易 云,江亞惠,楊生璽,拉青才讓,2,趙延禮*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部,西寧 810001;2.青海省海南藏族自治州藏醫(yī)院,共和 813000)

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)德孜陽新(DZYX)醇提物具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用,本研究通過將DZYX醇提物作用于人胃癌細(xì)胞SGC-7901來驗(yàn)證其對胃癌細(xì)胞遷移的影響,并進(jìn)一步探究DZYX抗胃癌的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 細(xì)胞株

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購于武漢普諾賽公司;SGC-7901細(xì)胞株來源于胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶,具有高轉(zhuǎn)移、高侵襲性。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DZYX由青海省海南州藏醫(yī)院提供。高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Corning公司;CCK-8試劑盒(批號C6102030)購自上海翊圣生物科技有限公司;Actin-Tracker Green(微絲綠色熒光探針)試劑盒購自上海碧云天公司;β-actin、p-mTOR、P-AKT 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;MMP-2抗體購自澳大利亞Affinity公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

倒置顯微鏡及Ti2-E型熒光顯微鏡購自日本Nikon公司;多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司;RTCA DP實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀購自美國Agilent公司;PowerPac Universal型電泳儀、Mini PROTEAN Tetra Cell型電泳槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DZYX提取與配制

研磨DZYX丸劑,稱取60 g DZYX粉末浸泡于95%乙醇中過夜;次日回流提取3次,將提取物過濾后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,干燥得到DZYX醇提物。稱取DZYX醇提物6 g溶于10 mL DMSO中配制成濃度為600 mg/mL的DZYX醇提物母液;經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后分裝,置-20℃ 冰箱儲存。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組(含1‰ DMSO)、陽性對照順鉑組(10 μg/mL DDP)和DZYX組。DZYX組采用完全培養(yǎng)基稀釋并過濾DZYX醇提物,配制成濃度為200、400、600 μg/mL的液體。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)

以CCK-8法觀察不同濃度的DZYX醇提物對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響:取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞,按照每孔5×103個細(xì)胞均勻鋪于96孔板中,待細(xì)胞完全貼壁后按照分組設(shè)計更換為不同濃度的含藥培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)24、48 h后,每孔加10 μL的CCK-8溶液,避光孵育1 h,用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度值(每組設(shè)置6個復(fù)孔)。

細(xì)胞活力=[OD(加藥組)-OD(空白組)]/[OD(對照組)-OD(空白組)]×100%

1.2.4 細(xì)胞動態(tài)遷移曲線(RTCA)檢測

取CIM Plate 16孔板,下室加入165 μL含血清培養(yǎng)基,上室加30 μL無血清培養(yǎng)基,平衡1 h后置于RTCA Station上測基線;收集對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基配制細(xì)胞濃度為8×105個/mL的懸液;取出板子,每孔按實(shí)驗(yàn)分組加入50 μL無血清含藥培養(yǎng)基,再加入50 μL細(xì)胞懸液,輕輕拍打混勻;在超凈臺內(nèi)靜置30 min后上機(jī)檢測RTCA。

1.2.5 Wound healing實(shí)驗(yàn)

取SGC-7901細(xì)胞鋪滿六孔板,利用100 μL槍頭在細(xì)胞培養(yǎng)皿中劃出3道豎線,用PBS清洗3次,對照組加入含DMSO的無血清培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組加入含DZYX醇提物(濃度為400 μg/mL)的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),0、24、48 h時在倒置顯微鏡下拍照觀察。

細(xì)胞遷移率=細(xì)胞遷移面積/細(xì)胞劃痕面積。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

收集對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞。在Transwell小室內(nèi)接種無血清的含不同濃度藥物的細(xì)胞懸液200 μL,細(xì)胞密度為1×106個/mL,將Transwell小室放入培養(yǎng)板中,Transwell下室為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(600 μL),置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取出Transwell小室,用PBS洗滌3次,以棉簽擦拭小室聚碳酸酯膜表面細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定10 min、0.1%結(jié)晶紫染液染色15 min,用PBS洗滌3次小室至透明,干燥后置顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取3個視野計算遷移細(xì)胞個數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞骨架染色

消化收集SGC-7901細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×104個/mL;于六孔板孔中央滴加20 μL完全培養(yǎng)基,用鑷子將蓋玻片放入孔中央,使其完全吸附于六孔板;每張玻片上滴加500 μL細(xì)胞懸液,置培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h,細(xì)胞貼壁后,貼緊側(cè)壁緩慢加入2 mL完全培養(yǎng)基,孵育過夜后更換含藥培養(yǎng)基(對照組含1‰ DMSO,實(shí)驗(yàn)組含濃度為400 μg/mL的DZYX醇提物),置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后棄含藥培養(yǎng)基,用PBS洗滌3次,每孔加入1 mL 4%多聚甲醛,于室溫固定15 min,用預(yù)冷PBS洗滌;每孔加入1 mL TritionX-100,于室溫孵育10 min,用含0.1% TritionX-100的PBS洗滌3次,在載玻片上滴加200 μL Actin-Tracker Green稀釋液(1:100),于室溫孵育30 min;每孔加入200 μL DAPI染液,于室溫孵育5 min,用PBS洗滌3次,吸盡蓋玻片多余液體,最后滴加抗熒光淬滅劑,置共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.8 SGC-7901細(xì)胞中的MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平檢測

用濃度為400 μg/mL的DZYX醇提物處理SGC-7901細(xì)胞 24 h,裂解提取蛋白質(zhì)。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)完成后,將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶于常溫封閉1 h。用PBST洗膜3次,孵一抗后置冰箱(4℃)過夜,用PBST洗膜3次后孵二抗,再次用PBST洗膜3次后加發(fā)光液顯影,用Image J軟件分析。以β-Actin為內(nèi)參,計算MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達(dá)水平。

目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量(IOD)=目標(biāo)蛋白的灰度值/β-Actin灰度值。

1.2.9 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

從對照組SGC-7901細(xì)胞和用600 μg/mL DZYX醇提物處理24 h的SGC-7901細(xì)胞中提取RNA(每組重復(fù)3次)。使用分子生物學(xué)設(shè)備對RNA樣品的純度、濃度和完整性進(jìn)行檢查,以保證樣品合格。富集mRNA后,構(gòu)建cDNA文庫,然后在Illumina Novaseq系統(tǒng)上進(jìn)行批量RNA測序和轉(zhuǎn)錄組分析,此過程委托Biomarker Technologies公司(中國北京)進(jìn)行。采用DESeq2樣本進(jìn)行差異分析,設(shè)定︱log2FC︱≥2、FDR<0.01,對6個樣品進(jìn)行差異基因篩選并繪制火山圖對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。將FPKM作為基因表達(dá)水平的衡量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異性基因表達(dá)分析,然后對差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO富集分析和KEGG通路富集分析。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫收集上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因,與藥物作用后的差異表達(dá)基因進(jìn)行交集分析,同時對藥物作用后出現(xiàn)差異表達(dá)的主要遷移相關(guān)基因進(jìn)行基因表達(dá)量分析,進(jìn)一步探討DZYX醇提物對胃癌細(xì)胞遷移的抑制作用及機(jī)制。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)

與對照組比較,不同濃度DZYX醇提物分別作用SGC-7901細(xì)胞24、48 h可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞活性,且呈濃度依賴性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。(表1)

表1 DZYX 醇提物對SGC-7901細(xì)胞活性的影響

2.2 RTCA實(shí)驗(yàn)

監(jiān)測胃癌SGC-7901細(xì)胞動態(tài)遷移數(shù)量發(fā)現(xiàn),在不同濃度DZYX醇提物處理下,胃癌細(xì)胞的遷移數(shù)量降低,且隨DZYX醇提物濃度的增加,遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯下降,具有濃度依賴性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。提示DZYX醇提物具有抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移作用,根據(jù)RTCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取濃度為400 μg/mL的DZYX醇提物做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(圖1,表2)

圖1 DZYX醇提物對SGC-7901細(xì)胞遷移的影響

表2 RTCA實(shí)時遷移曲線定量分析結(jié)果

2.3 Wound healing實(shí)驗(yàn)

Wound healing實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相較于對照組,DZYX醇提物作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h和48 h后,傷口愈合趨勢減弱,劃痕愈合率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),表明DZYX醇提物能降低劃痕愈合率,抑制胃癌細(xì)胞遷移。(圖2,表3)

*Yuan Peng is President of China Institutes of Contemporary International Relations.

圖2 SGC-7901細(xì)胞遷移圖(×100)

表3 SGC-7901細(xì)胞遷移率

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證DZYX醇提物抑制胃癌細(xì)胞遷移的能力,DZYX醇提物作用胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h后的Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DZYX醇提物作用胃癌SGC-7901細(xì)胞穿越Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)低于正常對照組,細(xì)胞遷移率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。(圖3,表4)

圖3 SGC-7901細(xì)胞遷移圖(×40)

表4 SGC-7901細(xì)胞遷移數(shù)目

2.5 細(xì)胞骨架染色實(shí)驗(yàn)

腫瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動離不開細(xì)胞骨架,鬼筆環(huán)肽熒光染料能與細(xì)胞骨架中的F-actin蛋白特異性結(jié)合。置激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與對照組相比,經(jīng)DZYX醇提物處理后,SGC-7901細(xì)胞內(nèi)F-actin聚合纖維絲的數(shù)量顯著減少,細(xì)胞表面的絲狀偽足減少甚至消失,細(xì)胞骨架斷裂成團(tuán),表明DZYX醇提物能夠抑制微絲的生成,促使細(xì)胞骨架斷裂,導(dǎo)致胃癌細(xì)胞失去黏附收縮能力,從而抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的遷移。(圖4)

圖4 經(jīng)鬼筆環(huán)肽染色的細(xì)胞骨架(×400)

2.6 蛋白表達(dá)測定實(shí)驗(yàn)

與對照組比較,DZYX醇提物能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞中的MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平下降,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示DZYX醇提物可能通過下調(diào)MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平抑制胃癌細(xì)胞遷移。(圖5,表5)

圖5 DZYX對細(xì)胞遷移和PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的影響

表5 p-AKT、p-mTOR及MMP-2蛋白含量

2.7 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,并與Control組比較,在經(jīng)600 μg/mL DZYX醇提物處理24 h的SGC-7901細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了2 338個差異基因,其中下調(diào)基因1 472個、上調(diào)基因866個。(圖6)

圖6 差異表達(dá)基因火山圖

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到與EMT相關(guān)的基因4 869個,將其與篩選出的差異基因進(jìn)行韋恩分析后,2個集合共有交集基因587個,表明DZYX醇提物對EMT過程有一定影響,存在潛在靶點(diǎn)(圖7)。

圖7 DZYX醇提物與EMT相關(guān)基因韋恩圖

從差異基因中可直接篩選到部分與遷移相關(guān)的MMPs家族基因MMP-1、MMP-11、MMP-13、MMP-24及EMP-1基因,經(jīng)GEPIA網(wǎng)站驗(yàn)證,上述MMP基因在胃癌中均高表達(dá),基因表達(dá)量熱圖顯示DZYX醇提物可直接降低MMP-11、MMP-13、MMP-24的表達(dá)并上調(diào)EMP-1,提示了其對胃癌細(xì)胞遷移的抑制作用。(圖8)

圖8 遷移相關(guān)基因表達(dá)量熱圖

將差異基因經(jīng)GO功能富集分析發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞組分上主要影響細(xì)胞膜(integral component of membrane membrane)、整合素(integrin complex)及層粘連蛋白(laminin complex laminin-2 complex)等;在生物學(xué)過程中主要富集在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞通訊及細(xì)胞凋亡調(diào)控等過程(圖9)。

KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn),差異基因顯著富集的通路有腫瘤相關(guān)通路(Pathways in cancer)、PI3K-AKT信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、細(xì)胞因子-受體相互作用通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)、RAS信號通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)及焦點(diǎn)粘附通路(Focal adhesion)。(圖10)

A:KEGG氣泡圖;B:Focal adhesion基因表達(dá)量聚類熱圖;C:Focal adhesion蛋白互作圖

3 討論

有效抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移對于提高患者生存期具有重要意義。近年來,中藏藥治療腫瘤轉(zhuǎn)移逐漸受到關(guān)注,其中許多方劑已被闡明具有良好的抗轉(zhuǎn)移效果。解毒三根湯廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌的治療,此藥通過下調(diào)Hippo信號通路中的TAP、TAZ基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[1,2]。研究表明,中藥補(bǔ)肺湯能夠抑制肺癌A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲,其作用機(jī)制可能與抑制EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)以及激活Smad信號通路有關(guān)[3]。中藥T33作用于乳腺癌MDA-MB231、MCF-7細(xì)胞后,可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞遷移,并呈濃度依賴性[4]。本研究利用Transwell、Wound healing以及RTCA等多種實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證DZYX醇提物對胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移的影響。轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果表明,DZYX醇提物與EMT相關(guān)基因存在潛在靶點(diǎn),能夠抑制SGC-7901細(xì)胞的遷移并影響胃癌細(xì)胞的侵襲。

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程。在此過程中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)起到了關(guān)鍵作用,MMPs通過降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中的各種蛋白質(zhì)組分破壞ECM的完整性,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn),胃癌組織中的MMP-2和MMP-9表達(dá)率高達(dá)58.3%和50.0%。許多中藥可以通過抑制MMPs的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。研究[7]發(fā)現(xiàn),中藥胃腸安可降低人胃癌細(xì)胞MKN45的侵襲和遷移能力,其機(jī)制可能與下調(diào)MMP2、MMP-9蛋白水平直接相關(guān)。中藥隱丹參酮通過下調(diào)結(jié)腸癌CT26細(xì)胞中的MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲[8]。本研究在蛋白水平檢測經(jīng)DZYX醇提物處理后的人胃癌細(xì)胞SGC-7901中的MMP-2的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,細(xì)胞中的MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,表明DZYX醇提物能抑制胃癌細(xì)胞中MMP-2的表達(dá),可能是其抑制SGC-7901細(xì)胞遷移的機(jī)制之一。轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果顯示,DZYX醇提物同時能降低MMP-11、MMP-13、MMP-24基因的表達(dá),提示其對胃癌細(xì)胞遷移的抑制作用與抑制MMPs的表達(dá)有關(guān)。

細(xì)胞骨架由微絲、微管和中間纖維三個部分組成,起到維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形狀,協(xié)調(diào)細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞分裂和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)茸饔?其中微絲由大量肌動蛋白組成,肌動蛋白以單體(G-肌動蛋白)或聚合形式(F-肌動蛋白)組成存在于細(xì)胞中[9]。研究[10]表明,重塑細(xì)胞骨架具有抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用,小扁豆凝集素通過降低肝癌細(xì)胞中肌動蛋白的含量使細(xì)胞骨架變得松散,重排細(xì)胞骨架可抑制肝癌細(xì)胞的遷移。研究[11]發(fā)現(xiàn),脂蟾毒配基明顯下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中肌球蛋白Ⅱ表達(dá)水平,通過抑制肌動蛋白細(xì)胞骨架聚合、下調(diào)PI3K/AKT信號通路,降低卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。以上研究均證明減少細(xì)胞骨架中肌動蛋白含量、重排細(xì)胞骨架能夠影響腫瘤細(xì)胞的遷移能力。本研究利用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架中的F-肌動蛋白,觀察胃癌細(xì)胞中微絲的分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組胃癌細(xì)胞中微絲豐富,排列緊密,細(xì)胞與細(xì)胞之間相互聯(lián)系,而DZYX醇提物處理組細(xì)胞中微絲含量顯著減少,細(xì)胞骨架斷裂成團(tuán),提示DZYX醇提物可抑制微絲聚合,重塑細(xì)胞骨架可影響胃癌細(xì)胞的遷移能力。同時轉(zhuǎn)錄組學(xué)中的GO功能注釋及KEGG通路結(jié)果顯示,DZYX醇提物能影響胃癌細(xì)胞的整合素及層粘連蛋白,且主要富集于焦點(diǎn)粘附通路,提示其可能為DZYX醇提物抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

PI3K/AKT信號通路與細(xì)胞遷移密切相關(guān),研究證明該信號通路參與了細(xì)胞遷移過程。中藥烏梅丸能夠抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞遷移,同時降低細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)水平,其發(fā)揮作用機(jī)制可能與PI3K/AKT信號通路的抑制有關(guān)[12]。研究[13]表明,槲皮素通過下調(diào)PI3K/AKT中AKT的磷酸化表達(dá)水平抑制口腔癌Tca-8113細(xì)胞的遷移和侵襲。研究[14]發(fā)現(xiàn),海芋乙醇提取物以劑量依賴性方式抑制黑色素瘤細(xì)胞(B16-F10、A375、A2058)的增殖、遷移和侵襲,其抗腫瘤作用與下調(diào)PTEN/PI3K/AKT信號通路的表達(dá)有關(guān)。此外,還有研究[15]表明,中藥四逆散能夠通過抑制NF-kappaB和AP-1上游的PI3K/AKT的激活,抑制乙型肝炎X蛋白誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。因此,我們檢測了PI3K/AKT通路下游中的兩個關(guān)鍵性蛋白AKT和m-TOR發(fā)現(xiàn),經(jīng)DZYX醇提物處理后的胃癌SGC-7901細(xì)胞中的兩種蛋白的磷酸化水平顯著降低,提示DZYX醇提物能夠抑制SGC-7901細(xì)胞遷移可能與抑制PI3K/AKT信號通路激活有關(guān)。

綜上所述,本研究證實(shí)DZYX醇提物能夠抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901的遷移能力,其機(jī)制可能主要與下調(diào)MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平相關(guān),同時可能通過整合素-焦點(diǎn)粘附機(jī)制抑制SGC-7901的侵襲能力。