劉婉婷 胡子毅

（1.江西中醫(yī)藥大學研究生院，江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中醫(yī)經典科，江西 南昌 330006）

痔瘡臨床表現(xiàn)為各種程度便血、肛門腫大、肛門疼痛等癥狀，且易重復發(fā)?。?］。2013 年—2014 年底，江維等［2］調查顯示，城市居民肛腸疾病發(fā)病率最高的是痔，占肛腸科發(fā)病率98.92%。據俞婷等［3］2017 年—2018 年于上海市金山醫(yī)院肛腸科調查，采用隨機抽樣以及調查問卷形式，共回收的1477 份合格調查問卷，其中有1080 份顯示被調查對象患有痔病，痔瘡患病率73.12%。

目前，西醫(yī)學對痔瘡病因病機的闡述尚無統(tǒng)一標準，大家普遍認可的機制可能為肛墊下移、血管增生、痔病退變以及靜脈曲張等［4-6］。中醫(yī)學則認為痔瘡的病因病機是外感六淫、過饑過飽或饑飽無常，致氣血虧少，使局部氣血結滯、筋脈糾結逆亂［4］?；苯峭璩鲎浴短交菝窈蛣┚址健?，具有清腸疏風、祛濕止癢、涼血消腫之功效［7］。文章運用網絡藥理學方法探索槐角丸治療痔瘡的作用機制，為槐角丸的臨床應用提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 槐角丸活性成分的獲取及靶點的篩選在中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫中，以槐角、地榆、當歸、防風、枳殼、黃芩為關鍵詞，限制口服吸收利用度（OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18，對槐角丸的主要成分進行檢測。然后再利用Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）檢索并設定人源（Human），進一步將獲取的蛋白質靶點信息轉換為相應的基因名稱，從而獲得了與活性成分相對應的蛋白質靶點。

1.2 痔瘡靶點篩選以“Hemorrhoids”為關鍵詞，從GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫和Drug-Bank（https：//go.drugbank.com）數據庫中獲取痔瘡的基因符號（Gene Symbol），并將結果保存。

1.3 網絡構建與分析將獲取到的藥物靶點與疾病靶點取交集，并導入String 數據庫（https：//cn.string-db.org），構建PPI網絡。設定物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設為“medium confidence”（0.400），其余參數不變。用Cytoscape 3.9.1 軟件中的CytoHubba 插件，依據馬修斯相關系數（MCC）得分，選取得分排名前10位的基因作為核心（Hub）基因。

1.4 京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集通路分析與基因本體論（GO）分類富集分析利用仙桃學術（https：//www.xiantaozi.com/）在線網站中的高級生信工具，對藥物與疾病的交集基因進行富集分析。

2 結果

2.1 活性成分篩選及靶點篩選使用TCMSP 數據庫，槐角丸共獲取到58 個活性成分，預測靶點1270 個。見表1。預測靶點去重后，獲得247個靶點。

表1 槐角丸“中藥-活性成分-預測靶點”信息

2.2 疾病靶點篩選結果使用GeneCards 數據庫檢索，獲得痔瘡疾病基因577 個，使用DrugBank 數據庫檢索，獲得痔瘡疾病基因132 個。剔除重復基因后，最終得到641個痔瘡疾病基因。

2.3 網絡構建與結果分析將所有得到的藥物靶點與疾病靶點進行映射，得到54個共有靶點。將交集靶點導入String 數據庫構建PPI 網絡。見圖1。MCC 得分從高到低依次是白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、表皮生長因子受體（EGFR）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、纖連蛋白1（FN1）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、趨化因子8（CXCL8）、白細胞介素-1β（IL-1β）。

圖1 槐角丸治療痔瘡的PPI網絡圖

2.4 KEGG富集通路分析與GO分類富集分析KEGG通路富集分析找到123 條信號通路，主要包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路、核因子κB（NF-κB）信號通路、白細胞介素-17（IL-17）信號通路等。剔除與疾病不相關的通路，按照富集基因的個數從多到少依次排序，選取前20條作圖。見圖2。

圖2 槐角丸治療痔瘡的KEGG通路富集分析柱狀圖

GO 富集分析共有2308 條，包括生物過程（BP）2179條，細胞組成（CC）35條和分子功能（MF）94條。按照其基因富集個數從高到低依次排序，各選取前10條作圖。見圖3。

圖3 槐角丸治療痔瘡的GO富集分析柱狀圖

涉及BP 的有活性氧代謝過程（18 個）、脂多糖（16個）、活性氧代謝過程的調節(jié)（14 個）、細胞外結構組織（14個）、上皮細胞增殖（14個）、氧化應激反應（14個）等；涉及CC 的有膜筏（11 個）、膜微區(qū)（11 個）、膜區(qū)域（11 個）、內質網腔（7 個）、質膜筏（5 個）、線粒體外膜（5個）、細胞器外膜（5個）等；涉及MF的主要有受體配體活性（9個）、細胞因子活性（8個）、肽鏈內切酶活性（8 個）、熱休克蛋白結合（7 個）、蛋白酶結合（7個）、血紅素結合（7個）等。

3 討論

槐角丸主要應用于肛腸科疾病，且療效確切。此方槐角用量最重，研究［8，9］表明，槐角黃酮中所含的槲皮素、黃芩苷、山柰酚等多種小分子物質還能幫助降低毛細血管系統(tǒng)的通透性和脆性，增加穩(wěn)定性，具有明顯的抗炎、抗腸道潰瘍、止血和凝血等功能。地榆味苦性寒，藥理實驗證明，地榆具有明顯的止血［10］、抗炎消腫［11］、改善血液系統(tǒng)、抗腫瘤［12］等作用。黃芩能增強槐角的清肝涼血的功效，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等作用［13］。雖然下血是因為熱迫血液下行，但也有氣機下陷的原因。因而稍佐有升發(fā)作用的防風、枳殼升舉氣機。藥理實驗［14］證明，枳殼能夠增強腸胃收縮力、降低血管脆性，能夠達到壓迫止血的目的。當歸補血活血、潤腸通便。馬艷春等［15］研究證實，當歸具有抗炎、抗腫瘤、調節(jié)造血功能等效果。

根據MCC 算法篩選出得分高的前10 個關鍵靶點，分值從高到低依次是IL-6、TNF、VEGFA、PTGS2、EGFR、MMP9、FN1、MMP2、CXCL8、IL-1β。其 中IL-6 和IL-1β 屬白細胞介素，二者均可與TNF 協(xié)同誘導VEGF 使血管生成活性和血管通透性增加［16］。CXCL8 是α 型趨化因子，在未受刺激的細胞中幾乎檢測不到CXCL8。CXCL8-趨化因子受體（CXCR）1/2 軸還通過NF-κB 通路誘導內皮細胞中VEGF 的轉錄來刺激VEGFR2 活化，CXCL8-CXCR2 軸還可反式激活EGFR，從而介導毛細血管形成［17］。實驗研究［18］表明，痔瘡組織血管內皮細胞內VEGFA表達明顯高于正常組織血管內皮細胞。楊奕婷等［19］研究發(fā)現(xiàn)，痔瘡組織的新血管生成可能與VEGF 和堿性成纖維細胞生長因子（FGF-2）的過度表達有關，且會隨著病情的加重而升高。PTGS2是非甾體抗炎藥（NSAID）的靶標，當機體發(fā)生炎癥時，PTGS2 會大量合成，從而促使前列腺素的合成，從而介導對生理壓力（如感染和炎癥）的反應［20，21］。EGFR 分子及其相關信號通路可以直接對各種表皮細胞生長、增殖及分裂過程和細胞誘導及分化凋亡過程等細胞生理活性反應發(fā)揮重要的作用。MMP9、MMP2均屬于基質金屬蛋白酶，馮大勇等［22］研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常組織，痔組織中的MMP-9 的表達率更高，MMP-2 則無較大差異。并且，在伴有血栓形成等并發(fā)癥的痔組織［23］中MMP-9表達明顯增高。FN1 參與細胞黏附、細胞運動、調理作用、傷口愈合和細胞形狀的維持［24］。

本項研究主要通過對KEGG 通路進行富集和分析，一共找到了123 條通路。數據研究［25］表明，NF-κB 誘導激酶在腸上皮細胞中由IL-17、TNF-α和IL-1β觸發(fā)的NF-κB 信號級聯(lián)中充當共同介質。此外，有研究［26］顯示成人神經干細胞通過TNF-α 受體信號傳導被系統(tǒng)性炎癥警報。PI3K-Akt 信號通路是一個從細胞膜向細胞核傳導的通路，活化的PKB（Akt）可直接作用于前體凋亡蛋白，進而阻止細胞死亡、促進細胞存活［27］。汪元等［28］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導因子-1（HIF-1）可通過激活VEGF轉錄，進而對PI3K-Akt進行調節(jié)，從而促進大鼠滑膜血管的新生。曹立睿［29］研究表明，山柰酚可以通過作用于HIF-1 信號通路、PI3K-Akt 信息通路等來減少細胞氧化破壞，并控制炎癥反應。

綜上所述，槐角丸可能是通過作用于IL-6、MMP2、VEGFA 等54 個靶點，抑制PI3K-Akt、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，從而起到清熱涼血、消腫止痛的功效。本研究主要依賴于網絡，且目前國內對于槐角丸治療痔瘡的研究較少，仍需進一步實驗驗證。