桑莉莉，吳俊哲，高大偉

（中山市中醫(yī)院骨科，廣東中山 528400）

肩周炎是肩周肌肉、肌腱、滑囊、關(guān)節(jié)囊等軟組織的慢性炎癥，導(dǎo)致盂肱關(guān)節(jié)囊的炎性粘連、僵硬及慢性退變，以關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限（以外展、外旋和后伸為主）為臨床特征的疾病，多發(fā)于50 歲左右的中老年人，女性發(fā)病率高于男性，左肩多于右肩[1-2]。由于肩周炎的臨床表現(xiàn)復(fù)雜，病程持續(xù)1～2年，甚至治愈后仍遺留肩關(guān)節(jié)功能受限，研究[3]表明，肩周炎主要病理表現(xiàn)為喙肱韌帶、肱二頭肌下滑囊等無(wú)菌性炎癥粘連、肌腱組織纖維化增生和變性等；但其具體病理機(jī)制尚不明確。因此，越來(lái)越多的學(xué)者采用動(dòng)物模型進(jìn)行肩周炎的病理機(jī)制研究。根據(jù)既往文獻(xiàn)常用的肩周炎動(dòng)物模型分為以下4 種：風(fēng)寒濕刺激模型[4]、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型[5]、手術(shù)損傷模型[6]和石膏制動(dòng)模型[7-8]；但其模型穩(wěn)定性如何尚不清楚。因此，本研究建立以上4 種肩周炎SD 大鼠模型，比較其炎癥以及纖維化的情況，篩選穩(wěn)定有效的造模方法，以期為肩周炎的發(fā)病機(jī)制及藥效學(xué)研究提供基礎(chǔ)支撐，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物100只無(wú)特殊病原體（SPF）級(jí)雄性SD 大鼠，（7 ± 0.5）周齡，體質(zhì)量（0.20～ 0.22）kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0001]提供。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境控制在溫度18～ 26 ℃，相對(duì)濕度40%～ 70%，噪音85分貝以下，通風(fēng)換氣8～12次/h。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)中山市中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：2023ZSZY-LLK-291）。

1.2 主要試劑與儀器蘇木素-伊紅（HE）染液（武漢谷歌生物科技公司）；兔抗環(huán)氧合酶1（COX-1）抗體、兔抗降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）受體成分蛋白（CRCP）抗體、兔抗泛素羧基末端水解酶（UCHL）抗體（美國(guó)Proteintech 公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）（美國(guó)Abcam 公司）；兔抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）抗體（美國(guó)Bioss 公司）；山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Servicebio 公司）。RM2016 組織切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；NIKON ECLIPSE CI 正置光學(xué)顯微鏡、NIKON DS-U3成像系統(tǒng)（日本尼康公司）；WD-9405A脫色搖床（北京市六一儀器廠）。

1.3 動(dòng)物分組與干預(yù)將100 只SD 大鼠隨機(jī)分為5組，即風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動(dòng)模型組、空白對(duì)照組，每組20只。

風(fēng)寒濕刺激模型[4]：模擬風(fēng)寒濕條件刺激肩關(guān)節(jié)。大鼠肩部局部去毛后，給予中強(qiáng)度風(fēng)、寒、濕連續(xù)刺激（風(fēng)力5級(jí)、9～10 ℃、90%濕度，連續(xù)刺激6 h，連續(xù)6 d）。

持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型[5]：用薄剪剃除大鼠右肩部外側(cè)約6 cm × 6 cm 面積大小的毛發(fā)，固定大鼠左前肢和兩后肢，然后連接右前肢與水平搖床。水平搖床采用240 次/min 頻率、1.5 cm 振幅，6 h/d，共3 d。每次機(jī)械勞損后，將自制的裝滿(mǎn)冰塊的肩袖袋外敷于大鼠右肩部，6 h/d，共3 d，注意當(dāng)冰塊融化將盡時(shí)予更換冰袋。

手術(shù)損傷模型[6]：大鼠麻醉滿(mǎn)意后，采用彎鉗于岡上肌、斜方肌肩峰附著部和三角肌、三角肌下滑囊等處做牽拉及持續(xù)的鈍性摩擦，造成局部瘀腫淤血。

石膏制動(dòng)模型[7-8]：大鼠麻醉滿(mǎn)意后，將石膏繃帶固定右肩部后伸30°位置（肩關(guān)節(jié)內(nèi)旋位）。每天觀察石膏是否破壞或松動(dòng)。注意觀察大鼠是否可依靠左前肢爬行、站立以及自主飲食。如有大鼠石膏被破壞或松動(dòng)，此情況達(dá)不到制動(dòng)效果，需要及時(shí)重新制作并更換石膏。

空白對(duì)照組不做處理。清潔級(jí)條件正常飲食喂養(yǎng)。

1.4 取材造模完成后第1、2、4、8周取材。大鼠麻醉滿(mǎn)意后，將大鼠俯臥固定，暴露右肩關(guān)節(jié)，用薄剪在肩關(guān)節(jié)軟骨組織取材，放置4%多聚甲醛溶液中固定，留待進(jìn)行HE 染色、免疫組織化學(xué)染色。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 HE 染色法觀察肩關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)形態(tài) 將肩關(guān)節(jié)軟骨組織石蠟切片脫蠟至水。切片入Harris 蘇木素染色3～ 8 min，自來(lái)水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片入伊紅染液中染色1～3 min。脫水透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肩關(guān)節(jié)軟骨組織炎癥因子（COX-1、TNF-α），纖維化因子（TGF-β），神經(jīng)內(nèi)分泌因子（CRCP、UCHL）表達(dá) 將肩關(guān)節(jié)軟骨組織石蠟切片脫蠟至水，EDTA 抗原修復(fù)緩沖液（pH9.0）抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液室溫避光孵育25 min，3%BSA 室溫封閉30 min。分別加一抗COX-1（1∶200）、TNF-α（1∶100）、TGF-β（1∶100）、CRCP（1∶200）、UCHL（1∶500）稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗（1∶500）室溫孵育50 min，DAB 顯色，Harris 蘇木素復(fù)染3 min 左右，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，氨水返藍(lán)，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。每步驟中間要PBS 洗滌3次，每次5 min。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度（AO）值，AO=IOD/AREA，AO 值越大表示目的蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平越高。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0 軟件包處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布，采用方差齊性檢驗(yàn)，方差齊則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，自身對(duì)照均值比較，采用配對(duì)t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)比較則采用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組模型大鼠肩關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)形態(tài)比較圖1結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞逐漸減少，關(guān)節(jié)表面軟骨逐漸纖維化，手術(shù)損傷模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞于造模完成后第2 周時(shí)增多，然后逐漸減少，關(guān)節(jié)表面軟骨逐漸纖維化，石膏制動(dòng)模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞逐漸減少，于造模完成后第8 周時(shí)關(guān)節(jié)表面軟骨纖維化，軟骨層增生，未見(jiàn)明顯軟骨下層骨組織細(xì)胞。

圖1 各組模型大鼠造模完成后不同時(shí)間肩關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)形態(tài)比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of cartilage histopathological morphology of the shoulder joint at different times after completion of modelling among various model groups of rats（HE staining，×100）

2.2 各組模型大鼠肩關(guān)節(jié)組織炎癥因子（COX-1、TNF-α），纖維化因子（TGF-β），神經(jīng)內(nèi)分泌因子（CRCP、UCHL）表達(dá)比較

2.2.1 炎癥因子 圖2 結(jié)果顯示：空白對(duì)照組大鼠造模完成后第1～8 周肩關(guān)節(jié)組織COX-1 表達(dá)逐漸減少；風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組造模完成后第1～4 周COX-1 表達(dá)逐漸增加，第4 周達(dá)到最高值，至第8 周逐漸減少；石膏制動(dòng)模型組于造模完成后第1～ 2 周COX-1 表達(dá)逐漸增加達(dá)到最高，至第4 周降低，第8周逐漸增加。組間比較，風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模刺激組、石膏制動(dòng)模型組COX-1 表達(dá)最高值均高于空白對(duì)照組最高值（P＜0.05）。

圖2 各組模型大鼠造模完成后不同時(shí)間肩關(guān)節(jié)組織COX-1表達(dá)比較Figure 2 Comparison of COX-1 expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modelling among various model groups of rats

圖3結(jié)果顯示：空白對(duì)照組大鼠造模完成后第1～8 周肩關(guān)節(jié)組織TNF-α 表達(dá)逐漸增加；風(fēng)寒濕刺激模型組、石膏制動(dòng)模型組大鼠造模完成后第1～ 4 周TNF-α 表達(dá)逐漸減少，至第8 周表達(dá)增加；持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組大鼠造模完成后第2～8周TNF-α 表達(dá)逐漸減少。組間比較：風(fēng)寒濕刺激模型組、手術(shù)損傷模型組第1～2 周TNF-α 表達(dá)高于空白對(duì)照組，持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組在第1～ 4 周均高于空白對(duì)照組，石膏制動(dòng)模型組在第1～8 周均高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。

圖3 各組模型大鼠造模完成后不同時(shí)間肩關(guān)節(jié)組織TNF-α表達(dá)比較Figure 3 Comparison of TNF-α expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modelling among various model groups of rats

2.2.2 纖維化因子 圖4 結(jié)果顯示：空白對(duì)照組大鼠造模完成后第1～8 周肩關(guān)節(jié)組織TGF-β 表達(dá)逐漸減少；風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動(dòng)模型組TGF-β表達(dá)均先增加再降低，均在第2周達(dá)到最高值。組間比較，持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、石膏制動(dòng)模型組TGF-β 在第2 周時(shí)最高值大于其他各組最高值（P＜0.05）。

圖4 各組模型大鼠造模完成后不同時(shí)間肩關(guān)節(jié)組織TGF-β表達(dá)比較Figure 4 Comparison of TGF-β expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modeling among various model groups of rats

2.2.3 神經(jīng)內(nèi)分泌因子 圖5 結(jié)果顯示：空白對(duì)照組大鼠造模完成后第1～ 8 周肩關(guān)節(jié)組織CRCP表達(dá)逐漸增加；風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組大鼠造模完成后第1～2周CRCP 表達(dá)逐漸增加，第2周達(dá)到最高值，至第8周逐漸減少；石膏制動(dòng)模型組大鼠造模完成后第1～ 8 周CRCP 表達(dá)逐漸減少。組間比較，風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組CRCP 表達(dá)在第2 周最高值高于空白對(duì)照組（P＜0.05），石膏制動(dòng)模型組在第1 周最高值高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。

圖6結(jié)果顯示：空白對(duì)照組、風(fēng)寒濕刺激模型組大鼠造模完成后第1～ 2 周肩關(guān)節(jié)組織UCHL 表達(dá)先增加，至第4 周再降低，至第8 周再增加；持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動(dòng)模型組UCHL表達(dá)均先增加再減少，持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組在造模完成后第2 周達(dá)到最高值，石膏制動(dòng)模型組在第4 周達(dá)到最高值。組間比較，風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動(dòng)模型組大鼠在造模完成后第1、2、4、8 周UCHL表達(dá)均高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。

圖6 各組模型大鼠造模完成后不同時(shí)間肩關(guān)節(jié)組織UCHL表達(dá)比較Figure 6 Comparison of UCHL expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modeling among various model groups of rats

3 討論

肩周炎主要發(fā)病階段分為急性期、慢性期和恢復(fù)期，早期以關(guān)節(jié)囊炎癥為主，慢性期以纖維化為主，恢復(fù)期纖維化自發(fā)消退。本研究中肩關(guān)節(jié)組織HE 染色結(jié)果顯示：風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞逐漸減少，關(guān)節(jié)表面軟骨逐漸纖維化；手術(shù)損傷模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞于造模完成后第2周時(shí)增多，然后逐漸減少，關(guān)節(jié)表面軟骨逐漸纖維化；石膏制動(dòng)模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞逐漸減少，造模完成后第8 周時(shí)關(guān)節(jié)表面軟骨纖維化，未見(jiàn)明顯軟骨細(xì)胞。表明這4種方法構(gòu)建的肩周炎動(dòng)物模型均可見(jiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞減少、表面纖維化。

肩周炎是炎癥和纖維化的過(guò)程，早期滑膜增生、血管數(shù)量增多，與無(wú)菌性炎癥、纖維化過(guò)程密切相關(guān)。COX-1 主要參與炎癥和膠原分解代謝過(guò)程。TNF-α 為促炎性反應(yīng)細(xì)胞因子[9]。有研究[10-11]表明，肩峰下滑囊、關(guān)節(jié)囊中COX-1、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)增加與肩關(guān)節(jié)的腫痛癥狀以及炎癥轉(zhuǎn)化為纖維化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加可誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致肩周炎的非自然組織修復(fù)和纖維化。本研究結(jié)果顯示：風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動(dòng)模型組COX-1 表達(dá)在造模完成后第1～ 8 周最高值均高于空白對(duì)照組最高值。風(fēng)寒濕刺激模型組、手術(shù)損傷模型組TNF-α 表達(dá)在造模完成后第1～2 周高于空白對(duì)照組，持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組TNF-α表達(dá)在造模完成后第1～ 4 周均高于空白對(duì)照組，石膏制動(dòng)模型組TNF-α表達(dá)在造模完成后第1～8周均高于空白對(duì)照組。故石膏制動(dòng)模型在炎癥因子表達(dá)穩(wěn)定性方面優(yōu)于風(fēng)寒濕刺激模型、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型、手術(shù)損傷模型。

TGF-β 作為生長(zhǎng)與分化因子可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、發(fā)育、炎癥、修復(fù)和免疫等生物學(xué)過(guò)程，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白、纖維黏連蛋白及蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)，還可促進(jìn)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，可直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原，并使組織間上皮細(xì)胞相互識(shí)別或通過(guò)促使巨噬細(xì)胞分泌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成和分泌膠原纖維，而當(dāng)膠原纖維過(guò)度沉積時(shí)就會(huì)導(dǎo)致瘢痕組織和粘連的形成[12-13]。Redeo 等[14]研究表明，TGF-β 對(duì)肩周炎患者滑膜增生和關(guān)節(jié)纖維化有重要作用。本研究結(jié)果顯示：風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動(dòng)模型組TGF-β 表達(dá)均先增加再降低，均在造模完成后第2周達(dá)到最高值，持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、石膏制動(dòng)模型組TGF-β表達(dá)在造模完成后第2周時(shí)最高值大于其他各組最高值。故持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型、石膏制動(dòng)模型在肩關(guān)節(jié)纖維化相關(guān)因子穩(wěn)定表達(dá)方面優(yōu)于風(fēng)寒濕刺激模型、手術(shù)損傷模型。

有研究[15]表明，神經(jīng)和血管因素與肩周炎的發(fā)病過(guò)程亦相關(guān)，CGRP 分布在血管周?chē)虺衫w維細(xì)胞中，其表達(dá)增加可造成血管增多、滑膜囊增厚和攣縮。CGRP 作為促炎癥性神經(jīng)肽，在疼痛感覺(jué)傳遞中起重要作用[16]。UCHL 為泛素C 末端水解酶在神經(jīng)元中高表達(dá)，參與調(diào)解蛋白的聚集并維持其穩(wěn)定，UCHL 缺失可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示：風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組CRCP 表達(dá)在造模完成后第2周最高值高于空白對(duì)照組，石膏制動(dòng)模型組在造模完成后第1 周最高值高于空白對(duì)照組。風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動(dòng)模型組在造模完成后1～ 8 周UCHL 表達(dá)均高于空白對(duì)照組。表明手術(shù)損傷模型和石膏制動(dòng)模型在肩關(guān)節(jié)致痛因子表達(dá)方面優(yōu)于風(fēng)寒濕刺激模型、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型。

綜上所述，針對(duì)肩周炎的4種SD大鼠模型——風(fēng)寒濕刺激模型、持續(xù)機(jī)械勞損加冰敷模型、手術(shù)損傷模型、石膏制動(dòng)模型，研究者可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)研究目的進(jìn)行選擇。