劉文婧,呂慧玲,王順娟,馮 琳,湯 鋒,李潤(rùn)樂§,胥 瑾*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部,西寧 810001;2.青海省藏醫(yī)院,西寧 810007;3.青海省人民醫(yī)院,西寧 810007;4.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心,西寧 810001)

課題組前期利用羊駝天然納米抗體文庫(kù),篩選得到了針對(duì)幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)尿素酶B亞基(Urease-B)的高親和力納米抗體UreNb。本研究構(gòu)建幽門螺旋桿菌尿素酶納米抗體UreNb重組質(zhì)粒,在大腸桿菌系統(tǒng)中通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白并予以純化,再對(duì)表達(dá)產(chǎn)物及純化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

pET22b質(zhì)粒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Arctic-Express表達(dá)菌、BL-21(DE3)表達(dá)菌、Rosetta表達(dá)菌、pSumo-mut質(zhì)粒均購(gòu)自鐘鼎生物公司。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司,蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Thermo公司,IPTG購(gòu)自Biotopped公司,氨芐青霉素鈉、四環(huán)素、卡納霉素購(gòu)自Solarbio公司,0.22 μm無(wú)菌濾器和透析袋購(gòu)自Ruitaibi公司,Ni-IDA親和層析柱購(gòu)自GenScript公司,4×蛋白上樣緩沖液購(gòu)自Solarbio公司。

1.1.2 主要儀器

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀購(gòu)自艾本德公司,凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自法瑪西亞公司,酶標(biāo)分析儀購(gòu)自美谷分子公司,蛋白純化儀購(gòu)自上海嘉鵬有限公司,低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)西格瑪公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 UreNb在質(zhì)粒pET22b中的構(gòu)建及表達(dá)鑒定

在前期研究中經(jīng)篩選獲得了針對(duì)Urease-B納米抗體UreNb的氨基酸序列,經(jīng)翻譯后得到的核苷酸序列采用密碼子優(yōu)化后用于全基因合成。在T1連接酶體系下經(jīng)過(guò)酶切(NcoI/XhoI)后連接(4℃,過(guò)夜),將UreNb核苷酸序列克隆至質(zhì)粒pET22b后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,獲得重組質(zhì)粒pET22b-UreNb。從培養(yǎng)的陽(yáng)性菌落挑選、提取質(zhì)粒,通過(guò)雙酶切(MluI/XhoI)法鑒定克隆結(jié)果。pET22b-UreNb分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL-21、Arctic Express、Rosetta,涂布于含有相應(yīng)抗性的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)(37℃,過(guò)夜)后,挑取單克隆并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),而后分別吸取1 mL菌液加入到200 mL的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。三種表達(dá)菌同時(shí)加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG。10 mmo/L)進(jìn)行誘導(dǎo)。通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,使用BL-21表達(dá)菌株時(shí),將誘導(dǎo)溫度分別調(diào)整至15℃和37℃,使用Arctic Express、Rosetta菌株表達(dá)時(shí),將誘導(dǎo)溫度調(diào)整至37℃。隨后分別從三個(gè)表達(dá)菌株中取出1 mL菌液離心后棄上清,將1×上樣緩沖液(100 μL)加入沉淀物中重懸。剩余培養(yǎng)物離心后棄上清用PBS重懸菌體沉淀物,將重懸液用超聲波破碎后,分別取上清與沉淀物加入上樣緩沖液后重懸。做電泳(12% SDS-PAGE)分析后以考馬斯亮藍(lán)染色確認(rèn)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。

1.2.2 UreNb在質(zhì)粒pSumo-mut中的構(gòu)建及表達(dá)鑒定

用T1連接酶體系連接,將經(jīng)UreNb納米抗體經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列克隆至pSumo-mut表達(dá)載體,克隆位點(diǎn)為無(wú)縫克隆-XhoI。電轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽(yáng)性單克隆菌落并提取質(zhì)粒,通過(guò)酶切(MluI/XhoI)鑒定質(zhì)粒pSumo-mut-UreNb的構(gòu)建結(jié)果。隨后將正確克隆的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL-21,將陽(yáng)性克隆菌落接種于Kana LB液體培養(yǎng)基(5 mL)中(37℃,220 r/min,過(guò)夜),培養(yǎng)后按1%接種于Kana LB液體培養(yǎng)基(50 mL)中培養(yǎng)(37℃,220 r/min)至OD值為0.4～0.6,加入IPTG誘導(dǎo)(15℃,過(guò)夜)。次日收集菌體,用超聲波破碎后收集上清及沉淀物。將誘導(dǎo)前、后的菌液以及超聲波破碎后的上清和沉淀物進(jìn)行SDS-PAGE電泳,以確認(rèn)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。

1.2.3 重組蛋白pSumo-mut-UreNb的包涵體復(fù)性

對(duì)上述表達(dá)產(chǎn)物鑒定,重組蛋白pSumo-mut-UreNb在沉淀物中表達(dá),遂將上一步驟中經(jīng)超聲波破碎后的菌液重懸、離心后棄上清。沉淀物分別用50 mM NaH2PO4、10 mM Tris-HCL、8 M尿素溶液混懸后以超聲波裂解。將上述溶液離心后吸取上清加入透析袋中,先后置于添加了還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的復(fù)性工作緩沖液中,靜置(4℃,過(guò)夜)后離心收集上清。

1.2.4 pSumo-mut-UreNb融合蛋白的純化分析

使用經(jīng)Binding-Buffer(0.15 M NaCl,20 mM Tris-HCl,pH為8.0)預(yù)平衡的親和層析柱,沖洗至流出液OD280值到達(dá)基線后加入復(fù)性后的蛋白溶液。用Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl,20 mM Imidazole,0.15 M NaCl,pH為8.0)沖洗,至流出液OD280值到達(dá)基線。用Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl,250 mM Imidazole,0.15 M NaCl,pH為8.0)洗脫目的蛋白,收集流出液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 pSumo-mut-UreNb純化蛋白鑒定

將1.2.4步驟中的凝膠用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,以鼠源His-tag為一抗、HPR標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗,添加顯色液使用熒光化學(xué)發(fā)光儀成像進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 pET22b-UreNb的質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)鑒定結(jié)果

Ure-Nb目的基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后得到的核苷酸序列如下:CCATGGGCCAGGTTCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGTGGTCTGGTTCAGGCAGGTGGTTCACTGCGCCTGAGCTGTGCTGCTAGCGGTAATACCCTGCGTATTGTTGCAATGGGTTGGTATCGCCAGGGTGCAGGCAATAAACGTGATCTGGTGGCAAGTATTAGCACCAGCAATGATCGTACCACCTATGCCGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGTCGTGATAGTGCAAAAAACACCATGTATCTGCAGATGAATAGCCATCATCATCATCACCATTGACTCGAG。目的序列連入載體pET22b后經(jīng)酶切(MluI/XhoI)的鑒定結(jié)果見圖1。圖1顯示,克隆位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)不在同一位置,圖中條帶顯示的片段大小與預(yù)期設(shè)計(jì)大小一致(1 200 bp),表明納米抗體UreNb目的序列已成功插入質(zhì)粒中,表示重組表達(dá)載體pET22b-UreNb構(gòu)建成功。

M:Marker;Line1:酶切前質(zhì)粒;Line2:酶切后質(zhì)粒

將pET22b-UreNb分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL-21、Arctic Express、Rosetta中,其中圖2、3顯示BL-21表達(dá)菌株在誘導(dǎo)溫度為15、37℃時(shí)未出現(xiàn)表達(dá)條帶。

M:Marker;Line1:pET22b誘導(dǎo)(空載);Line2:未誘導(dǎo);Line3:誘導(dǎo)后;Line4:誘導(dǎo)破碎后上清;Line5:誘導(dǎo)破碎后沉淀物

M:Marker;Line1:pET22b誘導(dǎo)(空載);Line2:未誘導(dǎo);Line3:誘導(dǎo)后;Line4:誘導(dǎo)破碎后上清;Line5:誘導(dǎo)破碎后沉淀物

圖4、5顯示表達(dá)菌Arctic Express、Rosetta被誘導(dǎo)(37℃)后未見明顯表達(dá),故更換重組表達(dá)載體為pSumo-mut。

M:Marker;Line1:pET22b誘導(dǎo)(空載);Line2:未誘導(dǎo);Line3:誘導(dǎo)后;Line4:誘導(dǎo)破碎后上清;Line5:誘導(dǎo)破碎后沉淀物

M:Marker;Line1:pET22b誘導(dǎo)(空載);Line2:未誘導(dǎo);Line3:誘導(dǎo)后;Line4:誘導(dǎo)破碎后上清;Line5:誘導(dǎo)破碎后沉淀物

2.2 pSumo-mut-UreNb的質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)鑒定結(jié)果

經(jīng)T1連接酶體系連接,將UreNb插入原核表達(dá)載體pSumo-mut,克隆位點(diǎn)為無(wú)縫克隆-XhoI,序列如下:CAGGTTCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGTGGTCTGGTTCAGGCAGGTGGTTCACTGCGCCTGAGCTGTGCTGCTAGCGGTAATACCCTGCGTATTGTTGCAATGGGTTGGTATCGCCAGGGTGCAGGCAATAAACGTGATCTGGTGGCAAGTATTAGCACCAGCAATGATCGTACCACCTATGCCGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGTCGTGATAGTGCAAAAAACACCATGTATCTGCAGATGAATA GCTAACTCGAG。目的序列連入載體pSumo-mut后,提取質(zhì)粒經(jīng)酶切(MluI/XhoI)鑒定,條帶大小與預(yù)期大小一致(1 500 bp),表明UreNb目的序列已成功插入質(zhì)粒中,表示重組表達(dá)載體構(gòu)建成功,見圖6。

M:Marker;Line1:酶切前質(zhì)粒;Line2;酶切后質(zhì)粒

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白pSumo-mut-UreNb,對(duì)未誘導(dǎo)樣本、誘導(dǎo)后樣本及破碎后上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。圖7顯示,在破碎后沉淀部位27 kD處可見明顯增粗條帶,而在可溶條帶中未見。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,原核表達(dá)載體BL-21能夠成功表達(dá)重組蛋白pSumo-mut-UreNb,且重組蛋白pSumo-mut-UreNb在原核表達(dá)載體BL-21中是以包涵體形式表達(dá)。

M:Marker;Line1:pET22b誘導(dǎo)(空載);Line2:未誘導(dǎo);Line3:誘導(dǎo)后;Line4:誘導(dǎo)破碎后上清;Line5:誘導(dǎo)破碎后沉淀物

2.3 重組蛋白pSumo-mut-UreNb的包涵體復(fù)性和純化結(jié)果

目標(biāo)蛋白經(jīng)包涵體變、復(fù)性和純化后對(duì)超聲波破碎處理后的樣品、純化后流出樣品及洗脫樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。圖8顯示,純化后的目的蛋白純度較高。

M:Marker;Line1:未純化蛋白;Line2:洗脫液中的蛋白;Line3:純化后的目的蛋白

對(duì)純化后獲得的目的蛋白以鼠源His-tag為一抗、HPR標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證,結(jié)果顯示,目的蛋白大小約為27 kDa左右,與理論分子量基本吻合,結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果,見圖9。

M:Marker;1:純化后樣品

3 討論

目前,單克隆抗體應(yīng)用于檢測(cè)及診斷治療方面的研究較多,但小分子納米抗體的應(yīng)用還在起步階段[1],尤其在幽門螺旋桿菌感染治療方面還未出現(xiàn)用于診斷及治療的納米抗體。幽門螺旋桿菌作為胃部特異性病原菌,是導(dǎo)致胃部疾病發(fā)生發(fā)展的重要細(xì)菌,其中Urease的表達(dá)貫穿于幽門螺旋桿菌整個(gè)生命活動(dòng)的始終[2]。本研究中尿素酶納米抗體能夠特異性結(jié)合Urease-B亞基,使其失去活性。另一方面,Urease-B含有酶活性中心,具有很高的抗原性,是開發(fā)預(yù)防和治療性疫苗的潛在抗原[3]。納米抗體天然存在于駱駝科及鯊魚科動(dòng)物血清中,與傳統(tǒng)單克隆抗體不同,納米抗體的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和小分子量,以及高穩(wěn)定性為抗體藥物的開發(fā)提供了全新的思路,同時(shí)也可因需要而進(jìn)行人源化改造[4]。因此尋找合適的表達(dá)載體,并且能夠高效、大量表達(dá)此抗體,可有助于后期的實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)在抗體表達(dá)過(guò)程中首先選擇了pET-22b質(zhì)粒,此質(zhì)粒能夠?qū)⒈磉_(dá)的目的蛋白定位在細(xì)胞外周質(zhì)腔后形成可溶性蛋白[5]。隨后使用表達(dá)載體pSumo-mut,此質(zhì)粒不僅能夠提高蛋白的溶解性,而且有助于誘導(dǎo)蛋白形成正確折疊,從而形成三級(jí)空間結(jié)構(gòu)[6]。其攜帶的6×His標(biāo)簽使重組蛋白可以通過(guò)Ni柱親和純化后獲得高純度的蛋白。利用Sumo蛋白酶能夠特異性切割融合蛋白,從固定的位置將pSumo-mut蛋白與重組蛋白徹底分離[7]。在原核表達(dá)系統(tǒng)中,BL-21大腸桿菌表達(dá)菌株不含lon、OmpT蛋白酶,所以可降低細(xì)胞中表達(dá)的異源蛋白的降解水平并且提高轉(zhuǎn)化效率[8]。ArcticExpress菌株是BL-21的改良菌株,可促進(jìn)表達(dá)蛋白的穩(wěn)定,此表達(dá)菌可降低重組蛋白包涵體的形成率,增加可溶重組蛋白的表達(dá)量及生物活性[9]。Rosetta菌株可補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA,提高外源基因的表達(dá)水平[10]。本研究首先選擇pET-22b載體擬提高可溶蛋白表達(dá)率,然后選擇Arctic Express、BL-21、Rosetta三種表達(dá)菌分別測(cè)試重組蛋白表達(dá)成功率,結(jié)果顯示,成功構(gòu)建的pET-22b-UreNb均未在上述三種表達(dá)菌中有效表達(dá)。隨后將重新構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSumo-mut-UreNb轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL-21中進(jìn)行表達(dá),經(jīng)鑒定可在沉淀物中大量表達(dá),純化后經(jīng)過(guò)SDS-PAGE、Western Blot驗(yàn)證,鑒定其為成功表達(dá)載體,成功獲得UreNb純化蛋白。pSumo-mut載體因攜帶Sumo融合蛋白,能夠使目的蛋白形成正確折疊,且后續(xù)經(jīng)特異性切割融合蛋白后,重組蛋白N端無(wú)氨基殘留,有利于后續(xù)研究的進(jìn)行。

青海地區(qū)幽門螺旋桿菌感染的發(fā)生率較高,其感染與胃潰瘍、胃炎以及胃癌的發(fā)生也有一定相關(guān)性[11]。幽門螺旋桿菌感染存在于疾病的活動(dòng)期和靜止期,活動(dòng)期感染增殖速度更加迅速,患者臨床癥狀更為明顯[12]。在幽門螺旋桿菌的刺激下,不但可以誘發(fā)胃癌,而且能夠影響胃癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。因此,在高原地區(qū)胃部疾病的防治中,控制幽門螺旋桿菌感染是現(xiàn)階段仍需解決的重要問(wèn)題。

鑒于以上納米抗體UreNb的應(yīng)用前景,本研究基于前期研究基礎(chǔ),構(gòu)建了該納米抗體的重組質(zhì)粒,建立了原核表達(dá)體系,經(jīng)純化得到了其純化蛋白,為制備幽門螺旋桿菌診斷抗體開辟了新的途徑。