唐崟梅,李 琪,李海洋,林亞秋,王 永,向 華,黃 煉*,朱江江*

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省/教育部重點實驗室,成都 610207;2.西南民族大學青藏高原研究院,成都 610207)

隨著物質(zhì)水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改善,人們對畜肉類的需求也愈加多樣。山羊肉較牛肉的肉質(zhì)要細嫩,較豬肉的脂肪、膽固醇含量更少,因其肉營養(yǎng)價值高及獨特的風味更加受青睞,于是居民對羊肉品質(zhì)有進一步的要求[1]。而山羊肌內(nèi)脂肪含量與肉質(zhì)及口感密切相關(guān),深入研究其肌內(nèi)脂肪沉積的分子機制,對改善山羊肉質(zhì)具有重要意義[2]。

脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白家族(fatty acid transport proteins, FATPs)對脂肪酸代謝具有調(diào)節(jié)作用,對肌內(nèi)脂肪沉積具有重要作用[3]。FATPs又稱為溶質(zhì)運載蛋白家族27(solute carrier family 27, SLC27),是1994年由Schaffer和Lodish[4]在小鼠的3T3-L1脂肪細胞中發(fā)現(xiàn),在山羊上有6個脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白成員(FATP1-FATP6)[5]。而其中,脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白2(fatty acid transport protein 2, FATP2)又稱為溶質(zhì)運載蛋白家族成員2(solute carrier family 27,member 2, SLC27A2),對長鏈脂肪酸酯化為甘油三酯至關(guān)重要:在合成代謝途徑中,它作為極長鏈的酰基-CoA合成酶的作用是必需的[6-7];同時FATP2也可以發(fā)揮脂肪酸轉(zhuǎn)運的作用,從而介導細胞對長鏈和超長鏈脂肪酸的吸收[8]。

目前發(fā)現(xiàn),FATP2有兩個剪接變異體為FATP2a和FATP2b,分別定位于細胞膜和過氧化物酶體,且這兩種剪接變異體都參與了外源脂肪酸的攝取和轉(zhuǎn)運[9]。Veglia等[10]發(fā)現(xiàn),多形核髓系抑制細胞的FATP2可通過介導花生四烯酸攝取參與前列腺素E2合成,引起細胞脂肪蓄積;在小鼠免疫抑制細胞中靶向FATP2可以阻斷脂質(zhì)的積累。Chen等[11]證明了敲低FATP2基因可抑制非小細胞肺癌脂質(zhì)沉積。Adeshakin等[12]利用藥物阻斷骨髓源性抑制細胞中FATP2基因的表達,減少了其脂質(zhì)積累。Ran等[13]利用穿心蓮內(nèi)酯處理LO2細胞后FATP2的表達降低導致細胞內(nèi)脂滴減少,過表達FATP2后消弱了由于穿心蓮內(nèi)酯造成的脂肪酸攝取減少。Perez等[14]通過建立FATP2基因缺失小鼠模型,發(fā)現(xiàn)FATP2基因缺失小鼠相比于正常小鼠體重減輕,血清甘油三酯降低,飲食中脂肪酸吸收減弱。由此可見,FATP2基因在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用。在以往的研究中,Uchiyama等[15]于1996年克隆了編碼大鼠SLC27A2基因的cDNA;王濤[16]于2005年分離克隆了豬SLC27A2基因,并將其作為影響酮體和生長性狀的候選基因進行研究;然而FATP2基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)沉積中的作用未見報道。

Hausman等[17]于1984年初次從仔豬半腱肌中分離出肌內(nèi)前體脂肪細胞,為家畜肌內(nèi)脂質(zhì)沉積調(diào)控提供了極大的參考意義。2018年,Xiong等[18]從簡州大耳羊背最長肌中利用膠原酶消化酶分離了肌內(nèi)前體脂肪細胞,為解析山羊肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控機理提供了研究基礎(chǔ)。本試驗以簡州大耳羊為研究對象,克隆FATP2基因序列,探討其在不同分化時期及不同組織中的表達水平,利用生物信息學等方法預測其功能,并進一步用RNA干擾技術(shù)在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞中初步驗證其功能。這些結(jié)果將為進一步揭示FATP2在調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪形成中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年在西南民族大學青藏高原研究院完成。從四川省簡陽市大哥大牧業(yè)有限公司隨機選取12只健康的10月齡簡州大耳羊公羊,在清晨于實驗室空腹屠宰,并用DEPC水洗凈之后,立即采集心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、大腸(盲腸)及小腸(回腸)組織樣本,洗凈分裝后凍存至液氮罐中。

主要試劑:反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑來自Thermo公司,DH5α感受態(tài)細胞、DNA回收試劑盒、DNA聚合酶來自北京天根生化科技有限公司,pMD-19 T Vector來自TaKaRa公司,2×5 Super PCR Mix來自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司,組織細胞甘油三酯酶法測定試劑盒來自北京普利萊基因有限公司,II型膠原酶來自Sigma公司,Si-RNA 來自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司,Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix來自南京諾唯贊生物有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 山羊FATP2基因克隆與生物信息學分析 使用Trizol法提取總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書獲得cDNA,選擇GenBank中已公布的山羊FATP2預測基因(XM_005 685 790.3)作為參考序列,利用Primer 5設(shè)計FATP2基因特異性引物(上游引物:5′-TCCTTCTGCCAGAGATCCC-3′,下游引物:5′-AAAATAACACCCTGCCTCTAA-3′)。采用Touchdown PCR法進行擴增,擴增體系為:10×PCR Buffer (Mg2+free) 2 μL,MgCl2(25 mmol·L-1) 3.2 μL,LA Taq (5 U·μL-1) 0.3 μL,cDNA 1.5 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 11 μL,共20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,66 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min 10 s,15個循環(huán);52 ℃ 30 s,15個循環(huán);72 ℃ 10 min。整個體系中從第二次循環(huán)開始,每個循環(huán)降1 ℃。PCR產(chǎn)物用10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用膠回收試劑盒回收目的片段,構(gòu)建pClone007載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性菌落進行PCR鑒定(與基因克隆PCR條件相同),送至成都擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。

獲得目的基因序列后,使用NCBI中Blast程序?qū)Σ煌锓N的FATP2基因序列進行比對,使用在線軟件對FATP2基因進行生物信息學分析(表1)。

表1 在線分析軟件及內(nèi)容Table 1 Online analysis softwares and contents

1.2.2 山羊原代肌內(nèi)前體脂肪細胞分離、培養(yǎng)與傳代 山羊原代肌內(nèi)前體脂肪細胞分離培養(yǎng)采用實驗室建立的培養(yǎng)方法[19]。將2日齡簡州大耳羊(n=2)饑餓1 d,用新潔爾滅清洗3次,75%酒精擦拭后,頸動脈放血處死,在無菌細胞間采集背最長肌組織,PBS清洗3次,按1∶1混合后,在超凈工作臺修剪后加入II型膠原酶,37 ℃消化1 h,每隔5 min輕輕振蕩1次。加入等體積含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化,經(jīng)過200目篩網(wǎng)過濾后將濾液分裝到離心管中,2 000 r·min-1離心5 min。棄上清,加入紅細胞裂解液吹散沉淀,靜置5 min,再次離心棄上清,加入完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM/F-12的培養(yǎng)基)重懸沉淀,吸取適量重懸液接種于60 mm培養(yǎng)皿中,即獲得原代肌內(nèi)前體脂肪細胞。將其置于37 ℃,50 mL·L-1CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),融合度達到80%開始傳代,將細胞傳至F3代,接種于六孔板,生長達80%時進行轉(zhuǎn)染試驗。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 參照 Li-pofectamine?3000 試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。本試驗以轉(zhuǎn)入SI-FATP2作為試驗組,轉(zhuǎn)入SI-NC作為對照組。轉(zhuǎn)染前棄掉完全培養(yǎng)液,PBS清洗3次,每孔加入900 μL Opti饑餓處理4 h。吸取88 μL Opit與6 μL lip3000、6 μLSI-FATP2配置預混液,靜置15 min后轉(zhuǎn)入細胞,放入37 ℃、50 mL·L-1CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),6 h后更換終濃度為含50 μmol·L-1油酸的完全培養(yǎng)基48 h后收集細胞[16]。干擾序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成(SI-FATP2序列:S: GAAGGCAAUAUUGGAUUUATT,A : UAAAUCCAAUAUUGCCUUCTT;SI-NC序列:S:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT,A:ACGUGACAC-GUUCGGAGAATT)。

1.2.4 細胞總RNA提取及RT-qPCR 使用Trizol法提取收集細胞的總RNA,利用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及 OD260 nm/OD280 nm,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA,稀釋2倍,存放于-20 ℃?zhèn)溆谩＠肞rimerPremier 5.0軟件設(shè)計定量引物(表2),干擾FATP2后檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達,UXT基因作為試驗的內(nèi)參基因。RT-qPCR反應(yīng)體系:cDNA稀釋液1 μL,上、下游引物各0.2 μL,熒光染料(Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix)5 μL,ddH2O 3.6 μL。RT-qPCR程序:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán)。每個待測樣本設(shè)3個生物學重復和3個技術(shù)重復。

表2 RT-qPCR引物信息Table 2 Primers information for RT-qPCR

1.2.5 Bodipy染色和甘油三酯含量測定 利用Bodipy染色法觀察干擾FATP2后山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞脂滴生成的變化情況。肌內(nèi)前體脂肪細胞接種于六孔板,干擾FATP2 2 d后棄去培養(yǎng)基,PBS清洗3次,10%甲醛固定30 min,吸棄甲醛,PBS清洗3次,加入1 mL Bodipy工作液(濃度為1 mg·mL-1的Bodipy儲存液,用PBS按照1∶500稀釋即為工作液)避光孵育30 min,棄去Bodipy工作液后使用PBS清洗數(shù)次,加入1 mL DAPI工作液(與Bodipy工作液制備方法相同)避光孵育10 min,棄去DAPI工作液后用PBS清洗數(shù)次于顯微鏡下觀察并拍照。按照甘油三酯測定試劑盒的說明書進行操作[20],使用酶標儀測定在波長為550 nm處的吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 實時熒光定量PCR以泛表達轉(zhuǎn)錄子(ubiquitously express transcript,UXT)為內(nèi)參基因,使用2-△△Ct法進行分析,其中△△Ct=[(Ctgene-CtUXT)]試驗組-[(Ctgene-CtUXT)]對照組。本研究中所有的結(jié)果數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示,顯著性檢驗使用Graphpad prism 8.0軟件中的One-way ANOVA(and nonparametric or mixed)分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著;利用Graphpad prism 8.0繪圖,試驗設(shè)置3個生物學重復,3個技術(shù)重復。

2 結(jié) 果

2.1 山羊FATP2基因克隆與生物信息學分析

本試驗以簡州大耳羊肝臟和腎臟組織cDNA為模板,通過RT-PCR擴增得到山羊FATP2基因序列2 335 bp,其中CDS區(qū)1 863 bp,5′UTR 188 bp,3′UTR 284 bp,編碼621個氨基酸(圖1a)。將FATP2基因氨基酸序列與其他各物種氨基酸相似性對比,氨基酸相似性如圖1b,山羊與綿羊的相似性最高為99.03%,其次是牛和水牛,分別為95.97%和95.65%,與黑猩猩、虎鯨、貓、人和雪貂的相似性分別是85.16%、85.97%、87.10%、85.48%、84.03%。采用Mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果如圖1c所示,山羊FATP2與綿羊的親緣度最高,其次為牛、豬、貓、人、非洲野驢、小鼠、褐家鼠。根據(jù)山羊FATP2蛋白序列對其進行蛋白理化性質(zhì)分析,預測其蛋白分子式為C3184H4974N856O892S25,分子量為70.319 22 ku,理論等電點為8.72,體外半衰期為30 h,脂溶系數(shù)為93.52,不穩(wěn)定系數(shù)為37.91,為穩(wěn)定型蛋白。使用NetPhos 3.1 Server在線軟件對FATP2蛋白磷酸化位點進行分析,如圖2a所示,山羊FATP2蛋白具有Serine(絲氨酸)、Threonine(蘇氨酸)、Tyrosine(酪氨酸)磷酸化位點,共49個磷酸化位點。應(yīng)用ProtScale在線工具分析山羊FATP2蛋白的疏水性/親水性,由該蛋白的理化性質(zhì)和圖2d推測,山羊FATP2蛋白為親水性蛋白,信號肽預測分析結(jié)果顯示(圖2b),山羊FATP2蛋白含有Sec信號肽(Sec/SPI),可能屬于分泌型蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)預測顯示(圖2c),山羊FATP2蛋白具有3個跨膜結(jié)構(gòu)。FATP2蛋白二級結(jié)構(gòu)預測顯示,該蛋白含有α-螺旋38.39%,β折疊7.90%,無規(guī)則卷曲33.71%。不同物種FATP2蛋白三級結(jié)構(gòu)預測顯示(圖3a),山羊和綿羊的三級結(jié)構(gòu)相似,與牛、人的三級結(jié)構(gòu)略顯不同。山羊FATP2蛋白相互作用預測分析結(jié)果顯示(圖3b),FATP2蛋白可能與ECH1、AGXT、EHHADH、ACOX3、DAO、ECL2等蛋白存在相互作用。

a. FATP2基因目的片段擴增(M. DNA相對分子質(zhì)量標準;1. FATP2基因擴增產(chǎn)物);b. FATP2氨基酸相似分析;c. FATP2系統(tǒng)進化樹分析a. Amplication of target fragment of FATP2 gene(M. DNA marker;1. FATP2 gene amplification product); b. FATP2 amino acid similarity analysis; c. FATP2 phylogenetic tree analysis圖1 山羊FATP2序列擴增、不同物種FATP2蛋白相似性分析及進化樹分析Fig.1 Amplication of target fragment of FATP2 gene, FATP2 protein similarity analysis in different species and evolutionary tree analysis

a. FATP2磷酸化位點預測分析;b. FATP2信號肽預測分析;c. FATP2跨膜結(jié)構(gòu)預測分析;d. 親水性/疏水性分析a. Analysis of FATP2 phosphorylation site prediction; b. Analysis of FATP2 signal peptide prediction; c. Analysis of FATP2 transmembrane structure prediction; d. Hydrophilicity/hydrophobicity analysis圖2 山羊FATP2蛋白序列分析Fig.2 FATP2 protein sequence analysis of goat

a. 不同物種FATP2蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測;b. 山羊FATP2蛋白相互作用蛋白預測分析a. Prediction of tertiary structure of FATP2 proteins from different species; b. Prediction of FATP2 protein-interacting proteins in goats圖3 山羊FATP2蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測及互作蛋白分析Fig.3 Tertiary structure prediction and interacting protein analysis of goat FATP2 protein

2.2 山羊FATP2基因組織表達及時序表達

以UXT為內(nèi)參基因[17],利用RT-qPCR技術(shù)檢測FATP2基因在山羊不同組織中mRNA表達譜,結(jié)果顯示(圖4a),山羊FATP2基因在心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、大腸、小腸組織中均有表達,且在肝臟中表達量最高,腎臟次之,在心臟中表達最低(P<0.01)。利用RT-qPCR技術(shù)檢測FATP2基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞不同分化時期(第0、2、4、6、8天)表達水平,結(jié)果顯示(圖4b),山羊FATP2基因的表達水平在肌內(nèi)前體脂肪細胞分化過程中稍微下降后逐漸升高,至分化第6天達到最高水平,隨后表達量下降。

a. 以心組織的表達水平為參照,肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05); 肩標相同字母代表差異不顯著(P>0.05);b.以0 h表達水平為參照,肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05); 肩標相同字母代表差異不顯著(P>0.05);c. FATP2干擾效率檢測;d. 干擾FATP2基因?qū)χx相關(guān)基因表達的影響。*.P<0.05, **.P<0.01,***.P<0.001a. The expression level in heart tissue was used as reference,values with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05); While values with the same letter superscipts mean no significant difference(P>0.05); b. The expression level at 0 h was used as reference,values with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05); While values with the same letter superscipts mean no significant difference(P>0.05); c. FATP2 gene interference efficiency detection;d. Effect of interfering with FATP2 gene on the expression of genes related to lipid metabolism. *.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001圖4 FATP2基因時序、組織表達及干擾后對脂代謝基因表達的影響Fig.4 FATP2 gene timing, tissues expression and effects on the expression of lipid metabolism genes after interfering with FATP2

2.3 FATP2干擾對山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞脂代謝的影響

SI-FATP2轉(zhuǎn)染至山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞并誘導48 h后,收集細胞,利用RT-qPCR技術(shù)檢測FATP2干擾效率,結(jié)果顯示(圖4c),與SI-NC組相比SI-FATP2組的FATP2基因表達量下降58%(P<0.01)。

在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞中干擾FATP2基因后,利用RT-qPCR技術(shù)檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達水平,結(jié)果顯示(圖4d):干擾FATP2基因后脂代謝相關(guān)基因FASN(P<0.01),ATGL(P<0.01),CD36(P<0.01),LPL(P<0.05),SCD1(P<0.01),DGAT1(P<0.01)的表達顯著上升,ACSL1基因的表達無顯著變化(P>0.05)。

Bodipy染色(圖5a)結(jié)果顯示,SI-FATP2組相比SI-NC組,脂滴聚集明顯減少,且量化后的脂滴含量極顯著下降(圖5b,P<0.01)。甘油三酯測定結(jié)果(圖5c)顯示,SI-FATP2組相比SI-NC組,甘油三酯含量顯著降低(P<0.05)。

a.對照組(SI-NC)及干擾FATP2組 (SI-FATP2) Bodipy染色;b.以Image-pro plus 6.0 量化脂滴;c.以GPO-Trinder酶反應(yīng)法檢測甘油三酯含量; *.P<0.05, **.P<0.01a. Bodipy staining of control group (SI-NC) and interfering FATP2 group (SI-FATP2); b. Quantification of lipid droplets by Image-pro plus 6.0; c. Triglyceride content detected by GPO-Trinder enzyme reaction; *.P<0.05, **.P<0.01圖5 干擾FATP2后對山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)沉積的影響Fig.5 Effects interfering with FATP2 on lipid deposition in goat intramuscular precursor adipocytes

3 討 論

肌內(nèi)脂肪的沉積包括脂肪合成、脂肪降解以及脂肪酸轉(zhuǎn)運,可從細胞水平、激素水平以及整體水平進行調(diào)控,多種信號通路、調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子都參與調(diào)控[21]。眾多轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)作用調(diào)控肌內(nèi)前體脂肪細胞的增殖與分化,其中,過氧化物酶體增殖體激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是此過程的關(guān)鍵調(diào)控因子[22-23]。FATP2作為脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白,受到PPARα的調(diào)控[24-25],調(diào)節(jié)脂肪酸代謝,在甘油三酯的合成以及肌內(nèi)脂肪的沉積中發(fā)揮著重要作用。在山羊中,FATP2基因?qū)?nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)調(diào)控的作用仍未知,為解析FATP2基因?qū)ι窖蚣?nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)沉積的作用,本試驗克隆了FATP2基因,通過生物信息學發(fā)現(xiàn)FATP2基因具有Sec/SPI信號肽,將有助于介導對蛋白的轉(zhuǎn)運[26],此外,FATP2還具有49個磷酸化修飾位點,將有助于蛋白的翻譯后修飾及細胞信號轉(zhuǎn)導[27]。將山羊FATP2氨基酸序列與其他物種比對,結(jié)果表明,山羊與綿羊、牛的相似性較高,說明其在不同物種間的保守性較高;系統(tǒng)進化樹結(jié)構(gòu)表明,山羊FATP2與綿羊、牛有較高親緣關(guān)系;對三級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn),不同物種間結(jié)構(gòu)相似,因此推測FATP2在不同物種間可能發(fā)揮著相似的作用,但其功能還需要后期的研究驗證。

脂肪細胞的增殖分化對于肌內(nèi)脂肪沉積至關(guān)重要,為了進一步研究FATP2對脂質(zhì)沉積的作用,本研究利用q-PCR檢測了FATP2在不同組織中的表達和分化不同階段時序的表達。結(jié)果表明,FATP2在山羊肝臟表達量最高,其次為腎臟,在心、脾、肺、背最長肌、大腸、小腸中都有表達。Hirsch等[28]的研究發(fā)現(xiàn),FATP2在脂肪組織、肝臟、心臟、腎臟中有表達,本研究發(fā)現(xiàn)FATP2在大腸和小腸中也有表達,而大腸和小腸作為脂肪酸吸收的場所,FATP2的表達與其脂肪酸轉(zhuǎn)運的功能相符合。Heinzer等[29]對小鼠的研究發(fā)現(xiàn),FATP2基因在肝臟和腎臟中的表達水平最高,本試驗結(jié)果與其一致。在當前研究中,人們發(fā)現(xiàn)FATP2在II型糖尿病、腎臟纖維化和腫瘤等由脂質(zhì)不平衡所引起的疾病中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[30],肝臟與腎臟作為脂代謝旺盛的器官,FATP2的高表達與其對脂質(zhì)平衡的調(diào)節(jié)作用相符。Feng等[31]通過轉(zhuǎn)錄組和基因組富集分析發(fā)現(xiàn),MAPK途徑是調(diào)控FATP2的主要下游信號途徑。MAPK信號通路參與肌內(nèi)前體脂肪細胞的增殖與分化過程,且研究表明激活MAPK通路可抑制脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達水平[32],FATP2缺乏在肝癌細胞中可增加多不飽和脂質(zhì)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng),導致腫瘤細胞的增殖[33]。因此推測,FATP2基因在脂肪細胞的增殖分化過程中發(fā)揮著作用,但其發(fā)揮的具體作用還需要進一步研究驗證。通過分析FATP2基因的時序表達,發(fā)現(xiàn)FATP2基因的表達量在分化過程中先升高后下降,且在脂肪分化第6天表達量最高,隨后下降,由此推測FATP2在不同分化時期發(fā)揮不同的作用,但具體的作用及其作用機制還有待后續(xù)研究。

研究發(fā)現(xiàn),FATP2的表達由Foxa1和PPARα控制[34],本研究利用RT-qPCR技術(shù)檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達水平的結(jié)果顯示,干擾FATP2基因,PPARα基因及其相關(guān)的基因CD36、SCD1表達量顯著升高,與以往的研究結(jié)果[35]一致,表明干擾FATP2基因后激活了脂肪酸氧化途徑。另有研究證明,FATP2的表達增加與富含甘油三酯的脂滴的積累和轉(zhuǎn)移的促進有關(guān)[10];研究發(fā)現(xiàn),在老年黑色素瘤患者與年輕患者中,老年患者黑色素瘤細胞中FATP2表達上調(diào),抑制FATP2表達則抑制其脂質(zhì)積累[7],本研究結(jié)果表明,干擾FATP2基因后,甘油三酯及脂滴的量顯著降低,與他們的試驗結(jié)果一致。干擾FATP2基因后,FASN、DGAT1及SCD1等與脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達顯著上升。研究表明,FASN是脂肪酸合成酶,催化脂肪酸合成從而促進脂質(zhì)合成[36];楊昌恒等[37]研究表明,DGAT1是甘油三酯合成的關(guān)鍵酶,過表達DGAT1可促進脂質(zhì)沉積;而SCD1作為硬脂酰輔酶A去飽和酶1可促進脂肪酸生成[38]。然后,FATP2表達水平的降低也同時抑制了ACSL1基因的表達,推測可能限制了機體對脂肪酸的利用,從而抑制了由脂生成相關(guān)基因表達的上調(diào)所帶來的脂質(zhì)沉積效應(yīng)。同時,干擾FATP2基因后ATGL和LPL等與脂質(zhì)分解相關(guān)基因的表達也顯著上升,ATGL與LPL都是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶,AGTL促進甘油三酯水解[39],而LPL促進脂肪酸氧化[40]。綜上所述,推測FATP2干擾后主要通過促進脂解途徑從而最終抑制脂質(zhì)沉積,然而FATP2在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)沉積中的作用仍需要進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究克隆獲得山羊FATP2基因序列全長2 335 bp,其中CDS區(qū)1 863 bp,5′UTR 188 bp,3′UTR 284 bp,編碼621個氨基酸。干擾FATP2基因可能通過促進脂解相關(guān)基因的表達從而抑制山羊前體脂肪細胞脂質(zhì)沉積。這些結(jié)果將為進一步闡明FATP2在山羊肌內(nèi)脂肪沉積過程中的作用機制提供理論參考。