張廣鑫 王 佳 石 明 劉志偉 丁婷婷 岳金媛 李 健 栗 坤 **

（1）燕山大學環(huán)境與化學工程學院，秦皇島 066000；2）燕山大學河北省納米生物技術重點實驗室，秦皇島 066000；3）燕山大學亞穩(wěn)材料制備技術與科學國家重點實驗室，秦皇島 066000）

結腸癌是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，在癌癥相關死亡的病因中排名第三［1］，全球范圍內每年有近兩百萬人成為確診的結腸癌患者。據統(tǒng)計，中國結腸癌發(fā)病率居于全國第3位，死亡率位居全國第5位，且發(fā)病率和死亡率仍在逐年上升［2］。

目前結腸癌的診斷一般依據腸鏡［3］、計算機斷層掃描（CT）和核磁共振（NMR）等檢查手段。在早期癥狀較輕時，腸鏡檢查必要性較低，故結腸癌很難早期發(fā)現，即使診斷出結腸癌并及時進行手術，癌細胞也有比較高的轉移風險［2-4］。不僅如此，結腸癌早期，癥狀較輕不易引起注意。因此，如何有效早期確診，在普通查體中快速預警是否存在腫瘤狀況，成為了當下著重研究的熱點問題［5］。

適配體全稱為核酸適配體，本質是體外合成的寡核苷酸片段，因其能與相應的配體分子進行高親和力強特異性的結合而得名“適配體”［6］。它是一種近年來新興發(fā)展的化學抗體，相對抗體而言，具備很多優(yōu)點：其三維構型多變，易形成螺旋、發(fā)夾、莖環(huán)和假結等結構［7-8］，具有極高的生物相容性，可以與多種活性物質進行結合，反應快速、反應過程靈敏且具有較強親和力［9］，易于體外合成，成本較低［10］；同時，適配體可匹配的靶標分子范圍廣泛，包括動植物細胞、單一蛋白質、病毒和維生素等［11］；作為檢測工具有著較多優(yōu)點［12］，作為診斷試劑和治療試劑，追蹤siRNA、抗癌藥物甚至藥物蛋白［13］，可以提供更精準的治療效果［14］，而抗體作為藥物傳遞系統(tǒng)的可行度非常復雜，在靶向治療中選擇使用適配體作為引導分子，則有助于避開這些缺陷［15］，適配體的遞送系統(tǒng)能夠執(zhí)行更有選擇性的決策并實現更精確的治療效果［16］。

除此之外，適配體對于生物標記物的發(fā)現有一定的幫助，比如新的特異性腫瘤標志物［17］，有助于疾病的早期發(fā)現和及時治療［18］。生物標志物還可用于定向給藥及標記成像等，在醫(yī)學研究檢測方向十分必要，也有極大的前景［19］。在當前研究階段，適配體可以更靈敏地根據靶標細胞表面膜蛋白微量的差異，將靶標細胞與正常細胞區(qū)分開來，因此適配體作用于新型生物標志物研究有著巨大的潛力［20］。

血清篩選是以人血清中含有的蛋白質為靶標，基于血清體系進行篩選，由于血清中具有非常豐富的蛋白質信息，因此將不同疾病中含量異常的蛋白質作為靶標，利用血清篩選分離出相應的適配體［21-22］。血清篩選具有非常多的優(yōu)點，但在許多疾病初期，血清中大量的免疫分子、免疫蛋白過量分泌［23］，會對血清中低豐度蛋白的篩選造成較大影響。如何在血清環(huán)境下，對部分高豐度蛋白進行簡單分離成為血清篩選前期的技術問題，相比于單一蛋白質的篩選，血清靶標的篩選結果充滿可能，對未知的標志物分子進行釣取和后續(xù)蛋白質的分析［24］，有助于推動疾病研究在分子基礎上的發(fā)展，對疾病的診斷和治療有著重要的作用。

本研究以結腸癌血清為正篩靶標、健康查體血清和其他癌癥血清為反篩靶標，利用血清篩選技術（Ser-SELEX），篩選了可以特異性結合結腸癌血清的適配體，為結腸癌早期診斷提供識別工具和新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

本研究所使用的初始文庫是長度為88個堿基的寡核苷酸片段，該片段由兩端各自固定12個堿基序列的和中間部分40個隨機的堿基序列構成。試驗所用PCR體系中的引物（P7/P11）為24 nt長度的序列，用于制備次級庫的體系則使用帶標記的下游引物P11-Bio，所用序列見表 1，由生工生物工程（Sangon Biotech）公司合成寄送。

Table 1 The primer and library sequences used in screening

本研究中所用到的人體血清均由秦皇島市第一醫(yī)院收集，以健康查體、首次診斷結腸癌、首次診斷肺癌、首次診斷乳腺癌和首次診斷直腸癌五類人群分類，瓊脂糖磁珠為本實驗室制備。

實時定量PCR（美國Bio-rad集團）、電泳儀（北京六一儀器廠）、多功能酶標儀（美國Molecular Devices集團）、J-1500圓二色譜儀（日本JASCO公司）、旋渦混勻器（德國IKA集團）、凝膠成像系統(tǒng)（南京世研設備公司）。

1.2 材料準備

血清準備：將健康查體和癌癥病人的抗凝血血液，在4℃、3 000 r/min條件下離心10 min，棄去油脂沉淀，取上清于37℃孵育15 min，在15 000g、4℃條件下離心30 min，重復2次后，渦旋混勻震蕩器混勻約20 s，-20℃保存，使用時以血清∶乙腈∶水=2∶1∶4體積比混合，將乙腈和DEPC水混勻后加入血清，渦旋混勻震蕩器混勻約20 s，室溫水浴超聲5 min，在15 000g、4℃條件下離心15 min，吸取上清待用。

瓊脂糖磁珠活化：稱取100 μl磁珠，每次以1 ml 0.025 mol/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）洗滌3次，加入300 μl 50 g/L的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和300 μl 50 g/L N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），室溫反應30 min，得到活化后的羧基磁珠。

1.3 Ser-SELEX篩選適配體

篩選流程如圖1所示，首先活化的磁珠結合反篩血清中蛋白質，封閉磁珠，篩選初始文庫適配體，取上清，再取新的磁珠結合正篩血清蛋白，封閉磁珠，篩選反篩上清中適配體，洗脫磁珠結合的適配體，經過擴增制單連，制備次級庫進行下一輪篩選，通過前期結腸癌血清正篩-正常人血清反篩步驟和后期結腸癌血清正篩-其他癌癥血清反篩步驟循環(huán)的方式，經過16輪的篩選流程，得到高特異性的適配體，首先是正篩，取400 μl離心后的結腸癌血清上清，與活化后的磁珠孵育45 min（血清濃度和孵育時間逐輪遞減），棄去血清孵育液，磷酸緩沖鹽溶液PBS清洗磁珠，加入1 ml封閉液（0.4 g蔗糖，0.05 g牛血清白蛋白，0.05 g酪蛋白溶于40 ml PBS中），繼續(xù)孵育30 min，減少磁珠對適配體的非特異性吸附。將封閉好的磁珠與初始文庫/次級庫孵育30 min。磁珠變性：棄去未結合上清，加入500 μl DEPC水，金屬浴95℃ 5 min，冰浴5 min。取上清，為該輪正篩模板，將模板PCR擴增，一輪篩選完成后，使用鏈霉親和素磁珠法將制得的正篩模板制備成單鏈ssDNA，將鏈霉親和素凍干粉末在15 000g，4℃離心10 min，水溶成50 g/L，混勻后取10 μl與150 μl磁珠37℃旋轉孵育30 min，然后將正篩模板用P11-Bio下游引物進行PCR擴增，在平臺期停止擴增，得到生物素標記的雙鏈，PBS清洗鏈霉親和素-磁珠復合物，加入PCR擴增雙鏈孵育30 min，PBS清洗，加入5%甲酰胺溶液，40℃水浴5 min，清洗后向管內加入300 μl 0.1 mol/L NaOH溶液，95℃ 5 min，冰浴5 min變性，調節(jié)pH至中性，獲得次級庫，即為下一輪文庫。每一輪的篩選均需經過正篩-制庫-反篩3個步驟，以此往復循環(huán)，增加篩選壓力，提升清洗力度，通過不斷的正向富集和反向消除，獲得表現更優(yōu)異的適配體；以正常人血清做為反篩靶標，共進行7輪篩選，再以肺癌、乳腺癌、直腸癌血清作為反篩靶標分別進行3輪篩選。

Fig.1 Screening process

1.4 適配體結構預測

將前期以健康查體血清為反篩的篩選終點和后期以非目標癌癥血清為反篩的篩選終點的兩輪陽性模板進行擴增，并將獲得的雙鏈DNA進行高通量測序得到一級結構，并進行同源性分析，利用NUPACK網站進行二級結構的預測，并且對二級結構上的莖環(huán)、發(fā)夾、螺旋和假結等結構進行分析，并利用3dRNA/DNAWeb Server對適配體的三維結構進行模擬。

1.5 適配體特異性和親和力的表征

利用qPCR進行了適配體的親和力測定，將準備好的結腸癌血清與瓊脂糖磁珠偶聯，充分洗滌后加入封閉液，防止適配體分子與其他結合位點結合，分別加入 0、15.63、31.25、62.5、125和250 nmol/L濃度的適配體溶液，37℃條件下使適配體與目標分子結合；棄去過量適配體，分別取3 μl上清和17 μl PCR擴增體系于37℃條件下將模板加入PCR管，95℃預變性1 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共30個循環(huán)，記錄擴增后每個反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數，即Ct值，利用GraphPad Prism 8.0軟件分別計算出候選適配體APT-1、APT-2、APT-3和APT-4的親和力常數，即Kd值。

采用qPCR法特異性驗證（圖2），將200 μl活化的磁珠與150 μl結腸癌患者血清和健康查體血清分別孵育結合后，加入等量適配體溶液，37℃恒溫旋轉孵育30 min，棄去過量適配體，加水熱變性，洗脫，qPCR法對洗脫的適配體進行定量分析。以健康查體的血清組作為陰性對照，驗證候選適配體與結腸癌患者血清的結合情況。

1.6 最顯著檢測結果測定

為了獲得最顯著檢測結果及患者血清檢測用量閾值，選用最優(yōu)候選適配體并設置濃度為100 nmol/L，將血清梯度稀釋并投入等量適配體，通過qPCR定量計算最低檢測限。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數據經過GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行處理，比較陽性組與陰性組數據，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清中高豐度蛋白去除

本研究將40例癌癥病人的血清充分混合，消除癌癥病人血清的個體差異性，并設置每例病人血清量等量，保證個體同等性，同時將混合血清中的一些高豐度的非特異性蛋白（如白蛋白、球蛋白等）進行去除，人類血清原液總蛋白質含量約為70 g/L，離心去除上層脂肪后血清總蛋白質含量降低到約60 g/L，使用乙腈處理血清的方式將血清中高豐度蛋白含量降低，以血清∶乙腈∶水=2∶1∶4體積比混合后超聲離心，將處理后的血清進行了蛋白質含量和蛋白質電泳測試，經乙腈處理離心后的總蛋白質含量降低至40～50 g/L，保證在乙腈的處理下，血清中原有的低豐度蛋白質盡可能地不受到影響，而對原有的高豐度蛋白質含量進行削減。

2.2 篩選過程監(jiān)測

2.2.1 qPCR監(jiān)測富集程度

每一輪篩選后，需對制得的正篩以及反篩模板進行qPCR擴增，確認模板中核酸含量，以監(jiān)測適配體分子與血清蛋白結合程度，篩選后的模板量應為隨著輪次逐漸降低，Ct值與模板量的變化相反（圖2），隨著篩選的進行，陽性模板量逐漸增大，陰性模板量逐漸降低，其?Ct值（Ct陰-Ct陽）越來越小，且由初始陰性模板量大于陽性模板量變?yōu)殛栃灾饾u升高直至反超陰性模板，直至篩選結果的陰陽性差值逐漸縮小，根據Ct值計算適配體濃度，計算結合比，即正篩模板濃度/次級庫濃度（圖3），初始幾輪篩選由于具有不穩(wěn)定性，導致結合比變化不規(guī)律，但同一反篩靶標下，結合比逐漸增大，說明適配體在富集，直至更換反篩靶標，參考16輪結合比趨勢，及每輪陰陽模板含量變化，適配體分子已富集，為避免PCR擴增偏好導致的誤差，第7輪和第12輪模板為測序最佳選擇。

Fig.2 The change of positive and negative template content in each round

Fig.3 Combination ratio in screening process (normal screen template concentration/secondary library concentration)

2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測擴增的特異性

適配體分子在溶液中會形成穩(wěn)定且復雜的三級結構，導致模板在擴增過程中會出現少量引物二聚體，進行了瓊脂糖凝膠電泳，擴增后模板含有少量引物二聚體，因在下一輪制次級庫擴增單鏈時，引物二聚體無法與設定引物進行配對進而無法擴增，故少量引物二聚體對后續(xù)篩選無影響。對第7、10、13和16輪制得模板DNA進行電泳，結果顯示條帶位置位于50～100 bp之間，約為88 bp，驗證了篩選結果的可靠性。

2.3 結構分析

適配體的家族分析對挑選最優(yōu)適配體具有重要意義，由于前20條序列家族同源性高達90%以上，為了保證候選庫池的多樣性，選擇前100條適配體做了家族樹圖（圖4），篩選得到的前100條序列主要以右側的一個大家族和左側的許多小家族為主，這幾個家族可能具有優(yōu)勢結構，再優(yōu)先考慮高通量測序中的重復情況、堿基分布情況和吉布斯最低自由能等條件，從右側的大家族中選擇了A1和A2兩條適配體，并在左側的小家族中選擇了A5和A54兩條適配體最為最終的候選適配體，將4條候選適配體進行家族同源性分析（圖5），結果表明3條適配體具有較高家族同源性（不包括APT-54），APT-1、APT-2和APT-5三條適配體對結腸癌血清具有較高特異性，推測此家族中某些特殊結構可能是結合靶標蛋白的重要因素，且APT-1和APT-5的結果和預測結果幾乎完全相同，兩條適配體家族同源性高達97%。

Fig.4 The family tree of the first 100 aptamers

Fig.5 Homology analysis of four candidate aptamers

利用NUPACK軟件對4條候選適配體進行二級結構預測（圖6），4條適配體均具有15個堿基左右莖環(huán)結構，且APT-1、APT-2、APT-5和APT-54的吉布斯自由能分別為-5.68、-7.57、-5.88、-5.63 kcal/mol，自由能均在-5～-8 kcal/mol區(qū)間，說明篩選的適配體序列具有較穩(wěn)定的結構。

在二級結構基礎上，對4條候選適配體三級結構進行模擬（圖7a，c），APT-1和APT-5兩條適配體均在紅色螺旋部分有一個較大莖環(huán)，綠色部分有較小莖環(huán)，分析認為兩個莖環(huán)中堿基附帶的磷酸基團可能在環(huán)內形成一個強負電電勢，可能是與目標蛋白結合的主要位點。圖7b為APT-2模擬結果，雙螺旋為主要結構，但其具有一個開放的單鏈端，這種開放的單鏈端可能由于自身體積小的因素對目標蛋白上狹隘結構有著一定的結合能力。APT-54上端的紫紅色結構部分中具有一個特殊的假結結構（圖7d），其主要螺旋部分結構松散，結合時可能通過多種變化，如在不同pH條件下彎折形成具有特異性結構，或在結合時解開雙鏈形成較大莖環(huán)，以此達到對靶標分子的作用。

2.4 親和力和特異性測定

將4個候選適配體在過量血清條件下，設置適配體濃度分別為200、100、50、25、12.5 nmol/L和無適配體添加作為對照，檢測與結腸癌患者血清的親和力，4條候選適配體均可與結腸癌患者血清結合，但親和力強弱略有不同。統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 8.0計算分析解離常數，4條候選適配體與結腸癌患者血清結合的Kd值分別為（4.466±0.384）、（6.122±0.615）、（5.610±0.202）及（6.964±0.181）nmol/L，均小于10 nmol/L，表明4條候選適配體對結腸癌患者血清中的目標分子有較高親和力，其中APT-1結合能力最強，APT-2和APT-5結合能力次之，而適配體APT-54的結合能力較弱。

為確保特異性驗證的準確性，使用qPCR法以驗證4條候選適配體的特異性。以16例不同結腸癌血清作為試驗組，16例健康查體血清作為對照組，分析比較ΔCt值。結果如圖8所示：APT-1的ΔCt值小于2（圖8a），表明此適配體特異性不是很好，APT-2的ΔCt值為3～5范圍內（圖8b），表明此適配體特異性較好，與結腸癌患者血清的結合程度較強，陽性檢出率約為82.5%；APT-5和APT-54的ΔCt值小于1（圖8c，d），說明識別結腸癌患者血清的特異性較弱。

Fig.6 Secondary structure of candidate aptamers in the NUPACK software

Fig.7 3D structural simulation of candidate aptamers

Fig.8 Specific validation of APT-1,APT-2,APT-5 and APT-54 for colon cancer serums

針對特異性較強的適配體APT-2，補充了32例其他癌癥患者血清進一步驗證，分析APT-2對其他癌癥的特異性（圖9），該適配體對結腸癌患者血清檢出率仍可達到80%以上，表明該適配體具有較強的結合結腸癌患者血清能力。分析認為APT-2可與結腸癌患者血清中高表達的未知目標蛋白分子進行穩(wěn)定結合，顯示了APT-2可以穩(wěn)定檢出結腸血清的能力，分析APT-2的二級結構可知，APT-2的主要結構為莖環(huán)，且其自由能僅為-5.88 kcal/mol，所以其結構穩(wěn)定，與特異性表征試驗結果一致。

Fig.9 Specific validation of APT-2

2.5 最顯著檢測結果

為確定標定qPCR法檢測時血清用量，選取不同濃度的血清和同一濃度的適配體進行檢測（圖10）。當結腸癌血清用量在30～200 μl時，陰陽性模板量有顯著差別；當血清量低于30 μl時，血清中未知的目標蛋白含量較低，結果無顯著差異；血清用量超過200 μl時，由于瓊脂糖磁珠用量固定，陽性血清中的目標蛋白無法全部結合，導致模板量的差異無顯著變化，故最佳血清用量為30～200 μl。

Fig.10 Optimum serum dosage for testing

3 討論

本研究以瓊脂糖磁珠為載體，結腸癌患者血清為正篩樣本，健康查體、肺癌患者、直腸癌患者和乳腺癌患者血清為反篩樣本，通過正反篩交替循環(huán)的篩選步驟，建立了完整有效的Ser-SELEX技術，篩選結腸癌血清的適配體，從隨機程度較高的庫池中進行篩選，通過逐漸增加篩選壓力，如減少正篩靶標的孵育時間，增加反篩靶標的孵育時間和洗脫步驟得到具有更高的親和力，性質更穩(wěn)定的適配體序列。并通過qPCR對獲得的正篩模板進行定量監(jiān)測，確保適配體庫池得到富集，在此過程不斷消減陰陽性靶標共有蛋白質結合的適配體，使庫池中的序列具有較高特異性，在模板量監(jiān)測過程中，若出現篩選結果不理想，即陰陽性模板差異沒有明顯縮小，則應重復當天輪次直至陰陽性模板量差異縮小，以確保篩選每一輪的有效性。

經過16輪篩選，獲得了具有特異性結合結腸癌患者血清蛋白的適配體庫池，對此序列池與陰陽性靶標結合進行對比，發(fā)現篩選得到的序列池已經對陽性靶標蛋白有一定的結合能力，在陰陽性對比時有明顯差異，對這個序列池里第7輪正篩模板和第16輪正篩模板進行第二代測序，并對測序結果進行理論分析，通過適配體的堿基分布情況和二級結構的預測挑選出了APT-1、APT-2、APT-5和APT-54四條適配體作為最終的候選適配體，并對候選適配體進行堿基分布情況與二級和三級結構分析。根據最低自由能原則分析，發(fā)現在模板庫池中，莖環(huán)是主要存在的結構類型，尤其是適配體APT-2和APT-54，其結構以一個大莖環(huán)為主，適配體APT-1和APT-5，除莖環(huán)結構外，在序列的一端呈現發(fā)夾結構，莖環(huán)和發(fā)夾結構可能是適配體分子識別目標分子的特殊結構域。

為確保適配體具有良好特異性，篩選結腸癌患者血清適配體時使用健康查體血清等作為反篩。結果表明適配體APT-1與結腸癌血清的親和力最高，而APT-54親和力較弱。通過對約60例病人血清的特異性分析，發(fā)現適配體APT-2能特異性識別結腸癌，陽性檢出率約為 82.5%，Kd為（6.122±0.615）nmol/L，因此適配體APT-2為最優(yōu)適配體，且適配體APT-2對結腸癌血清的檢測范圍較廣，在30～150 μl范圍內均有良好的差異性和穩(wěn)定的檢出率。

4 結論

本研究篩選得到一條表現優(yōu)異的功能性核酸適配體APT-2，該適配體可與結腸癌患者血清進行特異性結合，并具有良好的親和力，為構建以適配體為核心的結腸癌血清生物傳感器和結腸癌早期臨床診斷技術提供了理論依據和試驗方法。