黃將遠 鄭 江 ** 薄 軍 徐曉津 譚 英

（1）集美大學水產(chǎn)學院，廈門 361021；2）鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，廈門 361021；3）自然資源部海洋第三研究所，廈門 361005）

鰻弧菌（Vibrio anguillarum）是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要條件致病菌，當養(yǎng)殖環(huán)境惡化或機體受創(chuàng)時，魚類等養(yǎng)殖品種極易感染鰻弧菌等病原菌，出現(xiàn)體表潰爛出血、腸黏膜脫落、肝臟壞死，甚至出現(xiàn)全身性組織病變等癥狀，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［1-5］。對鰻弧菌進行快速的檢測鑒定是其病害防治的前提和基礎(chǔ)。目前對弧菌的檢測方法主要有微生物培養(yǎng)法、分子生物學等方法。微生物培養(yǎng)法存在耗時耗力、難以定量等問題［6］，分子生物學法則成本較高、不能對結(jié)果進行直觀判定、存在不同程度的假陽性問題［7］。因此，開發(fā)更為理想的鰻弧菌檢測技術(shù)就顯得十分必要。

核酸適配體（aptamer）是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)篩選出的一類能與靶目標特異性結(jié)合的寡核苷酸分子［8-9］。與傳統(tǒng)抗體相比，核酸適配體具有高特異性、高親和力、易合成、易修飾和穩(wěn)定性好等優(yōu)點［10-11］，在疾病診斷與治療、食品安全檢測、細菌檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用［12-15］。

本文將鰻弧菌的核酸適配體與膠體金結(jié)合形成相應(yīng)的檢測復(fù)合物，利用鰻弧菌可特異性地結(jié)合競爭檢測復(fù)合物中的核酸適配體，從而釋放出有特定顏色的膠體金顆粒，建立了一種可快速檢測鰻弧菌的比色法。文中對該方法的原理、檢測特異性、檢測復(fù)合物的制備條件、定量檢測效果等方面進行了研究和探討，相關(guān)成果對于鰻弧菌的病害防治以及核酸適配體的應(yīng)用開發(fā)都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

粒徑為20 nm膠體金溶液，湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；核酸適配體H1（5'-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCTCCTACTGACCACCCC GGCTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'），為實驗室前期篩選獲得的鰻弧菌核酸適配體［1］，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用超純水配制成濃度為10 μmol/L的貯存液，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫会樖竭^濾器50 mm，上海新亞微孔濾膜公司；濾膜，上海新亞微孔濾膜公司，直徑50 mm，孔徑0.22 μm；海水晶，江西鹽通科技有限公司，鹽度30‰，可用于配制不同鹽度的海水。

金屬浴TU-10，海一恒科技有限公司；純水機Smart-RO15，上海和泰儀器有限公司；高速臺式離心機TGL-16C，上海安亭科學儀器廠；全波長酶標儀ReadMax2100P，上海閃耀生物科技有限公司；可調(diào)式混勻儀MX-S，北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份有限公司。

1.2 細菌和培養(yǎng)基

鰻弧菌、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）均由集美大學病原微生物實驗室提供。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB培養(yǎng)基），用于鰻弧菌、溶藻弧菌、遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的培養(yǎng)；LB 培養(yǎng)基，用于銅綠假單胞菌和變形假單胞菌的培養(yǎng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 NaCl濃度對檢測吸光度的影響

取濃度為2.4 μmol/L適配體20 μl與60 μl膠體金溶液結(jié)合，在25℃下、200 r/min搖床孵育60 min，將所得復(fù)合物與20 μl用超純水懸浮的105CFU/ml的鰻弧菌混合，再在25℃下、200 r/min搖床孵育結(jié)合70 min，然后分別與60 μl濃度為100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng)，測定混合液在520 nm處的吸光度值（A520），獲得吸光度與NaCl濃度的關(guān)系曲線，以確定NaCl的濃度。

1.3.2 檢測過程中吸收光譜的變化

整個檢測過程經(jīng)歷了如下4個階段：膠體金（Au）→膠體金+核酸適配體（Au+Apt）→膠體金+核酸適配體+鰻弧菌（Au+Apt+Va）→膠體金+核酸適配體+鰻弧菌+NaCl（Au+Apt+Va+NaCl），分別對這4個階段的吸收光譜進行分析檢測。具體如下所述。取60 μl膠體金作為樣品1（Au）。60 μl膠體金與20 μl濃度為2.4 μmol/L的適配體H1在25℃下、200 r/min搖床孵育結(jié)合60 min，作為樣品2（Au+Apt）。樣品2中加入20 μl濃度為104CFU/ml的鰻弧菌，在25℃下、200 r/min搖床孵育70 min，得到樣品3（Au+Apt+Va）。樣品3中加入60 μl濃度為400 mmol/L的NaCl得到樣品4（Au+Apt+Va+NaCl）。用超純水分別將樣品1～3稀釋到總體積為160 μl，與樣品4的總體積一樣，以排除體積不同導(dǎo)致的干擾，然后用酶標儀在波長320～700 nm范圍內(nèi)掃描這4個樣品獲得相應(yīng)的吸收光譜圖。

1.3.3 特異性分析

將2.4 μmol/L的核酸適配體于95℃金屬浴中加熱5 min，再冰浴10 min。然后取20 μl適配體與60 μl膠體金結(jié)合，配制成80 μl適配體-膠體金復(fù)合物。再用超純水將6種細菌（鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、變形假單胞菌、銅綠假單胞菌、遲鈍愛德華氏菌和溶藻弧菌）分別稀釋至10～107CFU/ml，制成菌懸液，然后各取20 μl與80 μl的膠體金-適配體復(fù)合物結(jié)合，作為實驗組；另取20 μl的超純水代替菌懸液，與80 μl的膠體金-適配體結(jié)合，作為對照組。實驗組和對照組一同在25℃、200 r/min搖床孵育結(jié)合70 min，隨后離心取上清液，與60 μl、400 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng)，然后測定混合液在520 nm處的吸光度值。由于實驗組復(fù)合物中的適配體會被鰻弧菌奪取，導(dǎo)致膠體金暴露，加入NaCl后，暴露的膠體金顆粒就會在NaCl的作用下發(fā)生聚集作用，導(dǎo)致溶液的吸光度值發(fā)生變化，而對照組沒有菌，也沒有相應(yīng)的聚集作用，因此鰻弧菌對應(yīng)的吸光度值=實驗組的吸光度值－對照組的吸光度值。

1.3.4 膠體金-適配體復(fù)合物的制備條件優(yōu)化

適配體與膠體金結(jié)合時間的優(yōu)化：2.4 μmol/L的核酸適配體于95℃金屬浴中加熱5 min，再冰浴10 min，然后取20 μl該適配體與60 μl的膠體金混合，于25℃下200 r/min搖床結(jié)合不同時間，之后分別加入60 μl 400 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng)，再在520 nm處檢測溶液的吸光度值，繪制吸光度和結(jié)合時間的關(guān)系曲線，根據(jù)這個曲線確定相應(yīng)的結(jié)合時間。

適配體與膠體金結(jié)合比例的研究：將10 μmol/L的核酸適配體于95℃金屬浴中加熱5 min，再冰浴10 min，然后分別稀釋為如下濃度梯度：1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 μmol/L。取60 μl膠體金溶液分別與20 μl上述濃度的適配體混合，在25℃下200 r/min搖床結(jié)合60 min，隨后每個樣品加入60 μl 400 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng)，測定520 nm處的吸光度值，獲得吸光度與適配體濃度的關(guān)系曲線，根據(jù)這個曲線確定相應(yīng)的結(jié)合比例。

1.3.5 鰻弧菌與膠體金-適配體復(fù)合物的結(jié)合時間研究

取80 μl適配體-膠體金復(fù)合物與 20 μl濃度分別為 10、102、103、104、105CFU/ml鰻弧菌結(jié)合，于25℃下200 r/min搖床孵育結(jié)合不同時間，然后加入60 μl 400 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng)，測定混合液在520 nm處的吸光度值，獲得吸光度與結(jié)合時間的關(guān)系曲線，根據(jù)該曲線確定相應(yīng)的結(jié)合時間。

1.3.6 定量檢測研究

將目標菌鰻弧菌用超純水分別稀釋為1、10、50、102、5×102、103、5×103、104、5×104和 105CFU/ml，然后取80 μl適配體-膠體金復(fù)合物分別與20 μl上述各濃度的鰻弧菌懸液結(jié)合，于25℃下200 r/min搖床孵育結(jié)合70 min，作為實驗組。另取上述20 μl超純水代替菌懸液作為對照組，與實驗組執(zhí)行相同操作。然后每個樣品中各加入60 μl 400 mmol/L的NaCl溶液混合反應(yīng)，混合液在520 nm處測定吸光度值，則鰻弧菌對應(yīng)的吸光度值=實驗組的吸光度值－對照組的吸光度值。以鰻弧菌濃度的對數(shù)（10為底）為橫坐標，以其吸光度值為縱坐標，作圖并進行線性擬合，可得到相應(yīng)的定量曲線及其擬合方程。

1.3.7 海水樣品加標回收檢測的研究

膠體金對鹽溶液敏感，少量鹽溶液就會導(dǎo)致膠體金的聚集變色，干擾實驗結(jié)果。而鰻弧菌可在海水環(huán)境下生存，樣品中經(jīng)常含有海水成分，因此海水鹽度對檢測結(jié)果有較大干擾，需要對樣品進行前處理。本研究先用能截留細菌的濾膜對海水樣品進行過濾，再用超純水將濾膜上的菌洗滌下來，經(jīng)此前處理后再進行檢測，以消除海水鹽度的干擾，并通過加標回收實驗進行驗證。具體方法如下：

a.加標樣品的配制。用超純水將30‰海水晶配制為鹽度分別為0‰、40‰、60‰、70‰和80‰的海水，再用超純水將鰻弧菌稀釋至20、2×102、2×103、2×104CFU/ml。分別取上述菌懸液各 2 ml與2 ml上述海水樣品混合配制成加標樣品，此時加標樣品中的鹽度分別為0‰、20‰、30‰、35‰和40‰，鰻弧菌的濃度分別為10、102、103、104CFU/ml。

b.樣品的前處理。取1 ml加標樣品用針式過濾器過濾，讓加標樣品中的菌被截留在濾膜上，然后將濾膜浸泡于4 ml超純水中用混勻儀振蕩5 min，使濾膜上的鰻弧菌脫落，取出濾膜，溶液13 000 r/min離心，去上清，菌沉淀再加入超純水4 ml洗滌1次，然后13 000 r/min離心，去上清，最后加入超純水1 ml重懸菌沉淀。

c.檢測。按1.3.6中超純水中菌濃度的測定方法，對前處理后的菌懸液進行檢測，獲得海水加標樣品對應(yīng)的吸光度值。即實驗組取20 μl步驟b前處理后的菌懸液與80 μl膠體金-適配體復(fù)合物混合結(jié)合，之后加入60 μl、400 mmol/L NaCl使膠體金聚集變色；對照組取20 μl超純水代替實驗組中的菌懸液，與實驗組同樣操作。實驗組和對照組都各3個平行。樣品對應(yīng)的吸光度值=實驗組吸光度值－對照組吸光度值，回收率=回收量/加入量×100%。

1.3.8 魚體樣品加標回收檢測的研究

a.加標樣品的配制。將鰻鱺的鰓、胃、腎、表皮、血液和肌肉等組織器官取出并剪碎，分別稱取0.5 g，浸泡于5 ml的超純水中1 h，然后離心取上清制成相應(yīng)的組織懸液。分別取2 ml上述組織懸液，與2 ml濃度為20、2×102、2×103、2×104CFU/ml菌懸液混合，形成菌濃度分別為10、102、103、104CFU/ml的加標樣品。

b.樣品的前處理。取1 ml上述組織的加標樣品用針式過濾器過濾，按1.3.7的步驟b進行前處理，最后獲得1 ml菌懸液。

c.檢測。按1.3.7中步驟c的方法對前處理后的菌懸液進行檢測，獲得魚體組織加標樣品對應(yīng)的吸光度值。實驗組和對照組都各3個平行。樣品對應(yīng)的吸光度值=實驗組吸光度值－對照組吸光度值，回收率=回收量/加入量×100%

1.3.9 統(tǒng)計分析

所有實驗均至少3組平行，用t檢驗函數(shù)對實驗數(shù)據(jù)進行組間差異分析，P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

核酸適配體能通過靜電吸附作用附著到膠體金（Au）顆粒表面，將膠體金包裹保護起來，從而使得膠體金在高鹽環(huán)境下不會發(fā)生聚集（圖1）。本研究采用對鰻弧菌有特異親和力的核酸適配體來包裹膠體金顆粒，當環(huán)境中存在鰻弧菌時，鰻弧菌會從膠體金表面奪走適配體，使膠體金顆粒裸露出來，從而在高鹽環(huán)境下發(fā)生聚集，溶液出現(xiàn)顏色變化和吸光度值的變化，而且溶液在特定波長520 nm下的吸光度值與鰻弧菌的濃度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，從而可以通過測定A520來實現(xiàn)對鰻弧菌的定量檢測。

Fig.1 Schematic illustration of colorimetric assay of Vibrio anguillarum based on AuNP and aptamer

2.2 NaCl濃度對檢測吸光度的影響

吸光度值隨著NaCl濃度的增加逐漸降低，在400 mmol/L以上后，吸光度值趨于平穩(wěn)（圖2）。說明高濃度的NaCl溶液會使膠體金顆粒聚集變色，吸光度值下降，但濃度達到一定閾值后，膠體金顆粒已完全聚集，再增加NaCl濃度，吸光度值也基本不再變動，因此后續(xù)都采用400 mmol/L的NaCl濃度。

Fig.2 Effect of NaCl concentration

2.3 檢測過程中吸收光譜的變化

膠體金（Au）、膠體金與適配體結(jié)合形成復(fù)合物（Au+Apt）、膠體金-適配體復(fù)合物與鰻弧菌結(jié)合后（Au+Apt+Va），以及最后加入NaCl聚集變色后（Au+Apt+Va+NaCl）的4個階段，吸收光譜都較為相似，均在520 nm處出現(xiàn)相應(yīng)的吸收峰（圖3），說明適配體、菌、NaCl的加入并沒有改變膠體金的吸收峰位置，這與劉中成等［16］、劉長勇等［17］的研究結(jié)論是一致的。另外，從圖中還可以發(fā)現(xiàn)，適配體的加入，保護了膠體金顆粒，使溶液的A520增加，細菌的加入則奪取了膠體金表面的適配體，使膠體金顆粒暴露，導(dǎo)致A520下降，而NaCl的加入則導(dǎo)致膠體金顆粒的聚集變色，導(dǎo)致A520的大幅下降。

Fig.3 Absorption spectra

2.4 特異性分析

如圖4所示，菌濃度為0的是空白對照，在菌濃度為10～107CFU/ml區(qū)間，鰻弧菌的吸光度值都顯著高于其他5種菌（P＜0.01），說明該方法對鰻弧菌有較好的特異性。不過，鰻弧菌的吸光度值在10～105CFU/ml區(qū)間是隨菌濃度升高而升高，在105～107CFU/ml區(qū)間則隨菌濃度升高而下降，且在105～107CFU/ml區(qū)間鰻弧菌的吸光度值與其他5種菌的差異變小，因此，對鰻弧菌相對較好的檢測范圍應(yīng)該是在105CFU/ml以內(nèi)。另外，圖5顯示，隨著鰻弧菌濃度的增加，膠體金溶液的顏色呈現(xiàn)出由紅變藍，再變紅的特性。在菌濃度10～102CFU/ml區(qū)間，膠體金溶液呈紅色，當菌濃度增加到103～105CFU/ml區(qū)間，膠體金溶液變?yōu)樗{色，且顏色逐漸加深，當菌濃度增加到106～107CFU/ml區(qū)間，膠體金溶液又變成淺紅色。說明膠體金的聚集變色作用在菌濃度10～105CFU/ml范圍中是隨菌濃度的增加逐步增強的，但在106CFU/ml以上這種聚集變色效果卻反而降低了。

鰻弧菌能特異性識別并吸附膠體金-適配體復(fù)合物中的適配體，使膠體金顆粒裸露，并在NaCl作用下聚集變藍色，菌濃度越大，吸附的適配體越多，膠體金顆粒裸露的越多，聚集變色作用越明顯。在鰻弧菌菌濃度為10～102CFU/ml，由于菌濃度較低，聚集變色作用并不明顯，溶液還是呈現(xiàn)膠體金的紅色；當菌濃度達到103～105CFU/ml，聚集變色作用顯著，膠體金溶液變成藍色并隨菌濃度的增加而逐漸加深；當菌濃度增加到106～107CFU/ml，復(fù)合物中的適配體已完全被菌吸附，所有的膠體金顆粒已完全裸露，此時過量的鰻弧菌已不能起到聚集變色的效果，反而由于其具有的菌體蛋白質(zhì)和核酸，這些物質(zhì)反而會對膠體金顆粒起到一定保護作用，減弱膠體金顆粒的聚集變色作用，因此膠體金溶液的顏色又變成淺紅色。這種對膠體金的過量保護作用在一些蛋白質(zhì)的檢測中也有所報道［16，18］。

Fig.5 Color changes of detection solution with the concentraitons of V.anguillarum from 10 to 107 CFU/ml

2.5 膠體金-適配體復(fù)合物制備條件的優(yōu)化

本文重點研究了復(fù)合物制備過程中膠體金與適配體的結(jié)合時間和結(jié)合比例。隨著膠體金與適配體結(jié)合時間的延長，吸光度值逐漸增大，在結(jié)合60 min后趨于平穩(wěn)，不再明顯增加（圖6）。因此，后續(xù)選擇60 min 作為二者結(jié)合反應(yīng)的時間。

圖7則顯示，隨適配體濃度升高，相應(yīng)的吸光度值也顯著上升，在適配體濃度到達2.4 μmol/L之后趨于平穩(wěn)，不再顯著增加，說明此時膠體金顆粒已完全被適配體包裹，再增加適配體濃度已無顯著效果，因此后續(xù)膠體金-適配體復(fù)合物的制備采用60 μl的膠體金與20 μl 2.4μmol/L的適配體H1作為二者的結(jié)合比例。

Fig.6 Effect of binding time of ampter and colloidal gold

Fig.7 Effect of concentration of aptamer

2.6 鰻弧菌與膠體金-適配體復(fù)合物的結(jié)合時間研究

不同濃度的鰻弧菌與膠體金-適配體復(fù)合物混合后，隨著結(jié)合時間的增加，吸光度值均逐漸減小，并且都在70 min后趨于平穩(wěn)（圖8），說明鰻弧菌與復(fù)合物的反應(yīng)在70 min時已反應(yīng)完全，因此后續(xù)都選擇70 min作為鰻弧菌與復(fù)合物的結(jié)合反應(yīng)時間。

Fig.8 Effect of binding time of V.anguillarum and Au-aptamer complex

另外，隨著菌濃度的增加，溶液最終的吸光度值也是逐漸增加的。這可能是因為菌濃度越高，吸附的適配體也越多，裸露的膠體金顆粒也越多，加NaCl后的聚集變色作用也越強，因此溶液最終的吸光度值與菌濃度呈現(xiàn)正相關(guān)性。

2.7 鰻弧菌的定量分析

如圖9所示，鰻弧菌與膠體金-適配體復(fù)合物結(jié)合后，隨著鰻弧菌濃度增大，吸光度值也逐漸增大，且在濃度為1～105CFU/ml區(qū)間呈現(xiàn)出良好的的線性關(guān)系，線性擬合系數(shù)達到0.991 3，說明該檢測方法在1～105CFU/ml范圍可實現(xiàn)對鰻弧菌的定量檢測，最低檢測限為1 CFU/ml。

Fig.9 Quantitative analysis of V.anguillarum

2.8 海水樣品的檢測

對不同鹽度的海水樣品進行檢測，鹽度為0的空白對照組，相對標準偏差為1.31%～2.11%，回收率為117.30%～126.08%，而有鹽度的實驗組，相對標準偏差為0.62%～3.05%，回收率為92.68%～130.47%（表1）。實驗組的波動略大。但該方法總體相對標準偏差均小于12%，符合相應(yīng)的檢測體系標準［19］。同時，根據(jù)2020年的《中華人民共和國藥典》中對微生物計數(shù)的要求，回收率要處于50%～200%范圍內(nèi)［20］，采用該方法進行檢測的回收率均達到要求。因此該方法在實際檢測中是可行的，可用于海水等樣品中鰻弧菌的檢測。

Table 1 Detection of V.anguillarum of seawater samples in recovery experiment

2.9 魚體組織樣品的檢測

不同鹽度的樣品，添加量為10 CFU/ml時，加標回收率是101.53%～148.46%，添加量為102CFU/ml時，加標回收率是129.48%～145.12%，添加量為103CFU/ml時，加標回收率是83.33%～136.56%，添加量為104CFU/ml時，加標回收率是133.48%～149.60%（表2）。根據(jù)2020年的《中華人民共和國藥典》中對微生物計數(shù)的要求，回收率要處于50%～200%范圍內(nèi)，上述回收率均符合要求［19］。同時，該方法檢測海水樣品獲得的相對標準偏差均小于12%，符合檢測體系標準［20］。綜上所述，該檢測方法準確可靠，可用于水產(chǎn)品或食品中鰻弧菌的檢測。

Table 2 Experimental results of labeling recovery of V.anguillarum from eel tissues

3 結(jié)論

利用鰻弧菌與其適配體有較高的親和特異性，鰻弧菌會將吸附在膠體金顆粒表面的適配體奪走，使膠體金顆粒裸露出來，并在高鹽條件下發(fā)生聚集變色，而且膠體金溶液在520 nm處的吸光度值與菌濃度呈現(xiàn)較好線性關(guān)系。本文基于此原理，對NaCl濃度、適配體與膠體金的結(jié)合時間、結(jié)合比例等關(guān)鍵因素進行了研究優(yōu)化，建立了比色法快速檢測鰻弧菌的方法。該方法特異性好、穩(wěn)定性高、檢測過程簡單快捷，在1～105CFU/ml范圍內(nèi)可實現(xiàn)對鰻弧菌的定量檢測，最低檢測限為1 CFU/ml，體現(xiàn)出了較好的應(yīng)用前景。