胡巧洪 侯春杰 朱虎威 張婷婷 杜佩 范小明 張瑛 呂振曄

乳腺癌的形成、發(fā)展是復雜的生物學過程，是多基因、多因素共同作用的結果。研究顯示，乳腺癌的各種基因表達產(chǎn)物發(fā)生改變時，會使具有組織特異性的腫瘤結構發(fā)生相應病理學改變，進而在影像學檢查中表現(xiàn)為對應的聲像圖特征[1-2]。Ki-67 是判斷腫瘤細胞增殖活性程度最可靠的指標之一，對乳腺癌的診治與預后評估有重要價值[3-4]，目前臨床上通過手術或穿刺活檢等有創(chuàng)操作獲取組織以進行檢驗。本研究從超聲影像學的角度篩選出與乳腺癌Ki-67 高表達相關的超聲特征并構建預測模型，以期實現(xiàn)Ki-67 高表達的早期、無創(chuàng)預測，為及時判斷病灶侵襲性，制訂患者個體化診療方案及預后判斷提供客觀有效的依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 回顧1999年5月至2022年5月浙江省人民醫(yī)院行常規(guī)超聲檢查且手術病理行Ki-67檢測的337例女性乳腺癌患者影像學和臨床病理資料。納入標準：（1）患者術前均行常規(guī)超聲檢查；（2）經(jīng)手術病理檢查證實為單灶性乳腺惡性腫瘤，且進行免疫組化分析。排除標準：（1）超聲檢查前已行手術或放/化療等相關性治療；（2）影像學或其他臨床病理資料不齊全。將337 例患者按照1∶4 隨機抽樣分為訓練集和驗證集，其中訓練集269例，年齡27～89（54.07±12.21）歲；驗證集68例，年齡30～80（56.59±10.43）歲。本研究經(jīng)浙江省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查通過（批準文號：QT2022328）。

1.2 超聲檢測方法 采用美國GE 公司的LOGIQ E9、德國Siemens 公司的Acuson Sequoia 以及中國Mindray公司的DC-8 和Resona 7s 超聲儀，探頭頻率7～10 MHz。參照2013 年美國放射學會（American College of Radiology，ACR）乳腺影像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（Breast Imaging Reporting and Data System，BI-RADS）[5]收集以下超聲特征：（1）腫瘤最大徑（mm）；（2）邊緣（光整、不光整）；（3）毛刺（有、無）；（4）高回聲暈（有、無）；（5）縱橫比（＜1、≥1）；（6）后方回聲（衰減、不衰減）；（7）微鈣化（有、無）；（8）血供（乏血供、富血供）；（9）阻力指數(shù)（＜0.7、≥0.7）；（10）腋窩淋巴結異常（有、無）。超聲特征由2 位從事乳腺超聲5 年以上的主治醫(yī)師進行評價，意見不一致時經(jīng)協(xié)商后統(tǒng)一結論。

腫塊的血供情況按Adler 血流分級法[6]分為4 級：0級為腫塊內(nèi)未探及血流信號；Ⅰ級為腫塊內(nèi)可見1～2個點狀血流信號；Ⅱ級為腫塊內(nèi)可見3～4 個點狀血流或1 條管壁清晰的血管，長度接近或超過病灶半徑；Ⅲ級為腫塊內(nèi)見5 個以上點狀血流或兩條管壁清晰的血管。把0～Ⅰ級定義為乏血供型腫塊，Ⅱ～Ⅲ級定義為富血供型腫塊。

腋窩淋巴結異常根據(jù)淋巴結大小、形態(tài)、淋巴門結構、實質(zhì)分布及回聲（液化鈣化情況）、血供分布特征、血流動力學指標等超聲特征進行綜合判定。

1.3 Ki-67 表達水平檢測 由病理科高年資主治醫(yī)師進行手術標本免疫組化檢測并分析Ki-67 表達水平。Ki-67陽性表達的診斷標準為該切片熱點區(qū)域視野中腫瘤核著色百分比。根據(jù)2013 年St Gallen 共識中大多數(shù)專家支持的20%作為Ki-67 高表達狀態(tài)的閾值[7]分為Ki-67高表達組（Ki-67≥20%）和低表達組（Ki-67＜20%）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。將單因素分析差異有統(tǒng)計學意義的超聲特征納入多因素logistics 回歸，分析乳腺癌患者Ki-67 高表達的獨立預測因素，并根據(jù)獨立預測因素建立logistic 預測模型；繪制ROC 曲線評估預測模型的預測效能，使用Hosmer-Lemeshow 檢驗判斷模型的擬合優(yōu)度，最后應用驗證組的數(shù)據(jù)判斷預測模型的診斷效能，并采用臨床決策曲線檢測模型的臨床實用性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病理檢查結果 337 例乳腺癌均經(jīng)手術病理檢查證實。根據(jù)人表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）和雌激素受體（estrogen receptor，ER）的表達情況分為Her-2（-）且ER（+）194例，Her-2（+）且ER（+）46 例，Her-2（+）且ER（-）59 例，Her-2（-）且ER（-）38 例。訓練集高表達169 例（62.8%），低表達100 例（37.2%），驗證集高表達43 例（63.2%），低表達25 例（36.8%）。

2.2 訓練集患者超聲特征的單因素分析 訓練集患者Ki-67高表達組與低表達組在腫瘤最大徑、邊緣、血供、腋窩淋巴結異常方面比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而在毛刺、高回聲暈、縱橫比、后方回聲、微鈣化、阻力指數(shù)方面的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 訓練集Ki-67 高表達組和低表達組超聲特征比較

2.3 訓練集患者超聲特征的多因素分析 將單因素分析差異有統(tǒng)計學意義的因素納入多因素logistic 回歸分析，腫瘤最大徑、邊緣、腋窩淋巴結異常均是患者Ki-67 高表達的獨立預測因素，見表2。

表2 訓練集患者Ki-67 高表達的獨立預測因素分析

2.4 logistic 預測模型的構建 根據(jù)表2 構建預測模型，方程為Logit（p）=-1.891+1.077×腋窩淋巴結（正常=0，異常=1）+0.042×腫瘤最大徑（mm）+1.113×邊緣（光整=0，不光整=1），以ROC 曲線評價該模型的區(qū)分度，AUC為0.735（95%CI：0.672～0.798），以0.406為最大約登指數(shù)，此時對應的靈敏度為0.746，特異度為0.660，見圖1。應用擬合優(yōu)度檢驗評價該模型的校準度，結果表明該模型不存在過擬合現(xiàn)象（χ2=14.649，P＞0.05），見圖2。臨床決策曲線驗證了該模型的臨床實用性，見圖3。

圖1 訓練集基于超聲特征預測乳腺癌Ki-67高表達的ROC曲線

圖2 預測模型的擬合優(yōu)度檢驗

圖3 訓練集的臨床決策曲線

2.5 預測模型的驗證 將68 例驗證集患者的參數(shù)代入模型中進行驗證，AUC為0.794（95%CI：0.684～0.904）。當約登指數(shù)為0.491 時，靈敏度為0.651，特異度為0.840，見圖4。臨床決策曲線顯示預測模型具有一定的臨床實用性，見圖5。

圖4 預測模型在驗證集的ROC 曲線

圖5 預測模型在驗證集中的臨床決策曲線

3 討論

乳腺癌是一種具有高度異質(zhì)性生物學行為的惡性腫瘤，不同的免疫組化指標決定了其不同的生物學行為、個體化治療方案及預后。1984 年，Gerdes 等[8]發(fā)現(xiàn)Ki-67 抗原是評估多種腫瘤細胞增殖的有效參數(shù)。隨后的研究顯示，Ki-67 是與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的核抗原及原癌基因，與腫瘤惡性程度有著密切關系，甚至可以作為評估乳腺癌發(fā)展、復發(fā)的獨立預測因素和預測預后的可靠指標[9-10]。2010 年3 月世界乳腺疾病協(xié)作組及北美乳腺癌協(xié)會生物標記委員會專門制定指南以突出Ki-67 在乳腺癌診斷、治療及預后評估中的重要作用[11]。因此，早期識別Ki-67 表達情況對于乳腺癌患者的治療和預后判斷具有重要的臨床意義。

Ki-67 表達水平主要通過手術或者穿刺活檢病理獲得。由于操作的有創(chuàng)性，依從性往往會受到影響，且不具重復性。隨著腫瘤—分子影像學的發(fā)展，學者們發(fā)現(xiàn)腫瘤分子生物學指標與影像學征象之間存在著一定關聯(lián)[1-2，12]。某些特征性分子生物學指標的異常會引起組織病理學特征的改變，從而產(chǎn)生相應的影像學征象。據(jù)此筆者認為，建立在組織病理學基礎上的影像學檢查也可實現(xiàn)對腫瘤生物學指標表達情況的預測。因此，本研究分析了常規(guī)超聲圖像特征和乳腺癌Ki-67 高表達的相關性，建立基于常規(guī)超聲特征的Ki-67 高表達預測模型。

乳腺癌超聲特征與Ki-67 表達水平之間的相關性是學者們研究的熱點，但是仍然存在著爭議。有研究顯示，Ki-67 高表達與腫瘤直徑[13]、腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移[14-15]呈正相關。也有文獻報道Ki-67 高表達的乳腺腫瘤出現(xiàn)鈣化的概率明顯升高[16]，腫瘤內(nèi)新生血管生長、分布紊亂，阻力指數(shù)一般＞0.7[17]。本研究選取腫瘤最大徑、邊緣、毛刺、高回聲暈、縱橫比、后方回聲、微鈣化、血供、阻力指數(shù)、腋窩淋巴結是否異常這10 個常規(guī)超聲特征，結果顯示腫瘤最大徑、邊緣、血供、腋窩淋巴結異常在Ki-67 高表達組與低表達組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。分析其原因，可能是Ki-67高表達的腫瘤細胞增殖更活躍、侵襲性更大，促使腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的能力更強，因此在超聲圖像特征上表現(xiàn)為腫瘤直徑更大、邊緣更不光整、腋窩淋巴結更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。同時，Ki-67 和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達呈正相關[18]。因此，Ki-67 高表達可產(chǎn)生更多的VEGF，促使腫瘤內(nèi)生成更多新生血管，從而超聲表現(xiàn)為腫塊內(nèi)血流信號增多，呈現(xiàn)富血供型。但多因素logistic 回歸分析顯示血供這一特征不是Ki-67 高表達的獨立預測因素，因此單獨根據(jù)血供判斷Ki-67 表達情況則存在一定局限性。此外，本研究顯示毛刺、高回聲暈、縱橫比、后方回聲、微鈣化及阻力指數(shù)與Ki-67 高表達無關（均P＞0.05），這與部分學者的研究結果存在差異[16-17，19-20]，可能超聲特征受多種因素的影響，也可能與本研究的局限性有一定關系。

目前分析較多的是Ki-67異常表達與影像學征象的相關性，但是基于乳腺超聲特征建立Ki-67 高表達預測模型的研究則較少。本研究分析了常規(guī)超聲特征與Ki-67 表達情況的關系，發(fā)現(xiàn)腫瘤最大徑、邊緣和腋窩淋巴結異常這3 個特征是Ki-67 高表達的獨立預測因素，構建了乳腺癌Ki-67 高表達的早期預測模型，并且該模型經(jīng)過驗證具有一定的臨床實用性。本研究模型提示，當乳腺超聲顯示為腫瘤直徑大、邊緣不光整、腋窩淋巴結存在異常時，其Ki-67呈現(xiàn)高表達的可能性增大，從而可以預測該腫瘤的侵襲性增大、預后差。因此，在臨床工作中優(yōu)選這幾個超聲特征可以早期、快速、無創(chuàng)地預測Ki-67高表達，為后續(xù)的診治提供重要參考信息。

本研究具有一定的局限性：（1）單中心、小樣本的回顧性研究，可能存在一定的選擇偏倚；（2）僅分析Ki-67 不同水平的表達情況，未將其他免疫組化指標的影響納入研究范圍；（3）腫瘤最大徑涵蓋范圍有限，且超聲特征判斷多為定性指標，可能受超聲醫(yī)師技術和經(jīng)驗差異影響，缺乏定量指標。因此，在后續(xù)研究中有待擴大研究范圍，擴充樣本量，細化分組，綜合多方面的影響因素。

綜上所述，乳腺癌的常規(guī)超聲特征與Ki-67 表達水平有一定的相關性，且腫瘤最大徑、邊緣和腋窩淋巴結異常是Ki-67 高表達的獨立預測因素。本研究基于常規(guī)超聲特征構建的預測模型能夠?qū)θ橄侔㎏i-67高表達進行早期快速無創(chuàng)預測，為臨床制訂患者個體化診療及判斷預后提供客觀有效的依據(jù)。