馬斐越 李 慧 劉雪梅 臺福敏 邵寧生 高 波 * 鄭曉飛 *

（1）軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京市放射生物學(xué)重點實驗室，北京 100850；2）軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850）

脫氧核酶（DNAzyme，Dz）是具有催化活性的單鏈DNA，對DNA和RNA等分子具有高效催化活性和結(jié)構(gòu)識別能力［1］。近年來，基于脫氧核酶的應(yīng)用研究取得巨大進(jìn)展，脫氧核酶可設(shè)計為生物傳感器、DNA或RNA裂解和連接酶、磷酸化和去磷酸化酶等功能分子用作多種治療和診斷工具。其中10-23型脫氧核酶由一個催化中心和兩個靶基因結(jié)合臂組成，通過結(jié)合臂和靶基因mRNA的互補(bǔ)配對，催化特定部位的切割反應(yīng)，進(jìn)而抑制基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，具有基因沉默功能［2］。作為抗病毒、抗腫瘤等多種疾病治療的潛在分子，脫氧核酶具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易于制備、免疫原性更低等優(yōu)點。但由于其具有負(fù)電荷和親水性，不易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致其催化切割效率嚴(yán)重降低，限制了在臨床治療方面的應(yīng)用。因此，需要建立提高脫氧核酶遞送的新技術(shù)方法。

適配體（aptamer）作為一種新型靶向分子在藥物分子遞送中的應(yīng)用越來越廣泛，適配體由一段單鏈寡核苷酸（DNA或RNA）序列組成，通過鏈內(nèi)互補(bǔ)堿基間的配對以及靜電、氫鍵作用與靶分子緊密結(jié)合，具有極高的靶分子親和力和識別能力［3］。已有研究證實，適配體與具有基因沉默作用的 siRNA（small interfering RNA，siRNA）、shRNA（short interfering RNA，shRNA）及miRNA（microRNA，miRNA）偶聯(lián)，在細(xì)胞中發(fā)揮作用［4-6］。適配體與G-四鏈體脫氧核酶偶聯(lián)也可以作為生物傳感器用于多種分子的檢測，比如ATP［7］、干擾素［8］、凝血酶［9］等。有研究將細(xì)胞膜核仁素適配體NCL-APT（nucleolin-aptamer，NCL-APT）和靶向生存素脫氧核酶Sur_Dz（survivin DNAzyme，Sur_Dz）偶聯(lián)，證明該偶聯(lián)物對癌細(xì)胞具有靶向殺傷作用［10］。也有研究報道了一種被封閉的、刺激響應(yīng)的適配體/脫氧核糖核酸酶索烴納米結(jié)構(gòu)，索烴納米結(jié)構(gòu)中的適配體片段與腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的MUC1蛋白結(jié)合，可以促進(jìn)靶向遞送納米結(jié)構(gòu)到細(xì)胞內(nèi)，以實現(xiàn)高度特異性的基因沉默［11］?？梢钥闯?，選擇靶向細(xì)胞膜蛋白質(zhì)特異、高效的適配體與脫氧核酶偶聯(lián)，通過適配體的跨膜遞送作用，有助于解決脫氧核酶不易進(jìn)入細(xì)胞的問題。

VASN蛋白（vasorin）是一種典型的I型膜蛋白，在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常肝細(xì)胞中低表達(dá)，可以作為一種新的肝癌生物標(biāo)志物［12］。我們前期利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)篩選得到VASN蛋白的特異核酸適配體V4-2，并發(fā)現(xiàn)其具有跨細(xì)胞膜遞送的潛能，因此V4-2序列可作為候選遞送介質(zhì)［13］。

端粒酶在多種腫瘤組織中高表達(dá)，直接抑制端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄活性是治療癌癥的有效手段［14］。在端粒酶的幾種組分中，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞的特異性靶點［15］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，10-23型脫氧核酶能夠靶向降解hTERT mRNA，顯著降低人肺腺癌細(xì)胞A549端粒酶活性［16］。因此本研究將核酸適配體V4-2與端粒酶10-23型脫氧核酶Dz連接，即脫氧核酶Dz的5'端與V4-2的3'端連接形成偶聯(lián)物V4-2-Dz，檢測分析該偶聯(lián)物的切割活性和結(jié)合肝癌細(xì)胞的特異性，并驗證其對肝癌細(xì)胞的影響，以期為脫氧核酶的遞送及應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞HepG2和人正常肝細(xì)胞L02由本實驗室保存；DMEM高糖培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum）購于PAN-biotech公司；注射用青霉素和注射用硫酸鏈霉素購于華北制藥股份有限公司；PCR酶購于TOYOBO公司；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR酶購于ThermoFisher公司；RNA提取試劑Trizol購于Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Genstar公司；瓊脂糖膠回試劑盒購于Promega公司；StarStain Red核酸染料購于Genstar公司；MTT檢測試劑盒購自北仁化學(xué)科技（北京）有限公司。PCR引物、Dz、V4-2、V4-2-Dz、5'端標(biāo)記熒光素（FAM）的Dz、V4-2、V4-2-Dz合成均由上海生工生物工程有限公司完成，序列信息如表1所示。

Table 1 DNAzyme，aptamer and primer sequences

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2和L02細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化傳代。選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 體外轉(zhuǎn)錄合成端粒酶催化亞基hTERT RNA片段

按Trizol法提取HepG2細(xì)胞總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以脫氧核酶Dz的切割位點為中心，設(shè)計hTERT上下游PCR引物hTERT F1和hTERT R1，上游引物5'端連接T7啟動子序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增合成hTERT DNA片段，回收擴(kuò)增產(chǎn)物。以此PCR產(chǎn)物為模板，利用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，純化回收RNA，獲得端粒酶催化亞基hTERT RNA片段。

1.2.3 分析脫氧核酶和偶聯(lián)物對底物RNA的體外切割

將上述體外轉(zhuǎn)錄得到的hTERT RNA與脫氧核酶Dz、偶聯(lián)物V4-2-Dz孵育進(jìn)行底物切割實驗。取 5 μl 100 nmol/L Dz或 V4-2-Dz、5 μl 10 μmol/L hTERT RNA與10 μl 2×切割緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl pH7.5、10 mmol/L MgCl2、150 mmol/L NaCl、0.01% SDS）混勻，37℃分別溫浴 10、30、60、120、180 min，終止反應(yīng)后采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離切割產(chǎn)物，核酸染料染色觀察Dz、V4-2-Dz對hTERT RNA的切割作用。采用Image J軟件分析條帶灰度值，切割百分比=（實驗組底物條帶灰度值/對照組底物條帶灰度值）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測脫氧核酶與細(xì)胞結(jié)合

將FAM標(biāo)記的Dz、V4-2、V4-2-Dz溶解于DEPC水中，加入孵育緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2，1 g/L ytRNA），終濃度為 5 μmol/L，再與HepG2細(xì)胞或L02細(xì)胞于37℃孵育60 min，2 000 r/min 離心，棄上清，加入 350 μl 1×PBS-1 mmol/L MgCl2重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度值，利用Flowjo軟件分析其與細(xì)胞的結(jié)合情況。

1.2.5 激光共聚焦檢測脫氧核酶與細(xì)胞的結(jié)合

將FAM標(biāo)記的Dz、V4-2、V4-2-Dz溶解于DEPC水中，加入孵育緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2，1 g/L ytRNA），終濃度為 5 μmol/L，與接種在共聚焦小皿中的HepG2細(xì)胞于37℃共同孵育60 min，吸棄上清后，用1×PBS-1 mmol/L MgCl2清洗2次后，加入100 μl 1×PBS-1 mmol/L MgCl2，共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.2.6 實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測mRNA水平變化

將HepG2細(xì)胞按2.5×104細(xì)胞/孔接種于48孔板，待細(xì)胞融合至70%左右，在無脂質(zhì)體無血清條件下轉(zhuǎn)染脫氧核酶，終濃度為5 μmol/L，6 h后加入10%血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，提取各孔細(xì)胞RNA，進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR，β-actin作為內(nèi)參比較細(xì)胞中hTERT基因的表達(dá)。用2-△△Ct方法分析mRNA相對表達(dá)量。

1.2.7 MTT方法檢測細(xì)胞增殖

將HepG2細(xì)胞按照8×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，在無血清條件下分別將終濃度為12.5 μmol/L的Dz、V4-2、V4-2-Dz與細(xì)胞共同孵育，6 h后加入1%血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于18、36、54、72 h加入MTT檢測，在波長450 nm讀吸光度（A）值。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用Oneway ANOVA檢驗，以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VASN核酸適配體與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶脫氧核酶偶聯(lián)物（V4-2-Dz）二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Mfold網(wǎng)站分析V4-2和連接hTERT脫氧核酶偶聯(lián)物V4-2-Dz序列的二級結(jié)構(gòu)［17］，條件設(shè)置為：溫度37℃，Na+濃度150 mmol/L，Mg2+濃度1 mmol/L。圖1a顯示V4-2主要的結(jié)構(gòu)為莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，圖1b為V4-2-Dz的結(jié)構(gòu)，其中1～80 bp為V4-2序列，81～113為Dz序列，V4-2序列的結(jié)構(gòu)與圖1a一致，表明連接脫氧核酶后沒有影響V4-2的結(jié)構(gòu)。V4-2和V4-2-Dz的吉布斯自由能?G分別為-3.75 kJ/mol、-4.51 kJ/mol，說明其結(jié)構(gòu)均較為穩(wěn)定。

2.2 Dz和V4-2-Dz對底物RNA的體外切割活性

體外合成hTERT RNA片段后，將終濃度為25 nmol/L的Dz和V4-2-Dz與終濃度為2.5 μmol/L的hTERT RNA孵育不同時間，檢測V4-2-Dz的底物切割活性。隨著反應(yīng)時間的增加，Dz和V4-2-Dz對底物的切割量逐漸升高，與Dz相比，V4-2-Dz的切割效率有所降低，但仍具有較強(qiáng)的切割活性（圖2）。

2.3 V4-2-Dz與肝癌細(xì)胞結(jié)合

由于VASN在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，在正常肝細(xì)胞中低表達(dá)。因此，VASN的適配體V4-2能夠與肝癌細(xì)胞發(fā)生特異結(jié)合。將Dz、V4-2、V4-2-Dz序列的5'端標(biāo)記FAM熒光，與肝癌細(xì)胞HepG2、正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞孵育，通過流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦檢測連接Dz后V4-2-Dz是否與肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合。

Fig.1 Mfold predicts the secondary structure of V4-2 and V4-2-Dz

Fig.2 hTERT RNA was cleaved by Dz and V4-2-Dz in vitro

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖3所示，HepG2細(xì)胞與FAM標(biāo)記的V4-2、V4-2-Dz孵育后與對照組（control，Con）相比，熒光強(qiáng)度峰值均發(fā)生偏移，但是與Dz孵育后未發(fā)生偏移（圖3a），L02與三條核苷酸序列孵育后峰值均未發(fā)生偏移（圖3b），說明V4-2能夠結(jié)合HepG2，并且V4-2-Dz與V4-2比較，結(jié)合能力未發(fā)生改變。

Fig.3 Binding activity of V4-2-Dz to hepatocellular carcinoma cells detected by flow cytometry

激光共聚焦檢測結(jié)果如圖4所示，HepG2細(xì)胞與FAM標(biāo)記的V4-2、V4-2-Dz孵育后與Con、Dz組相比，觀察到明顯的熒光強(qiáng)度，說明V4-2能夠結(jié)合HepG2細(xì)胞，并且V4-2-Dz與V4-2比較，結(jié)合能力未發(fā)生明顯變化。

Fig.4 Binding activity of V4-2-Dz to hepatocellular carcinoma cells detected by laser confocal

2.4 V4-2-Dz降低端粒酶催化亞基mRNA表達(dá)水平

在未加脂質(zhì)體的條件下，向HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的V4-2-Dz共孵育，檢測其對hTERT mRNA表達(dá)的影響。隨著V4-2-Dz濃度的增加，HepG2細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)逐漸降低（圖5a）。在分別加入相同濃度的Dz、V4-2-Dz以及V4-2的HepG2細(xì)胞中，與Con相比，加入Dz和V4-2-Dz對hTERT mRNA水平都具有降低效果，但V4-2-Dz的效果更為顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖5b），說明連接V4-2后可以增強(qiáng)Dz的工作能力。

Fig.5 The level of hTERT mRNA expression in HepG2 cells after incubation with V4-2-Dz

2.5 V4-2-Dz抑制HepG2細(xì)胞增殖

將Dz、V4-2、V4-2-Dz分別加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中，檢測其對HepG2細(xì)胞增殖的影響。與Con相比，V4-2-Dz抑制細(xì)胞增殖的能力有顯著性差異（P<0.01）（圖6）。

Fig.6 Detection of HepG2 cell proliferation after incubation with Dz,V4-2 and V4-2-Dz

3 討論

本研究將VASN蛋白的核酸適配體V4-2與靶向hTERT mRNA的脫氧核酶Dz連接，通過Mfold預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)表明，在V4-2-Dz偶聯(lián)物中對V4-2的結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生明顯的影響，對Dz左結(jié)合臂可能存在堿基互補(bǔ)配對情況，但仍然以獨立形式存在。盡管二級結(jié)構(gòu)預(yù)測存在一定不準(zhǔn)確性，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果間接證明V4-2-Dz仍然具有適配體和脫氧核酶的功能結(jié)構(gòu)。通過檢測V4-2-Dz的體外切割活性發(fā)現(xiàn)，V4-2-Dz仍具有較強(qiáng)的切割活性但與Dz相比活性有所降低，可能由于左端結(jié)合臂過長形成空間位阻造成的。流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦實驗結(jié)果均顯示V4-2-Dz與肝癌細(xì)胞HepG2結(jié)合的特異性未發(fā)生明顯改變，表明Dz并未減弱V4-2對細(xì)胞結(jié)合的能力，說明V4-2具有穩(wěn)定的功能結(jié)構(gòu)。因此，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可靶向降解hTERT mRNA并抑制細(xì)胞增殖。

目前開發(fā)遞送脫氧核酶的方法主要分為兩種，一種是通過納米顆粒將脫氧核酶遞送至細(xì)胞，比如膠體金納米粒子、殼聚糖納米粒子等［18-19］，另一種則是利用陽離子分子，例如陽離子聚合物、脂質(zhì)體等［20-21］，與負(fù)電荷的脫氧核酶通過靜電相互作用結(jié)合，通過膜融合進(jìn)入細(xì)胞。但是這些方法仍存在較大缺陷，比如各種材料制備較為繁瑣，并且在高濃度下具有細(xì)胞毒性。適配體可以作為有效的遞送介質(zhì)使各種類型的寡核苷酸在細(xì)胞中發(fā)揮作用，為脫氧核酶與適配體的結(jié)合提供了良好的基礎(chǔ)。上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是一種I型跨膜糖蛋白，在多種上皮來源腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)［22］，將靶向EpCAM的適配體與靶向Polo樣激酶1（polo-like kinase 1，PLK1）的siRNA共價連接，其選擇性進(jìn)入表達(dá)EpCAM的乳腺癌細(xì)胞，并使PLK1表達(dá)降低［23］。受體酪氨酸激酶（AXL areceptor tyrosine kinase，AXL）同樣在多種癌癥細(xì)胞中高表達(dá)，將AXL的適配體GL21.T與抑癌基因miR-148b連接，特異抑制小鼠AXL陽性腫瘤生長［24］。適配體作為靶向分子在藥物分子遞送中的研究日益受到重視。

本研究為肝癌的治療和脫氧核酶的有效遞送提供了一種可行方案。VASN蛋白的適配體V4-2能夠作為一種遞送介質(zhì)與各種具有沉默作用的寡核苷酸（DNazyme、siRNA、ASO、miRNA等）連接，靶向肝癌細(xì)胞發(fā)揮作用。靶向hTERT的脫氧核酶Dz同樣能夠和其他癌細(xì)胞特異膜蛋白的核酸適配體連接，靶向各種類型的癌細(xì)胞發(fā)揮作用，為癌癥的臨床治療提供了基礎(chǔ)。另外，適配體與脫氧核酶的連接方向可能影響脫氧核酶的活性［25］，后續(xù)可檢測在脫氧核酶的3'或5'端連接適配體后是否切割活性是否一致，也可在適配體與脫氧核酶的連接位點加入接頭序列，即若干個不同堿基，確保適配體與脫氧核酶的功能結(jié)構(gòu)不受影響。基于適配體和脫氧核酶偶聯(lián)物方法未來仍存在優(yōu)化空間。

4 結(jié)論

VASN蛋白的核酸適配體與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基的脫氧核酶偶聯(lián)物V4-2-Dz具有靶向肝癌細(xì)胞遞送和脫氧核酶底物切割活性，基于細(xì)胞靶向和穿膜遞送的適配體V4-2與脫氧核酶的偶聯(lián)物可作為一種新型生物制劑用于腫瘤藥物研究。