耐藥基因突變調(diào)查,以了解該地區(qū)HIV-1獲得性耐藥(acquired drug resistance, ADR)的突變情況和流行特征,為制定有效的高效抗病毒治療方案提供科學參考。

1 材料與方法

1.1研究對象 以2019年采集的136例河北省參加抗病毒治療后治療失敗(病毒載量≥1 000 CPs/mL)的HIV-1患者的全血為研究對象,測定CD4+T淋巴細胞(以下簡稱“CD4細胞”)計數(shù)。分離血漿后進行病毒載量測定和耐藥基因型檢測。在患者知情同意情況下,通過面對面問卷調(diào)查獲得研究對象的基本人口學特征、感染途徑、抗病毒治療等基本信息。本研究已獲得河北省疾病預防控制中心倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1CD4細胞數(shù)和病毒載量測定 取50 μL抗凝全血,采用流式細胞計數(shù)方法檢測CD4細胞數(shù);應用Roche公司全自動病毒載量檢測儀(COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan)及配套試劑盒(COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test v2.0,Lot:10H27383)檢測,HIV-1 RNA病毒載量線性范圍:20～1.0×107CPs/mL。

1.2.2病毒核酸提取 用上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)的提取試劑盒(MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit,Lot:49167000)及全自動核酸提取儀(MagNA Pure 96)進行HIV-1病毒核酸提取。

1.2.3病毒基因擴增和測序 采用in-house法［3］針對病毒pol區(qū)蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因編碼區(qū)基因(1.3 kb,HXB2:2550-3870)進行擴增。擴增試劑使用Takara的One step RNA PCR Kit,2×Taq PCR預混試劑。最終PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,陽性樣本送北京博邁德基因測序有限公司進行測序。

1.2.4序列分析 使用Sequencher5.4.5對返回的原始反應序列進行拼接,拼接后采用MEGA 6. 0. 6軟件(Clustal W)進行序列的比對、剪切和清理。將獲得序列上傳至Stanford University的HIV Drug resistance database在線數(shù)據(jù)庫(https://hivdb.stanford.edu/),使用HIV db Program在線程序分析基因型耐藥突變和藥物敏感性。

1.2.5基因型判定 將獲得的序列與Los Alamos HIV 數(shù)據(jù)庫(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html)中的HIV-1亞型進行比對,并使用HIV Blast在線軟件(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html)進行校對確認。

1.2.6統(tǒng)計學分析 用Excel2019整理各種突變位點的突變頻數(shù)和耐藥強度;應用SPSS23.0進行統(tǒng)計學處理分析。將基本流行特征中各變量和是否發(fā)生耐藥進行單因素Logistics回歸分析,將P<0.1的特征納入多因素回歸分析。

2 結(jié)果

2.1基本流行特征 成功擴增的136例HIV-1感染者中,以男性(83.82%,114/136)、25～49歲(67.65%,92/136)為主;感染者職業(yè)農(nóng)民占大多數(shù)(47.79%,65/136);感染途徑主要是同性傳播(75.00%,102/136),其次是異性傳播(13.97%,19/136);136例感染者多以一線藥物為首選治療方案(68.38%,93/136)。

2.2基因型分析 獲得136條有效pol區(qū)基因序列,樣本擴增成功率為100%?；蛐头治鲲@示CRF01_AE亞型、B亞型、CRF07_BC亞型、CRF55_01B亞型和其他亞型(A亞型、C亞型、CRF08_BC亞型、CRF68_01B亞型)占比分別為40.44%(55/136)、23.53%(32/136)、22.79%(31/136)、4.41%(6/136)和8.82%(12/136)。

2.3靶基因耐藥情況 對獲得基因序列的136例已治療樣本進行耐藥位點突變分析,結(jié)果表明共106例發(fā)生耐藥突變,其中2例雖然產(chǎn)生耐藥位點突變,但并未導致對靶基因藥物產(chǎn)生耐藥性,耐藥發(fā)生率為76.47%(104/136);產(chǎn)生耐藥的104例樣本中,94.23%(98/104)對NNRTIs耐藥,其中80例對奈韋拉平(NVP)高度耐藥,77例對依非韋倫(EFV)高度耐藥;68.27%(71/104)對NRTIs 耐藥,其中對拉米夫定(3TC)和恩曲他濱(FTC)高度耐藥最為嚴重,都為56例,其次是阿巴卡韋(ABC)為41例;對蛋白酶抑制劑(protease inhibitors,PIs)藥物耐藥情況為1例潛在耐藥。交叉耐藥情況為:交叉耐藥占全部耐藥者的68.38%(68/104),其中65例對NRTIs和NNRTIs類藥物同時耐藥,3例對NNRTIs,NRTIs和PIs同時耐藥。

2.4兩種藥物突變位點分析 結(jié)果顯示,在136例樣本中,106例樣本存在突變位點,其中104例樣本產(chǎn)生耐藥,未產(chǎn)生耐藥的2例分別在PIs次要編碼區(qū)的Q58E和NRTIs編碼區(qū)的V75I,這兩個位點未導致對目前艾滋病抗病毒藥物中蛋白酶抑制劑和核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥。NRTIs耐藥突變位點主要是M184V/I,突變率為71.83%(51/71),此位點對FTC和3TC高度耐藥,對ABC低度耐藥(增加對AZT和TDF的敏感度);其次是K65R,突變率為43.66%(31/71),此位點對ABC、FTC、3TC中度耐藥,對TDF高度耐藥;其他常見NRTI耐藥突變位點情況為:Y115F突變率19.72%(14/71)、D67N突變率14.08%(10/71)、A62V突變率12.68%(9/71)。NNRTIs耐藥突變位點主要是K103N,突變率28.57%(28/98)和V106M,突變率27.55%(27/98),K103N對EFV和NVP高度耐藥,V106M對EVF和NVP高度耐藥,對DOR中度耐藥;其他常見NNRTI耐藥突變位點情況為:Y181C突變率21.43%(21/98)、V179D突變率19.39%(19/98)、G190S突變率16.33%(16/98)、F227L突變率10.20%(10/98)。具體耐藥突變發(fā)生情況和耐藥程度見表1～2。

表1 NRTIs類耐藥突變類型的各位點突變頻數(shù)和耐藥情況

表2 NNRTIs類耐藥突變的各位點突變頻數(shù)和耐藥情況

此外,對經(jīng)過抗病毒治療的136例患者進行亞型分析,其中55例CRF01_AE患者中46例發(fā)生耐藥,占所有耐藥亞型的44.23%(46/104),其次為B亞型24.04%(25/104)。分析不同亞型上幾種常見突變位點的發(fā)生頻率,使用χ2檢驗(H0:3種亞型不同位點分布有關(guān)聯(lián);H1:3種亞型不同位點分布無關(guān)聯(lián)),差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳情見表3。

表3 耐藥位點突變頻率在主要亞型間的情況分析 例(%)

2.5不同治療藥物耐藥差異 NNRTIs類突變和NRTIs類突變的情況比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.391,P=0.001)。

2.6發(fā)生HIV-1獲得性耐藥的影響因素 對各項人口流行病學分布特征和是否產(chǎn)生耐藥進行單因素Logistic回歸分析方法篩選危險因素,P<0.2(α=0.2)的變量納入多因素Logistics回歸分析,結(jié)果顯示民族和傳播途徑是影響獲得性耐藥發(fā)生的獨立危險因素。與漢族相比,少數(shù)民族是影響ADR發(fā)生的保護因素;與血液傳播相比,同性傳播,異性傳播和母嬰傳播是ADR的危險因素。將民族和傳播途徑納入多因素Logistics回歸分析,P>0.05(α=0.05),最終無危險因素進入模型,見表4。

表4 基本流行特征和研究對象耐藥影響因素分析

3 討論

截至2019年12月底,河北省累計報告現(xiàn)存活HIV/AIDS患者 13 620例,報告死亡2 374例,全省人群感染率17.94/10萬,屬于低流行省份。但近年來傳播途徑發(fā)生變化,傳播人群呈多樣化,以及耐藥基因突變給河北省AIDS防治帶來新的挑戰(zhàn)［4］。在本次研究納入的136例有效樣本中,同性傳播為主要的傳播途徑,所占比例為75.00%(102/136)。男男性行為者(men who have sex with men, MSM)由于對自我保護的意識不強,高危性行為普遍,是AIDS感染的高危人群［5］。年齡分布多以青壯年為主(67.65%,92/136)。職業(yè)多以農(nóng)民為主(47.79%,65/136),該群體文化程度有限,在艾滋病的防治工作中,應對該人群重點進行宣傳教育［6］。HIV-1是一種RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒,每天約復制107～108輪［7］,其功能酶編碼基因上藥物作用靶點發(fā)生基因突變,則產(chǎn)生耐藥性,耐藥突變給抗病毒治療帶來巨大障礙。本研究中ADR耐藥率為76.47%(104/136),相較于往年(2017年,51.92%)明顯升高［8］,這可能與近些年抗病毒藥物的廣泛使用密切相關(guān)［9］。ADR耐藥構(gòu)成比與亞洲國家類似,低于歐美發(fā)達國家［10］。耐藥基因型檢測耐藥率表明了本省抗病毒治療失敗的人群中有23.53%(32/136)病毒學抑制失敗的個案與基因型耐藥無關(guān),提示了本省艾滋病抗病毒治療工作中應加強服藥監(jiān)督和依從性教育［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生耐藥突變的104例樣本中,NRTIs類耐藥位點中M184V/I突變頻率最高(71.83%,51/71),其次為K65R(43.66%,31/71)。本次研究發(fā)現(xiàn)有部分研究對象具有潛在HIV耐藥突變位點(PIs次要編碼區(qū)Q58E,NRTIs編碼區(qū)的V751),這些位點雖然并不在WHO推薦的耐藥位點列表中,但這些耐藥突變位點如與其他位點聯(lián)合作用的話,可能會造成HIV感染者對抗病毒治療藥物的潛在耐藥。

通過對三種常見亞型(CRF01_AE,B,CRF07_BC)上8種突變頻率較高的位點進行χ2檢驗,差異均無統(tǒng)計學意義,但可通過每一位點在不同亞型上的突變率發(fā)現(xiàn)顯著差異,如NNRTIs類位點V106M在CRF07_BC亞型和B亞型上的突變頻率為42.11%和16.00%,該結(jié)果雖無統(tǒng)計學意義,但仍值得注意,造成此結(jié)果的原因有可能是樣本量過小,接下來的研究可適當增加樣本量。

隨著發(fā)現(xiàn)即治療政策的實施,ART范圍進一步擴大,HIV-1耐藥基因突變已成為治療效果下降的主要原因［12］。通過單因素Logistics回歸對耐藥發(fā)生率和治療方案進行分析,差異無統(tǒng)計學意義。對NNRTIs類耐藥突變和NRTIs類耐藥突變的頻率進行χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義,這是由于一線藥物的治療方案多為兩種非核苷類逆轉(zhuǎn)酶抑制劑+一種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑［13］,而目前由TDF、3TC和EFV組成的聯(lián)合治療方案是我國最常用的免費一線治療方案［14］(此次研究中占比67.2%),造成了研究對象的NNRTIs類的藥物突變率更高。

對影響獲得性耐藥發(fā)生的危險因素進行Logistics回歸分析,性別、年齡、職業(yè)、CD4細胞水平、治療方案和亞型各組間差異均無統(tǒng)計學意義,民族和傳播途徑是影響耐藥發(fā)生的獨立危險因素。本研究的傳播途徑中,同性傳播較異性傳播、血液傳播和母嬰傳播發(fā)生獲得性耐藥風險高,這可能與同性傳播患者治療依從性差相關(guān)［15］,而血液傳播大多為吸毒人群,因正在治療的吸毒人群主要在門診定期拿藥,依從性強,長期穩(wěn)定治療有保障。最終無危險因素進入多因素Logistics回歸模型。

綜上所述,為了減少抗病毒治療中耐藥的發(fā)生,必須加強對患者的耐藥監(jiān)測,以及時發(fā)現(xiàn)耐藥從而及時調(diào)整用藥方案,尤其應謹慎使用耐藥率較高的3TC、NVP和EFV,提高治療效果［16］。此外,應對艾滋病患者特別是MSM艾滋病患者加強抗病毒治療依從性教育［17］,并隨著治療時間的延長反復強調(diào)服藥依從性,以盡可能獲得良好的治療效果。