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        基于核酸適配體的膠體金比色法檢測鰻弧菌*

        2023-10-10 01:34:44黃將遠徐曉津
        生物化學與生物物理進展 2023年9期
        關(guān)鍵詞:超純水膠體金弧菌

        黃將遠 鄭 江 ** 薄 軍 徐曉津 譚 英

        (1)集美大學水產(chǎn)學院,廈門 361021;2)鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心,廈門 361021;3)自然資源部海洋第三研究所,廈門 361005)

        鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要條件致病菌,當養(yǎng)殖環(huán)境惡化或機體受創(chuàng)時,魚類等養(yǎng)殖品種極易感染鰻弧菌等病原菌,出現(xiàn)體表潰爛出血、腸黏膜脫落、肝臟壞死,甚至出現(xiàn)全身性組織病變等癥狀,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-5]。對鰻弧菌進行快速的檢測鑒定是其病害防治的前提和基礎(chǔ)。目前對弧菌的檢測方法主要有微生物培養(yǎng)法、分子生物學等方法。微生物培養(yǎng)法存在耗時耗力、難以定量等問題[6],分子生物學法則成本較高、不能對結(jié)果進行直觀判定、存在不同程度的假陽性問題[7]。因此,開發(fā)更為理想的鰻弧菌檢測技術(shù)就顯得十分必要。

        核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)篩選出的一類能與靶目標特異性結(jié)合的寡核苷酸分子[8-9]。與傳統(tǒng)抗體相比,核酸適配體具有高特異性、高親和力、易合成、易修飾和穩(wěn)定性好等優(yōu)點[10-11],在疾病診斷與治療、食品安全檢測、細菌檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用[12-15]。

        本文將鰻弧菌的核酸適配體與膠體金結(jié)合形成相應(yīng)的檢測復(fù)合物,利用鰻弧菌可特異性地結(jié)合競爭檢測復(fù)合物中的核酸適配體,從而釋放出有特定顏色的膠體金顆粒,建立了一種可快速檢測鰻弧菌的比色法。文中對該方法的原理、檢測特異性、檢測復(fù)合物的制備條件、定量檢測效果等方面進行了研究和探討,相關(guān)成果對于鰻弧菌的病害防治以及核酸適配體的應(yīng)用開發(fā)都具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 試劑與儀器

        粒徑為20 nm膠體金溶液,湖州英創(chuàng)生物科技有限公司;核酸適配體H1(5'-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCTCCTACTGACCACCCC GGCTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'),為實驗室前期篩選獲得的鰻弧菌核酸適配體[1],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,用超純水配制成濃度為10 μmol/L的貯存液,于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫会樖竭^濾器50 mm,上海新亞微孔濾膜公司;濾膜,上海新亞微孔濾膜公司,直徑50 mm,孔徑0.22 μm;海水晶,江西鹽通科技有限公司,鹽度30‰,可用于配制不同鹽度的海水。

        金屬浴TU-10,海一恒科技有限公司;純水機Smart-RO15,上海和泰儀器有限公司;高速臺式離心機TGL-16C,上海安亭科學儀器廠;全波長酶標儀ReadMax2100P,上海閃耀生物科技有限公司;可調(diào)式混勻儀MX-S,北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份有限公司。

        1.2 細菌和培養(yǎng)基

        鰻弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)均由集美大學病原微生物實驗室提供。

        胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB培養(yǎng)基),用于鰻弧菌、溶藻弧菌、遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的培養(yǎng);LB 培養(yǎng)基,用于銅綠假單胞菌和變形假單胞菌的培養(yǎng)。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 NaCl濃度對檢測吸光度的影響

        取濃度為2.4 μmol/L適配體20 μl與60 μl膠體金溶液結(jié)合,在25℃下、200 r/min搖床孵育60 min,將所得復(fù)合物與20 μl用超純水懸浮的105CFU/ml的鰻弧菌混合,再在25℃下、200 r/min搖床孵育結(jié)合70 min,然后分別與60 μl濃度為100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng),測定混合液在520 nm處的吸光度值(A520),獲得吸光度與NaCl濃度的關(guān)系曲線,以確定NaCl的濃度。

        1.3.2 檢測過程中吸收光譜的變化

        整個檢測過程經(jīng)歷了如下4個階段:膠體金(Au)→膠體金+核酸適配體(Au+Apt)→膠體金+核酸適配體+鰻弧菌(Au+Apt+Va)→膠體金+核酸適配體+鰻弧菌+NaCl(Au+Apt+Va+NaCl),分別對這4個階段的吸收光譜進行分析檢測。具體如下所述。取60 μl膠體金作為樣品1(Au)。60 μl膠體金與20 μl濃度為2.4 μmol/L的適配體H1在25℃下、200 r/min搖床孵育結(jié)合60 min,作為樣品2(Au+Apt)。樣品2中加入20 μl濃度為104CFU/ml的鰻弧菌,在25℃下、200 r/min搖床孵育70 min,得到樣品3(Au+Apt+Va)。樣品3中加入60 μl濃度為400 mmol/L的NaCl得到樣品4(Au+Apt+Va+NaCl)。用超純水分別將樣品1~3稀釋到總體積為160 μl,與樣品4的總體積一樣,以排除體積不同導(dǎo)致的干擾,然后用酶標儀在波長320~700 nm范圍內(nèi)掃描這4個樣品獲得相應(yīng)的吸收光譜圖。

        1.3.3 特異性分析

        將2.4 μmol/L的核酸適配體于95℃金屬浴中加熱5 min,再冰浴10 min。然后取20 μl適配體與60 μl膠體金結(jié)合,配制成80 μl適配體-膠體金復(fù)合物。再用超純水將6種細菌(鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、變形假單胞菌、銅綠假單胞菌、遲鈍愛德華氏菌和溶藻弧菌)分別稀釋至10~107CFU/ml,制成菌懸液,然后各取20 μl與80 μl的膠體金-適配體復(fù)合物結(jié)合,作為實驗組;另取20 μl的超純水代替菌懸液,與80 μl的膠體金-適配體結(jié)合,作為對照組。實驗組和對照組一同在25℃、200 r/min搖床孵育結(jié)合70 min,隨后離心取上清液,與60 μl、400 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng),然后測定混合液在520 nm處的吸光度值。由于實驗組復(fù)合物中的適配體會被鰻弧菌奪取,導(dǎo)致膠體金暴露,加入NaCl后,暴露的膠體金顆粒就會在NaCl的作用下發(fā)生聚集作用,導(dǎo)致溶液的吸光度值發(fā)生變化,而對照組沒有菌,也沒有相應(yīng)的聚集作用,因此鰻弧菌對應(yīng)的吸光度值=實驗組的吸光度值-對照組的吸光度值。

        1.3.4 膠體金-適配體復(fù)合物的制備條件優(yōu)化

        適配體與膠體金結(jié)合時間的優(yōu)化:2.4 μmol/L的核酸適配體于95℃金屬浴中加熱5 min,再冰浴10 min,然后取20 μl該適配體與60 μl的膠體金混合,于25℃下200 r/min搖床結(jié)合不同時間,之后分別加入60 μl 400 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng),再在520 nm處檢測溶液的吸光度值,繪制吸光度和結(jié)合時間的關(guān)系曲線,根據(jù)這個曲線確定相應(yīng)的結(jié)合時間。

        適配體與膠體金結(jié)合比例的研究:將10 μmol/L的核酸適配體于95℃金屬浴中加熱5 min,再冰浴10 min,然后分別稀釋為如下濃度梯度:1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 μmol/L。取60 μl膠體金溶液分別與20 μl上述濃度的適配體混合,在25℃下200 r/min搖床結(jié)合60 min,隨后每個樣品加入60 μl 400 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng),測定520 nm處的吸光度值,獲得吸光度與適配體濃度的關(guān)系曲線,根據(jù)這個曲線確定相應(yīng)的結(jié)合比例。

        1.3.5 鰻弧菌與膠體金-適配體復(fù)合物的結(jié)合時間研究

        取80 μl適配體-膠體金復(fù)合物與 20 μl濃度分別為 10、102、103、104、105CFU/ml鰻弧菌結(jié)合,于25℃下200 r/min搖床孵育結(jié)合不同時間,然后加入60 μl 400 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng),測定混合液在520 nm處的吸光度值,獲得吸光度與結(jié)合時間的關(guān)系曲線,根據(jù)該曲線確定相應(yīng)的結(jié)合時間。

        1.3.6 定量檢測研究

        將目標菌鰻弧菌用超純水分別稀釋為1、10、50、102、5×102、103、5×103、104、5×104和 105CFU/ml,然后取80 μl適配體-膠體金復(fù)合物分別與20 μl上述各濃度的鰻弧菌懸液結(jié)合,于25℃下200 r/min搖床孵育結(jié)合70 min,作為實驗組。另取上述20 μl超純水代替菌懸液作為對照組,與實驗組執(zhí)行相同操作。然后每個樣品中各加入60 μl 400 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng),混合液在520 nm處測定吸光度值,則鰻弧菌對應(yīng)的吸光度值=實驗組的吸光度值-對照組的吸光度值。以鰻弧菌濃度的對數(shù)(10為底)為橫坐標,以其吸光度值為縱坐標,作圖并進行線性擬合,可得到相應(yīng)的定量曲線及其擬合方程。

        1.3.7 海水樣品加標回收檢測的研究

        膠體金對鹽溶液敏感,少量鹽溶液就會導(dǎo)致膠體金的聚集變色,干擾實驗結(jié)果。而鰻弧菌可在海水環(huán)境下生存,樣品中經(jīng)常含有海水成分,因此海水鹽度對檢測結(jié)果有較大干擾,需要對樣品進行前處理。本研究先用能截留細菌的濾膜對海水樣品進行過濾,再用超純水將濾膜上的菌洗滌下來,經(jīng)此前處理后再進行檢測,以消除海水鹽度的干擾,并通過加標回收實驗進行驗證。具體方法如下:

        a.加標樣品的配制。用超純水將30‰海水晶配制為鹽度分別為0‰、40‰、60‰、70‰和80‰的海水,再用超純水將鰻弧菌稀釋至20、2×102、2×103、2×104CFU/ml。分別取上述菌懸液各 2 ml與2 ml上述海水樣品混合配制成加標樣品,此時加標樣品中的鹽度分別為0‰、20‰、30‰、35‰和40‰,鰻弧菌的濃度分別為10、102、103、104CFU/ml。

        b.樣品的前處理。取1 ml加標樣品用針式過濾器過濾,讓加標樣品中的菌被截留在濾膜上,然后將濾膜浸泡于4 ml超純水中用混勻儀振蕩5 min,使濾膜上的鰻弧菌脫落,取出濾膜,溶液13 000 r/min離心,去上清,菌沉淀再加入超純水4 ml洗滌1次,然后13 000 r/min離心,去上清,最后加入超純水1 ml重懸菌沉淀。

        c.檢測。按1.3.6中超純水中菌濃度的測定方法,對前處理后的菌懸液進行檢測,獲得海水加標樣品對應(yīng)的吸光度值。即實驗組取20 μl步驟b前處理后的菌懸液與80 μl膠體金-適配體復(fù)合物混合結(jié)合,之后加入60 μl、400 mmol/L NaCl使膠體金聚集變色;對照組取20 μl超純水代替實驗組中的菌懸液,與實驗組同樣操作。實驗組和對照組都各3個平行。樣品對應(yīng)的吸光度值=實驗組吸光度值-對照組吸光度值,回收率=回收量/加入量×100%。

        1.3.8 魚體樣品加標回收檢測的研究

        a.加標樣品的配制。將鰻鱺的鰓、胃、腎、表皮、血液和肌肉等組織器官取出并剪碎,分別稱取0.5 g,浸泡于5 ml的超純水中1 h,然后離心取上清制成相應(yīng)的組織懸液。分別取2 ml上述組織懸液,與2 ml濃度為20、2×102、2×103、2×104CFU/ml菌懸液混合,形成菌濃度分別為10、102、103、104CFU/ml的加標樣品。

        b.樣品的前處理。取1 ml上述組織的加標樣品用針式過濾器過濾,按1.3.7的步驟b進行前處理,最后獲得1 ml菌懸液。

        c.檢測。按1.3.7中步驟c的方法對前處理后的菌懸液進行檢測,獲得魚體組織加標樣品對應(yīng)的吸光度值。實驗組和對照組都各3個平行。樣品對應(yīng)的吸光度值=實驗組吸光度值-對照組吸光度值,回收率=回收量/加入量×100%

        1.3.9 統(tǒng)計分析

        所有實驗均至少3組平行,用t檢驗函數(shù)對實驗數(shù)據(jù)進行組間差異分析,P<0.05為顯著差異,P<0.01為極顯著差異。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 檢測原理

        核酸適配體能通過靜電吸附作用附著到膠體金(Au)顆粒表面,將膠體金包裹保護起來,從而使得膠體金在高鹽環(huán)境下不會發(fā)生聚集(圖1)。本研究采用對鰻弧菌有特異親和力的核酸適配體來包裹膠體金顆粒,當環(huán)境中存在鰻弧菌時,鰻弧菌會從膠體金表面奪走適配體,使膠體金顆粒裸露出來,從而在高鹽環(huán)境下發(fā)生聚集,溶液出現(xiàn)顏色變化和吸光度值的變化,而且溶液在特定波長520 nm下的吸光度值與鰻弧菌的濃度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系,從而可以通過測定A520來實現(xiàn)對鰻弧菌的定量檢測。

        Fig.1 Schematic illustration of colorimetric assay of Vibrio anguillarum based on AuNP and aptamer

        2.2 NaCl濃度對檢測吸光度的影響

        吸光度值隨著NaCl濃度的增加逐漸降低,在400 mmol/L以上后,吸光度值趨于平穩(wěn)(圖2)。說明高濃度的NaCl溶液會使膠體金顆粒聚集變色,吸光度值下降,但濃度達到一定閾值后,膠體金顆粒已完全聚集,再增加NaCl濃度,吸光度值也基本不再變動,因此后續(xù)都采用400 mmol/L的NaCl濃度。

        Fig.2 Effect of NaCl concentration

        2.3 檢測過程中吸收光譜的變化

        膠體金(Au)、膠體金與適配體結(jié)合形成復(fù)合物(Au+Apt)、膠體金-適配體復(fù)合物與鰻弧菌結(jié)合后(Au+Apt+Va),以及最后加入NaCl聚集變色后(Au+Apt+Va+NaCl)的4個階段,吸收光譜都較為相似,均在520 nm處出現(xiàn)相應(yīng)的吸收峰(圖3),說明適配體、菌、NaCl的加入并沒有改變膠體金的吸收峰位置,這與劉中成等[16]、劉長勇等[17]的研究結(jié)論是一致的。另外,從圖中還可以發(fā)現(xiàn),適配體的加入,保護了膠體金顆粒,使溶液的A520增加,細菌的加入則奪取了膠體金表面的適配體,使膠體金顆粒暴露,導(dǎo)致A520下降,而NaCl的加入則導(dǎo)致膠體金顆粒的聚集變色,導(dǎo)致A520的大幅下降。

        Fig.3 Absorption spectra

        2.4 特異性分析

        如圖4所示,菌濃度為0的是空白對照,在菌濃度為10~107CFU/ml區(qū)間,鰻弧菌的吸光度值都顯著高于其他5種菌(P<0.01),說明該方法對鰻弧菌有較好的特異性。不過,鰻弧菌的吸光度值在10~105CFU/ml區(qū)間是隨菌濃度升高而升高,在105~107CFU/ml區(qū)間則隨菌濃度升高而下降,且在105~107CFU/ml區(qū)間鰻弧菌的吸光度值與其他5種菌的差異變小,因此,對鰻弧菌相對較好的檢測范圍應(yīng)該是在105CFU/ml以內(nèi)。另外,圖5顯示,隨著鰻弧菌濃度的增加,膠體金溶液的顏色呈現(xiàn)出由紅變藍,再變紅的特性。在菌濃度10~102CFU/ml區(qū)間,膠體金溶液呈紅色,當菌濃度增加到103~105CFU/ml區(qū)間,膠體金溶液變?yōu)樗{色,且顏色逐漸加深,當菌濃度增加到106~107CFU/ml區(qū)間,膠體金溶液又變成淺紅色。說明膠體金的聚集變色作用在菌濃度10~105CFU/ml范圍中是隨菌濃度的增加逐步增強的,但在106CFU/ml以上這種聚集變色效果卻反而降低了。

        鰻弧菌能特異性識別并吸附膠體金-適配體復(fù)合物中的適配體,使膠體金顆粒裸露,并在NaCl作用下聚集變藍色,菌濃度越大,吸附的適配體越多,膠體金顆粒裸露的越多,聚集變色作用越明顯。在鰻弧菌菌濃度為10~102CFU/ml,由于菌濃度較低,聚集變色作用并不明顯,溶液還是呈現(xiàn)膠體金的紅色;當菌濃度達到103~105CFU/ml,聚集變色作用顯著,膠體金溶液變成藍色并隨菌濃度的增加而逐漸加深;當菌濃度增加到106~107CFU/ml,復(fù)合物中的適配體已完全被菌吸附,所有的膠體金顆粒已完全裸露,此時過量的鰻弧菌已不能起到聚集變色的效果,反而由于其具有的菌體蛋白質(zhì)和核酸,這些物質(zhì)反而會對膠體金顆粒起到一定保護作用,減弱膠體金顆粒的聚集變色作用,因此膠體金溶液的顏色又變成淺紅色。這種對膠體金的過量保護作用在一些蛋白質(zhì)的檢測中也有所報道[16,18]。

        Fig.5 Color changes of detection solution with the concentraitons of V.anguillarum from 10 to 107 CFU/ml

        2.5 膠體金-適配體復(fù)合物制備條件的優(yōu)化

        本文重點研究了復(fù)合物制備過程中膠體金與適配體的結(jié)合時間和結(jié)合比例。隨著膠體金與適配體結(jié)合時間的延長,吸光度值逐漸增大,在結(jié)合60 min后趨于平穩(wěn),不再明顯增加(圖6)。因此,后續(xù)選擇60 min 作為二者結(jié)合反應(yīng)的時間。

        圖7則顯示,隨適配體濃度升高,相應(yīng)的吸光度值也顯著上升,在適配體濃度到達2.4 μmol/L之后趨于平穩(wěn),不再顯著增加,說明此時膠體金顆粒已完全被適配體包裹,再增加適配體濃度已無顯著效果,因此后續(xù)膠體金-適配體復(fù)合物的制備采用60 μl的膠體金與20 μl 2.4μmol/L的適配體H1作為二者的結(jié)合比例。

        Fig.6 Effect of binding time of ampter and colloidal gold

        Fig.7 Effect of concentration of aptamer

        2.6 鰻弧菌與膠體金-適配體復(fù)合物的結(jié)合時間研究

        不同濃度的鰻弧菌與膠體金-適配體復(fù)合物混合后,隨著結(jié)合時間的增加,吸光度值均逐漸減小,并且都在70 min后趨于平穩(wěn)(圖8),說明鰻弧菌與復(fù)合物的反應(yīng)在70 min時已反應(yīng)完全,因此后續(xù)都選擇70 min作為鰻弧菌與復(fù)合物的結(jié)合反應(yīng)時間。

        Fig.8 Effect of binding time of V.anguillarum and Au-aptamer complex

        另外,隨著菌濃度的增加,溶液最終的吸光度值也是逐漸增加的。這可能是因為菌濃度越高,吸附的適配體也越多,裸露的膠體金顆粒也越多,加NaCl后的聚集變色作用也越強,因此溶液最終的吸光度值與菌濃度呈現(xiàn)正相關(guān)性。

        2.7 鰻弧菌的定量分析

        如圖9所示,鰻弧菌與膠體金-適配體復(fù)合物結(jié)合后,隨著鰻弧菌濃度增大,吸光度值也逐漸增大,且在濃度為1~105CFU/ml區(qū)間呈現(xiàn)出良好的的線性關(guān)系,線性擬合系數(shù)達到0.991 3,說明該檢測方法在1~105CFU/ml范圍可實現(xiàn)對鰻弧菌的定量檢測,最低檢測限為1 CFU/ml。

        Fig.9 Quantitative analysis of V.anguillarum

        2.8 海水樣品的檢測

        對不同鹽度的海水樣品進行檢測,鹽度為0的空白對照組,相對標準偏差為1.31%~2.11%,回收率為117.30%~126.08%,而有鹽度的實驗組,相對標準偏差為0.62%~3.05%,回收率為92.68%~130.47%(表1)。實驗組的波動略大。但該方法總體相對標準偏差均小于12%,符合相應(yīng)的檢測體系標準[19]。同時,根據(jù)2020年的《中華人民共和國藥典》中對微生物計數(shù)的要求,回收率要處于50%~200%范圍內(nèi)[20],采用該方法進行檢測的回收率均達到要求。因此該方法在實際檢測中是可行的,可用于海水等樣品中鰻弧菌的檢測。

        Table 1 Detection of V.anguillarum of seawater samples in recovery experiment

        2.9 魚體組織樣品的檢測

        不同鹽度的樣品,添加量為10 CFU/ml時,加標回收率是101.53%~148.46%,添加量為102CFU/ml時,加標回收率是129.48%~145.12%,添加量為103CFU/ml時,加標回收率是83.33%~136.56%,添加量為104CFU/ml時,加標回收率是133.48%~149.60%(表2)。根據(jù)2020年的《中華人民共和國藥典》中對微生物計數(shù)的要求,回收率要處于50%~200%范圍內(nèi),上述回收率均符合要求[19]。同時,該方法檢測海水樣品獲得的相對標準偏差均小于12%,符合檢測體系標準[20]。綜上所述,該檢測方法準確可靠,可用于水產(chǎn)品或食品中鰻弧菌的檢測。

        Table 2 Experimental results of labeling recovery of V.anguillarum from eel tissues

        3 結(jié)論

        利用鰻弧菌與其適配體有較高的親和特異性,鰻弧菌會將吸附在膠體金顆粒表面的適配體奪走,使膠體金顆粒裸露出來,并在高鹽條件下發(fā)生聚集變色,而且膠體金溶液在520 nm處的吸光度值與菌濃度呈現(xiàn)較好線性關(guān)系。本文基于此原理,對NaCl濃度、適配體與膠體金的結(jié)合時間、結(jié)合比例等關(guān)鍵因素進行了研究優(yōu)化,建立了比色法快速檢測鰻弧菌的方法。該方法特異性好、穩(wěn)定性高、檢測過程簡單快捷,在1~105CFU/ml范圍內(nèi)可實現(xiàn)對鰻弧菌的定量檢測,最低檢測限為1 CFU/ml,體現(xiàn)出了較好的應(yīng)用前景。

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