馬 怡 黃江健 楊人香 姜蘇珊 何雅琪 陳權(quán)薪 蘇會嵐

（成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，成都 610500）

乳酸是食品工業(yè)中細(xì)菌污染監(jiān)測［1］、發(fā)酵和環(huán)境監(jiān)測［2］中的常用指標(biāo)，也是生物醫(yī)學(xué)診斷中反映人體生理病理狀態(tài)的重要物質(zhì)［3］。傳統(tǒng)的乳酸檢測方法如分光光度法［4］、比色法［5］等步驟繁瑣、靈敏度低、成本高。電化學(xué)生物傳感器是基于電化學(xué)分析方法發(fā)展的一種新型檢測技術(shù)，通過將生物分子之間的特異性識別作用的反應(yīng)信號轉(zhuǎn)化成電信號，來實(shí)現(xiàn)對靶物質(zhì)的定性或定量檢測，具有樣品處理簡單、分析效率高、選擇性好、成本低、操作簡便等特點(diǎn)［6］。目前，基于酶電極的乳酸傳感器因其檢測快速且靈敏度高被廣泛報道［7-8］，主要應(yīng)用L-乳酸氧化酶（L-LOD）和L-乳酸脫氫酶（L-LDH）的兩種生物酶作為生物識別原件進(jìn)行構(gòu)建［9］。由于該類方法分析性能受酶活性、氧或NAD+濃度等因素影響［10］，因此，迫切需要靈敏、簡便和選擇性高的新方法來實(shí)現(xiàn)L-乳酸的快速檢測。

適配體是一類單鏈DNA或RNA寡核苷酸，被稱為“化學(xué)抗體”，具有易于合成和修飾、熱穩(wěn)定性、低成本、缺乏免疫原性和毒性等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，可以高親和力地特異性結(jié)合各種靶標(biāo)［11］，是開發(fā)生物傳感器非常有潛力的識別探針。與酶不同，適配體僅靠結(jié)合進(jìn)行目標(biāo)識別，不依懶于氧或NAD+等其他反應(yīng)物［12］。乳酸是一種低表位分子，其適配體篩選較困難［13］。Huang等［14］通過文庫固定化選擇方法獲得了10條L-乳酸的適配體序列，其中適配體鏈Lac201響應(yīng)最靈敏，且基于Lac201所設(shè)計的熒光傳感器的檢測范圍最廣，可以涵蓋乳酸1～23 mmol/L的生理全范圍。三螺旋分子開關(guān)（triple-helix molecular switch，THMS）是一種非常規(guī)的核酸結(jié)構(gòu)，通常由1個具有雙臂片段的目標(biāo)特異性DNA序列和1個被困在雙臂片段之間被稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)探針的DNA序列（STP）構(gòu)成，通?；诎袠?biāo)結(jié)合破壞其三螺旋結(jié)構(gòu)的機(jī)理實(shí)現(xiàn)檢測，作為一種核酸識別探針被廣泛應(yīng)用［15］。脫氧核酶（DNAzymes）是一種人工合成的功能核酸，由底物鏈和催化鏈組成，在金屬離子的輔助下完成催化剪切，在電化學(xué)分析方法中常與其他信號放大策略聯(lián)用實(shí)現(xiàn)信號放大，提高分析靈敏度［16］。其中有RNA剪切活性的Pb2+特異DNAzyme是目前研究最為充分的一類DNAzyme［17］。

本研究開發(fā)了一種超靈敏、低成本的新型電化學(xué)適配體傳感器用于L-乳酸的快速檢測，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下研究了該傳感器的分析性能，為L-乳酸的檢測提供新策略。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

L-乳酸鈉購于阿拉丁生化科技股份有限公司，1-己硫醇（HT）、半胱氨酸、葡萄糖、抗壞血酸等購于美國Sigma公司，氯金酸、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）和 Tris-鹽酸緩沖液（Tris-HCl，pH=8.0）、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、硝酸鉛、氯鈀酸等購于成都市科龍化工試劑廠。氮摻雜多壁碳納米管購于江蘇先豐納米材料科技有限公司。核酸序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列信息見表1。

CHI 660E電化學(xué)工作站（含三電極系統(tǒng)，上海辰華）、玻碳電極（d=4 mm）、超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物）、BSA124S 電子天平（上海舜宇恒平）、金屬?。ㄙ惸w）、干燥箱（天津泰斯特）、離心機(jī)（蜀科）、透射電鏡（賽默飛）、恒溫磁力攪拌器（上海司樂）、UV2355型紫外可見分光光度計。

1.2 溶液配制

所有核酸干粉離心后用Tris-HCI（10 mmol/L，pH=8.0）緩沖溶液進(jìn)行溶解和稀釋。亞甲藍(lán)修飾核酸（MB-DNA）溶液采用TCEP（10 mmol/L）預(yù)處理30～60 min，以減少硫醇-硫醇（SH-SH）鍵。L-乳酸鈉用超純水稀釋，得不同濃度（1、3、5、7、9、11、13、15、17、20 mmol/L）溶液。

1.3 制備復(fù)合納米材料Au/Pd-N-MWCNTs

將12.0 mg N-MWCNTs分散到新制的多巴胺溶液（50 ml，1.0 mmol/L）中，置于碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液（10 mmol/L，pH=8.5）中攪拌12 h，多巴胺在N-MWCNTs表面自聚合，離心洗滌得到多巴胺-N-MWCNTs復(fù)合物。

采用溶膠法預(yù)先合成金鈀納米顆粒的溶膠溶液。按比例加入1%氯鈀酸和1%氯金酸水溶液作為溶膠前驅(qū)體，以聚醚酰亞胺（PEI，0.1 g/L）作為保護(hù)劑，攪拌30 min。在連續(xù)攪拌中向上述溶液加入還原劑NaBH4（0.1 mol/L），當(dāng)混合溶液變?yōu)楹谏珪r表明金鈀納米離子溶膠成功合成。

隨后加入上述多巴胺-N-MWCNTs復(fù)合物粉末于金鈀納米粒子溶膠中混合攪拌16 h，直至上層清液轉(zhuǎn)為透明無色。用去離子水進(jìn)行多次過濾、洗滌以去除氯離子，置于60℃的烘箱中干燥12 h，裝管保存，使用前稱取1.5 mg溶解在3 ml的去離子水中，超聲0.5 h得到相對穩(wěn)定的黑色懸浮液。

1.4 合成THMS

THMS組裝包括兩部分：Lac 201鏈由L-乳酸的原始適配體序列和2個擴(kuò)展序列組成，DNAzyme鏈包含1個Pb2+依賴的DNAzyme序列。為了形成三螺旋結(jié)構(gòu)，將相同濃度（2 μmol/L）的Lac 201鏈和DNAzyme鏈等量地混合在結(jié)合緩沖液Tris-HCI（pH=8.0）中，在95°C加熱5 min，然后冷卻至室溫2 h，4℃冰箱保存。

1.5 電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)建

將玻碳電極經(jīng)拋光與超聲洗滌預(yù)處理后烘干。采用循環(huán)伏安法（CV，電壓范圍-0.2～+0.8 V，掃描速率100 mV/s），在5 mmol/L Fe（CN）63-/4-溶液中進(jìn)行電化學(xué)掃描，直到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖。隨后滴涂10 μl Au/Pd-N-MWCNTs混合溶液在電極上，烘干后在-0.2 V的恒電位控制下，30 s內(nèi)電沉積AuNPs，得到復(fù)合納米材料修飾的電極。將8 μl MB-DNA（4 μmol/L）滴加到修飾后的電極表面，置于4°C冰箱孵育3 h。經(jīng)超純水洗滌烘干后，滴加6 μl HT溶液（1 mol/L）孵育30 min以封閉非特異性吸附位點(diǎn)。用Tris-HCl緩沖液洗滌后，將所得電極干燥，4°C避光保存。

1.6 檢測

采用傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)（飽和甘汞電極為參比電極、鉑絲電極為輔助電極、修飾的玻碳電極GCE作為工作電極），電化學(xué)信號采用差分脈沖伏安法（DPV）獲得，從-0.6 V～-0.1V。將10 μl 20 mmol/L L-乳酸與90 μl THMS溶液在結(jié)合緩沖液Tris（10 mmol/L，pH=8.0）中孵育30 min。然后，將10 μl上述孵育溶液和2 μl Pb2+加入到電極表面，37°C下孵育60 min。用PBS（pH=7.4）緩沖液洗滌后，進(jìn)行電化學(xué)測量，峰電流（I）與L-乳酸的濃度相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法可測得樣品中L-乳酸的濃度。

1.7 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

優(yōu)化信號鏈MB-DNA濃度、DNAzyme剪切時間和Pb2+濃度三個實(shí)驗(yàn)條件。固定其他實(shí)驗(yàn)條件，測試在20 mmol/L L-乳酸孵育前后，不同MB-DNA（1、2、3、4、5、6 μmol/L）濃度下的DPV響應(yīng)，獲得MB-DNA濃度與峰電流的關(guān)系曲線。測試不同DNAzyme剪切孵育時間（0、20、40、60、90、120 min）和Pb2+濃度（1、2、3、4、5、6 μmol/L）的DPV響應(yīng)，并繪制孵育時間與峰電流的關(guān)系曲線。

1.8 性能研究

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，采用DPV檢測不同濃度L-乳酸（1、3、5、7、9、11、13、15、17、20 mmol/L）的電信號響應(yīng)值（I），以乳酸濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，峰電流為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下，測試了該傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性。在實(shí)際樣本中分別加入高中低3種濃度的L-乳酸，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算添加樣本的濃度，計算得到加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 適配體傳感器的檢測原理

Fig.1 Schematic of the electrochemical aptasensor for detection of L-lactate based on THMS-triggered DNAzyme cleavage mechanisms

圖1為基于THMS觸發(fā)DNAzyme循環(huán)剪切策略檢測L-乳酸的電化學(xué)適配體傳感器制備示意圖。首先，在預(yù)處理后的玻碳電極上修飾Au/Pd-NMWCNTs，修飾有巰基的MB-DNA鏈通過Au-S共價鍵連接到電極上，然后采用HT封閉非特異性位點(diǎn)。當(dāng)L-乳酸存在時，與THMS結(jié)構(gòu)中的Lac 201鏈特異性結(jié)合，釋放DNAzyme鏈。DNAzyme鏈被激活，進(jìn)一步與電極上的MB-DNA探針特異性識別，在Pb2+的催化下剪切MB-DNA，導(dǎo)致MB從電極表面脫落。當(dāng)一條MB-DNA鏈剪切完成時，與DNAzyme鏈的結(jié)合力變?nèi)?，使DNAzyme被釋放，再與另一MB-DNA結(jié)合，形成循環(huán)剪切過程，致使電極表面MB-DNA大量脫落，顯著降低電信號。電信號降低的程度與L-乳酸的濃度相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對其的超靈敏檢測。

2.2 電極表征

采用循環(huán)伏安法（CV）對電極修飾過程進(jìn)行表征（圖2）。由于Au/Pd-N-MWCNTs的強(qiáng)導(dǎo)電性，電極峰電流（曲線b）升高。當(dāng)MB-DNA固載到電極表面后，阻礙電子傳遞，峰電流降低（曲線c）。HT的固載進(jìn)一步阻礙電子傳遞，峰電流再次降低（曲線d）。在DNAzyme的剪切效應(yīng)下，MB-DNA裂解從電極表面分離，峰電流升高（曲線e），驗(yàn)證了修飾電極的成功制備。

Fig.2 Cyclic voltammetry curves of the modified electrode at 5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-

2.3 材料表征

多壁碳納米管（MWCNTs）是典型的一維納米材料，它的比表面積大、具有空腔結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的電化學(xué)性質(zhì)，常用于負(fù)載其他材料，從而獲得特殊性能的復(fù)合物材料［18］。氮摻雜將會進(jìn)一步改善MWCNTs表面的電荷分布，提高其反應(yīng)活性。同時，雙金屬具有良好的協(xié)同催化作用，在檢測過程中能顯示出更高的電流響應(yīng)和穩(wěn)定性。因此，本研究合成金鈀-摻氮多壁碳納米管納米復(fù)合材料，以提高玻碳電極的導(dǎo)電性能，加快電子轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)電化學(xué)活性物質(zhì)的氧化峰電流。

為了驗(yàn)證上述納米復(fù)合材料的成功合成，采用能譜面掃（EDS mapping）、X射線衍射（XRD）與X射線光電子能譜分析（XPS）對材料進(jìn)行了表征（圖3）。EDS mapping結(jié)果顯示，該復(fù)合材料中含有C、N、Pd、Au四種元素，且圖中Pd、Au粒子沿N-MWCNTs均勻分布，表明了這兩種金屬粒子成功摻雜（圖3a）。由于Pd、Au為Fm-3m cubic結(jié)構(gòu)，故XRD結(jié)果區(qū)分不明顯（圖3b）。文獻(xiàn)對比可見［19］，Au/Pd-N-MWCNTs的（002）晶面對應(yīng)的衍射峰顯示碳納米管結(jié)構(gòu)。（111）、（200）、（220）晶面對應(yīng)的衍射峰顯示碳納米管表面的納米顆粒結(jié)晶良好。圖3c為XPS全譜分析結(jié)果，圖3d～g分別代表C 1s、N 1s、Pd 3d、Au 4f四種元素的分譜，其中Au 4f的特征峰為84.1 eV，說明Au在合成后的納米復(fù)合材料中具有良好的金屬態(tài)結(jié)構(gòu)，Pd 3d XPS譜由兩個雙態(tài)組成，表明同時存在兩個化學(xué)態(tài)（Pd、PdO）。結(jié)果表明，金屬態(tài)的Au和Pd均為該反應(yīng)的活性組分，與周依雪［20］的研究一致。以上結(jié)果表明，Au/Pd-N-MWCNTs納米復(fù)合材料成功合成。

采用透射電子顯微鏡（TEM）對制備的納米復(fù)合材料Au/Pd-N-MWCNTs進(jìn)行了形貌表征（圖4a），可以看到多巴胺處理后的N-MWCNTs，較為均勻地分散在水溶液中，納米顆粒均勻地修飾在N-MWCNTs上。為了進(jìn)一步證明該復(fù)合材料的導(dǎo)電性能，用Au/Pd-N-MWCNTs與納米金分別修飾玻碳電極，孵育MB-DNA后進(jìn)行信號檢測，發(fā)現(xiàn)Au/Pd-N-MWCNTs修飾的玻碳電極峰電流值為26.35 μA，較沉積金修飾的玻碳電極峰電流值高11.26 μA（圖4b），說明表面Au/Pd-N-MWCNTs能顯著提高電極表面的電子傳輸性能，有望提高傳感器的檢測性能。

Fig.3 Characterization of the nanomaterials

Fig.4 Electrochemical performance analysis of nanomaterials

2.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

對MB-DNA濃度、Pb2+濃度和DNAzyme剪切孵育時間3個實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。首先研究不同濃度MB-DNA與適配體傳感器孵育前后的DPV信號差異（圖5a）。隨著MB-DNA濃度的升高峰電流逐漸升高，當(dāng)信號鏈MB-DNA的濃度4 μmol/L時信號最大，且不隨濃度的增大而變化，說明此時MBDNA的結(jié)合已達(dá)到飽和。此外，DNAzyme的剪切需要Pb2+作為輔助因子，且Pb2+濃度對DNAzyme的剪切活性產(chǎn)生影響。因此，固定其他實(shí)驗(yàn)條件，加入不同濃度的Pb2+時電化學(xué)響應(yīng)結(jié)果如圖5b所示，Pb2+的濃度為4 μmol/L時信號趨于穩(wěn)定。DNAzyme鏈的剪切孵育時間在60 min后信號沒有明顯的變化，表明裂解反應(yīng)在60 min內(nèi)完成（圖5c）。綜上，選擇 4 μmol/L MB-DNA、4 μmol/L Pb2+和60 min孵育時間為作為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

Fig.5 Optimization of experimental conditions

2.5 L-乳酸的電化學(xué)測定

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，測定了不同濃度（1～20 mmol/L）L-乳酸的DPV響應(yīng)曲線（圖6）。圖中顯示，峰電流（I）隨著L-乳酸濃度的增加而降低，且I與相應(yīng)加入L-乳酸的濃度的對數(shù)與呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為I=-17.03lgctarget+27.127，R2=0.997 5，檢測限為0.51 mmol/L（S/N=3），較王洋洋等［21］報道的汗液乳酸傳感器（檢測限小于5 mmol/L）和Huang等［14］報道的乳酸熒光生物傳感器（檢測限為0.55 mmol/L）的檢測限更低，可見基于THMS觸發(fā)DNAzyme循環(huán)剪切策略能夠?qū)崿F(xiàn)L-乳酸的超靈敏檢測，其檢測范圍也能有效地覆蓋血液中L-乳酸的生理濃度范圍［22］。

Fig.6 Electrochemical determination of L-lactate

2.6 傳感器的性能研究

接著同樣在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下對上述適配體傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性進(jìn)行了研究（圖7）。首先，同時制備了10適配體傳感器檢測相同濃度的L-乳酸（20 mmol/L）（圖7a），RSD為2.80%，說明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。研究測試了傳感器的穩(wěn)定性，即將制備的適配體傳感器避光存放在4℃冰箱中，在第1、7、14、21天進(jìn)行電化學(xué)測試（圖7c）。信號在21 d內(nèi)下降了9.6%，RSD為4.56%，可見該傳感器穩(wěn)定性良好。同時，本研究選擇了壞血酸、半胱氨酸、葡萄糖、谷胱甘肽4種小分子物質(zhì)來測試傳感器的特異性，將上述4種小分子分別與90 μl THMS溶液在結(jié)合緩沖液Tris孵育30 min，并用制備好的適配體傳感器分別進(jìn)行檢測（圖7b）?？箟难?、半胱氨酸、葡萄糖、谷胱甘肽并不能觸發(fā)THMS開關(guān)誘導(dǎo)的信號機(jī)制，響應(yīng)信號均無明顯變化。而只有在L-乳酸單獨(dú)存在或與其他4種小分子物質(zhì)混合存在的情況下，才可以觸發(fā)信號機(jī)制運(yùn)轉(zhuǎn)，產(chǎn)生明顯的響應(yīng)信號，相同濃度的L-乳酸和其混合溶液的響應(yīng)強(qiáng)度無明顯差異，證實(shí)該傳感器對L-乳酸具有較高的特異性。

Fig.7 Analytical performance

2.7 實(shí)際樣本L-乳酸的檢測

為了對本適配體傳感器的實(shí)際應(yīng)用性能進(jìn)行評估，在最優(yōu)條件下采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對所制備的適配體傳感器在血清中的L-乳酸檢測進(jìn)行研究。血清樣本用Tris緩沖液稀釋10倍后，加入不同濃度的L-乳酸，測定加標(biāo)回收率。加標(biāo)回收率=（加標(biāo)試樣測定值－試樣測定值）÷加標(biāo)量×100%，結(jié)果見表2。該適配體傳感器的加標(biāo)回收率為105.60%～110.80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.35%～4.56%，表明所構(gòu)建的電化學(xué)適配體傳感器可用于血清中L-乳酸檢測。

Table 2 Determination of L-lacate spiked recovery rate using an aptasensor

采用分光光度法同時檢測了樣品，并運(yùn)用t檢驗(yàn)對兩種方法的測定值進(jìn)行統(tǒng)計分析（表3）。結(jié)果表明，兩種方法測定結(jié)果無顯著差異（P>0.05）。本研究所構(gòu)建的傳感器對樣品的測定結(jié)果與分光光度法具有很好的一致性。

Table 3 Results of the determination of L-lactate in real serum by different methods

3 結(jié)論

乳酸檢測在生物醫(yī)學(xué)診斷、食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有重要意義。本研究基于金鈀-摻氮多壁碳納米管納米復(fù)合材料（Au/Pd-N-MWCNTs）構(gòu)建了THMS觸發(fā)的DNAzyme循環(huán)放大的電化學(xué)適配體傳感器，有效提升了玻碳電極的導(dǎo)電性，且DNAzyme可以循環(huán)剪切MB-DNA，增強(qiáng)響應(yīng)信號，為L-乳酸的快速檢測提供了新方法。該傳感策略易于設(shè)計，只需替換THMS中的適配體序列，就可以實(shí)現(xiàn)對不同目標(biāo)的檢測。該技術(shù)具有操作簡單、特異性高、低成本等優(yōu)勢，有較寬的檢測范圍和較低的檢測限，可望應(yīng)用于L-乳酸實(shí)際樣本檢測工作中。但仍具有整體檢測時間較長、傳感器的壽命比較短和需要使用污染環(huán)境的Pb2+等局限性，希望能在后續(xù)的研究中進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化。