馬斐越 李 慧 劉雪梅 臺福敏 邵寧生 高 波 * 鄭曉飛 *
(1)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京市放射生物學(xué)重點實驗室,北京 100850;2)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所,北京 100850)
脫氧核酶(DNAzyme,Dz)是具有催化活性的單鏈DNA,對DNA和RNA等分子具有高效催化活性和結(jié)構(gòu)識別能力[1]。近年來,基于脫氧核酶的應(yīng)用研究取得巨大進(jìn)展,脫氧核酶可設(shè)計為生物傳感器、DNA或RNA裂解和連接酶、磷酸化和去磷酸化酶等功能分子用作多種治療和診斷工具。其中10-23型脫氧核酶由一個催化中心和兩個靶基因結(jié)合臂組成,通過結(jié)合臂和靶基因mRNA的互補(bǔ)配對,催化特定部位的切割反應(yīng),進(jìn)而抑制基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá),具有基因沉默功能[2]。作為抗病毒、抗腫瘤等多種疾病治療的潛在分子,脫氧核酶具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易于制備、免疫原性更低等優(yōu)點。但由于其具有負(fù)電荷和親水性,不易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,導(dǎo)致其催化切割效率嚴(yán)重降低,限制了在臨床治療方面的應(yīng)用。因此,需要建立提高脫氧核酶遞送的新技術(shù)方法。
適配體(aptamer)作為一種新型靶向分子在藥物分子遞送中的應(yīng)用越來越廣泛,適配體由一段單鏈寡核苷酸(DNA或RNA)序列組成,通過鏈內(nèi)互補(bǔ)堿基間的配對以及靜電、氫鍵作用與靶分子緊密結(jié)合,具有極高的靶分子親和力和識別能力[3]。已有研究證實,適配體與具有基因沉默作用的 siRNA(small interfering RNA,siRNA)、shRNA(short interfering RNA,shRNA)及miRNA(microRNA,miRNA)偶聯(lián),在細(xì)胞中發(fā)揮作用[4-6]。適配體與G-四鏈體脫氧核酶偶聯(lián)也可以作為生物傳感器用于多種分子的檢測,比如ATP[7]、干擾素[8]、凝血酶[9]等。有研究將細(xì)胞膜核仁素適配體NCL-APT(nucleolin-aptamer,NCL-APT)和靶向生存素脫氧核酶Sur_Dz(survivin DNAzyme,Sur_Dz)偶聯(lián),證明該偶聯(lián)物對癌細(xì)胞具有靶向殺傷作用[10]。也有研究報道了一種被封閉的、刺激響應(yīng)的適配體/脫氧核糖核酸酶索烴納米結(jié)構(gòu),索烴納米結(jié)構(gòu)中的適配體片段與腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的MUC1蛋白結(jié)合,可以促進(jìn)靶向遞送納米結(jié)構(gòu)到細(xì)胞內(nèi),以實現(xiàn)高度特異性的基因沉默[11]??梢钥闯?,選擇靶向細(xì)胞膜蛋白質(zhì)特異、高效的適配體與脫氧核酶偶聯(lián),通過適配體的跨膜遞送作用,有助于解決脫氧核酶不易進(jìn)入細(xì)胞的問題。
VASN蛋白(vasorin)是一種典型的I型膜蛋白,在肝癌細(xì)胞中高表達(dá),而在正常肝細(xì)胞中低表達(dá),可以作為一種新的肝癌生物標(biāo)志物[12]。我們前期利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)篩選得到VASN蛋白的特異核酸適配體V4-2,并發(fā)現(xiàn)其具有跨細(xì)胞膜遞送的潛能,因此V4-2序列可作為候選遞送介質(zhì)[13]。
端粒酶在多種腫瘤組織中高表達(dá),直接抑制端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄活性是治療癌癥的有效手段[14]。在端粒酶的幾種組分中,端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá),是腫瘤細(xì)胞的特異性靶點[15]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),10-23型脫氧核酶能夠靶向降解hTERT mRNA,顯著降低人肺腺癌細(xì)胞A549端粒酶活性[16]。因此本研究將核酸適配體V4-2與端粒酶10-23型脫氧核酶Dz連接,即脫氧核酶Dz的5'端與V4-2的3'端連接形成偶聯(lián)物V4-2-Dz,檢測分析該偶聯(lián)物的切割活性和結(jié)合肝癌細(xì)胞的特異性,并驗證其對肝癌細(xì)胞的影響,以期為脫氧核酶的遞送及應(yīng)用提供新的思路。
人肝癌細(xì)胞HepG2和人正常肝細(xì)胞L02由本實驗室保存;DMEM高糖培養(yǎng)基購于Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum)購于PAN-biotech公司;注射用青霉素和注射用硫酸鏈霉素購于華北制藥股份有限公司;PCR酶購于TOYOBO公司;T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR酶購于ThermoFisher公司;RNA提取試劑Trizol購于Sigma公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Genstar公司;瓊脂糖膠回試劑盒購于Promega公司;StarStain Red核酸染料購于Genstar公司;MTT檢測試劑盒購自北仁化學(xué)科技(北京)有限公司。PCR引物、Dz、V4-2、V4-2-Dz、5'端標(biāo)記熒光素(FAM)的Dz、V4-2、V4-2-Dz合成均由上海生工生物工程有限公司完成,序列信息如表1所示。
Table 1 DNAzyme,aptamer and primer sequences
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
HepG2和L02細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用胰蛋白酶消化傳代。選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。
1.2.2 體外轉(zhuǎn)錄合成端粒酶催化亞基hTERT RNA片段
按Trizol法提取HepG2細(xì)胞總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以脫氧核酶Dz的切割位點為中心,設(shè)計hTERT上下游PCR引物hTERT F1和hTERT R1,上游引物5'端連接T7啟動子序列,經(jīng)PCR擴(kuò)增合成hTERT DNA片段,回收擴(kuò)增產(chǎn)物。以此PCR產(chǎn)物為模板,利用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,純化回收RNA,獲得端粒酶催化亞基hTERT RNA片段。
1.2.3 分析脫氧核酶和偶聯(lián)物對底物RNA的體外切割
將上述體外轉(zhuǎn)錄得到的hTERT RNA與脫氧核酶Dz、偶聯(lián)物V4-2-Dz孵育進(jìn)行底物切割實驗。取 5 μl 100 nmol/L Dz或 V4-2-Dz、5 μl 10 μmol/L hTERT RNA與10 μl 2×切割緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH7.5、10 mmol/L MgCl2、150 mmol/L NaCl、0.01% SDS)混勻,37℃分別溫浴 10、30、60、120、180 min,終止反應(yīng)后采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離切割產(chǎn)物,核酸染料染色觀察Dz、V4-2-Dz對hTERT RNA的切割作用。采用Image J軟件分析條帶灰度值,切割百分比=(實驗組底物條帶灰度值/對照組底物條帶灰度值)×100%。
1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測脫氧核酶與細(xì)胞結(jié)合
將FAM標(biāo)記的Dz、V4-2、V4-2-Dz溶解于DEPC水中,加入孵育緩沖液(1×PBS,1 mmol/L MgCl2,1 g/L ytRNA),終濃度為 5 μmol/L,再與HepG2細(xì)胞或L02細(xì)胞于37℃孵育60 min,2 000 r/min 離心,棄上清,加入 350 μl 1×PBS-1 mmol/L MgCl2重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度值,利用Flowjo軟件分析其與細(xì)胞的結(jié)合情況。
1.2.5 激光共聚焦檢測脫氧核酶與細(xì)胞的結(jié)合
將FAM標(biāo)記的Dz、V4-2、V4-2-Dz溶解于DEPC水中,加入孵育緩沖液(1×PBS,1 mmol/L MgCl2,1 g/L ytRNA),終濃度為 5 μmol/L,與接種在共聚焦小皿中的HepG2細(xì)胞于37℃共同孵育60 min,吸棄上清后,用1×PBS-1 mmol/L MgCl2清洗2次后,加入100 μl 1×PBS-1 mmol/L MgCl2,共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞。
1.2.6 實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測mRNA水平變化
將HepG2細(xì)胞按2.5×104細(xì)胞/孔接種于48孔板,待細(xì)胞融合至70%左右,在無脂質(zhì)體無血清條件下轉(zhuǎn)染脫氧核酶,終濃度為5 μmol/L,6 h后加入10%血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,提取各孔細(xì)胞RNA,進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR,β-actin作為內(nèi)參比較細(xì)胞中hTERT基因的表達(dá)。用2-△△Ct方法分析mRNA相對表達(dá)量。
1.2.7 MTT方法檢測細(xì)胞增殖
將HepG2細(xì)胞按照8×103細(xì)胞/孔接種于96孔板,在無血清條件下分別將終濃度為12.5 μmol/L的Dz、V4-2、V4-2-Dz與細(xì)胞共同孵育,6 h后加入1%血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),分別于18、36、54、72 h加入MTT檢測,在波長450 nm讀吸光度(A)值。
1.2.8 數(shù)據(jù)分析
實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件分析,兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗,多組數(shù)據(jù)比較采用Oneway ANOVA檢驗,以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
利用Mfold網(wǎng)站分析V4-2和連接hTERT脫氧核酶偶聯(lián)物V4-2-Dz序列的二級結(jié)構(gòu)[17],條件設(shè)置為:溫度37℃,Na+濃度150 mmol/L,Mg2+濃度1 mmol/L。圖1a顯示V4-2主要的結(jié)構(gòu)為莖-環(huán)結(jié)構(gòu),圖1b為V4-2-Dz的結(jié)構(gòu),其中1~80 bp為V4-2序列,81~113為Dz序列,V4-2序列的結(jié)構(gòu)與圖1a一致,表明連接脫氧核酶后沒有影響V4-2的結(jié)構(gòu)。V4-2和V4-2-Dz的吉布斯自由能?G分別為-3.75 kJ/mol、-4.51 kJ/mol,說明其結(jié)構(gòu)均較為穩(wěn)定。
體外合成hTERT RNA片段后,將終濃度為25 nmol/L的Dz和V4-2-Dz與終濃度為2.5 μmol/L的hTERT RNA孵育不同時間,檢測V4-2-Dz的底物切割活性。隨著反應(yīng)時間的增加,Dz和V4-2-Dz對底物的切割量逐漸升高,與Dz相比,V4-2-Dz的切割效率有所降低,但仍具有較強(qiáng)的切割活性(圖2)。
由于VASN在肝癌細(xì)胞中高表達(dá),在正常肝細(xì)胞中低表達(dá)。因此,VASN的適配體V4-2能夠與肝癌細(xì)胞發(fā)生特異結(jié)合。將Dz、V4-2、V4-2-Dz序列的5'端標(biāo)記FAM熒光,與肝癌細(xì)胞HepG2、正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞孵育,通過流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦檢測連接Dz后V4-2-Dz是否與肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合。
Fig.1 Mfold predicts the secondary structure of V4-2 and V4-2-Dz
Fig.2 hTERT RNA was cleaved by Dz and V4-2-Dz in vitro
流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖3所示,HepG2細(xì)胞與FAM標(biāo)記的V4-2、V4-2-Dz孵育后與對照組(control,Con)相比,熒光強(qiáng)度峰值均發(fā)生偏移,但是與Dz孵育后未發(fā)生偏移(圖3a),L02與三條核苷酸序列孵育后峰值均未發(fā)生偏移(圖3b),說明V4-2能夠結(jié)合HepG2,并且V4-2-Dz與V4-2比較,結(jié)合能力未發(fā)生改變。
Fig.3 Binding activity of V4-2-Dz to hepatocellular carcinoma cells detected by flow cytometry
激光共聚焦檢測結(jié)果如圖4所示,HepG2細(xì)胞與FAM標(biāo)記的V4-2、V4-2-Dz孵育后與Con、Dz組相比,觀察到明顯的熒光強(qiáng)度,說明V4-2能夠結(jié)合HepG2細(xì)胞,并且V4-2-Dz與V4-2比較,結(jié)合能力未發(fā)生明顯變化。
Fig.4 Binding activity of V4-2-Dz to hepatocellular carcinoma cells detected by laser confocal
在未加脂質(zhì)體的條件下,向HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的V4-2-Dz共孵育,檢測其對hTERT mRNA表達(dá)的影響。隨著V4-2-Dz濃度的增加,HepG2細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)逐漸降低(圖5a)。在分別加入相同濃度的Dz、V4-2-Dz以及V4-2的HepG2細(xì)胞中,與Con相比,加入Dz和V4-2-Dz對hTERT mRNA水平都具有降低效果,但V4-2-Dz的效果更為顯著,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5b),說明連接V4-2后可以增強(qiáng)Dz的工作能力。
Fig.5 The level of hTERT mRNA expression in HepG2 cells after incubation with V4-2-Dz
將Dz、V4-2、V4-2-Dz分別加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中,檢測其對HepG2細(xì)胞增殖的影響。與Con相比,V4-2-Dz抑制細(xì)胞增殖的能力有顯著性差異(P<0.01)(圖6)。
Fig.6 Detection of HepG2 cell proliferation after incubation with Dz,V4-2 and V4-2-Dz
本研究將VASN蛋白的核酸適配體V4-2與靶向hTERT mRNA的脫氧核酶Dz連接,通過Mfold預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)表明,在V4-2-Dz偶聯(lián)物中對V4-2的結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生明顯的影響,對Dz左結(jié)合臂可能存在堿基互補(bǔ)配對情況,但仍然以獨立形式存在。盡管二級結(jié)構(gòu)預(yù)測存在一定不準(zhǔn)確性,二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果間接證明V4-2-Dz仍然具有適配體和脫氧核酶的功能結(jié)構(gòu)。通過檢測V4-2-Dz的體外切割活性發(fā)現(xiàn),V4-2-Dz仍具有較強(qiáng)的切割活性但與Dz相比活性有所降低,可能由于左端結(jié)合臂過長形成空間位阻造成的。流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦實驗結(jié)果均顯示V4-2-Dz與肝癌細(xì)胞HepG2結(jié)合的特異性未發(fā)生明顯改變,表明Dz并未減弱V4-2對細(xì)胞結(jié)合的能力,說明V4-2具有穩(wěn)定的功能結(jié)構(gòu)。因此,將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,可靶向降解hTERT mRNA并抑制細(xì)胞增殖。
目前開發(fā)遞送脫氧核酶的方法主要分為兩種,一種是通過納米顆粒將脫氧核酶遞送至細(xì)胞,比如膠體金納米粒子、殼聚糖納米粒子等[18-19],另一種則是利用陽離子分子,例如陽離子聚合物、脂質(zhì)體等[20-21],與負(fù)電荷的脫氧核酶通過靜電相互作用結(jié)合,通過膜融合進(jìn)入細(xì)胞。但是這些方法仍存在較大缺陷,比如各種材料制備較為繁瑣,并且在高濃度下具有細(xì)胞毒性。適配體可以作為有效的遞送介質(zhì)使各種類型的寡核苷酸在細(xì)胞中發(fā)揮作用,為脫氧核酶與適配體的結(jié)合提供了良好的基礎(chǔ)。上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一種I型跨膜糖蛋白,在多種上皮來源腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[22],將靶向EpCAM的適配體與靶向Polo樣激酶1(polo-like kinase 1,PLK1)的siRNA共價連接,其選擇性進(jìn)入表達(dá)EpCAM的乳腺癌細(xì)胞,并使PLK1表達(dá)降低[23]。受體酪氨酸激酶(AXL areceptor tyrosine kinase,AXL)同樣在多種癌癥細(xì)胞中高表達(dá),將AXL的適配體GL21.T與抑癌基因miR-148b連接,特異抑制小鼠AXL陽性腫瘤生長[24]。適配體作為靶向分子在藥物分子遞送中的研究日益受到重視。
本研究為肝癌的治療和脫氧核酶的有效遞送提供了一種可行方案。VASN蛋白的適配體V4-2能夠作為一種遞送介質(zhì)與各種具有沉默作用的寡核苷酸(DNazyme、siRNA、ASO、miRNA等)連接,靶向肝癌細(xì)胞發(fā)揮作用。靶向hTERT的脫氧核酶Dz同樣能夠和其他癌細(xì)胞特異膜蛋白的核酸適配體連接,靶向各種類型的癌細(xì)胞發(fā)揮作用,為癌癥的臨床治療提供了基礎(chǔ)。另外,適配體與脫氧核酶的連接方向可能影響脫氧核酶的活性[25],后續(xù)可檢測在脫氧核酶的3'或5'端連接適配體后是否切割活性是否一致,也可在適配體與脫氧核酶的連接位點加入接頭序列,即若干個不同堿基,確保適配體與脫氧核酶的功能結(jié)構(gòu)不受影響。基于適配體和脫氧核酶偶聯(lián)物方法未來仍存在優(yōu)化空間。
VASN蛋白的核酸適配體與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基的脫氧核酶偶聯(lián)物V4-2-Dz具有靶向肝癌細(xì)胞遞送和脫氧核酶底物切割活性,基于細(xì)胞靶向和穿膜遞送的適配體V4-2與脫氧核酶的偶聯(lián)物可作為一種新型生物制劑用于腫瘤藥物研究。