劉 華,殷冬冬,邵 穎,宋祥軍,王振宇,潘孝成,涂 健,何長生,朱良強(qiáng)*,祁克宗*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),合肥 230036;2.安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心,合肥 230091;3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,合肥 230031)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的接觸性傳染病[1]。PED于1971年首次在英國報(bào)道,隨后在整個(gè)歐洲流行[2]。2010年前,PED在我國區(qū)域性流行,但在2010年10月以后,PED在我國南方開始大規(guī)模流行,并很快在全國各地流行,嚴(yán)重?fù)p害了我國的養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展[3-4]。

PEDV屬于冠狀病毒屬成員,為單鏈正義RNA,基因組全長約為28 kb,包含5′、3′端非編碼區(qū)、ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6等非結(jié)構(gòu)蛋白及 S、M、E和N等結(jié)構(gòu)蛋白[5]。其中,N基因在不同的PEDV毒株之間高度保守,可以作為PEDV感染診斷的靶標(biāo)[4]。

目前,通常采用病毒分離、定量實(shí)時(shí)PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和ELISA等方法來檢測豬是否感染PEDV[6-7],但這些方法操作相對復(fù)雜,工作量較大。因此,需要一種新的技術(shù)方案來解決上述問題。研究發(fā)現(xiàn),CRISPR/Cas13a在特異性crRNA的引導(dǎo)下切割目標(biāo)RNA后,其“附屬切割”活性被激活,可高效切割體系中非特異單鏈RNA[8-9]?；谶@一原理,通過設(shè)計(jì)兩端標(biāo)記熒光基團(tuán)的RNA探針,可使CRISPR/Cas13對RNA模板的檢測和信號放大,實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分子的特異性檢測。重組酶輔助擴(kuò)增 (recombinase aided amplification, RAA) 技術(shù)是一種恒溫快速擴(kuò)增核酸的技術(shù)。該技術(shù)在37～42 ℃ 等溫條件下可短時(shí)間內(nèi)對模板進(jìn)行指數(shù)級擴(kuò)增,但常規(guī)RAA需要瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果判讀復(fù)雜[10]。基于CRISPR/cas13a技術(shù)的檢測方法已被應(yīng)用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)、埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)及登革熱病毒(dengu evirus, DENV)等病毒[11-13]。因此,本研究將 CRISPR/Cas13a與RAA 技術(shù)相結(jié)合,針對 PEDVN基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針,建立操作簡單,特異性強(qiáng),靈敏度高的PEDV檢測方法,以期為PED的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 毒株與臨床樣本

豬圓環(huán)病毒1型(porcine circovirus type 1, PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)、豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus type 3, PCV3)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)及偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)等陽性病料均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。40 份腹瀉哺乳仔豬腸道和肛門拭子樣品由第三方檢測機(jī)構(gòu)收集并提供。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;LwCas13a和RAA檢測試劑盒購自安徽微分基因科技有限公司;HiScribe T7 Quick High Yield RNA合成試劑盒、T7 RNA聚合酶及RNase酶抑制劑購自NEB公司;NucawayTM離心柱購自Invitrogen公司;RNAXP 磁珠購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

N基因長度為1 326 bp,其在不同的PEDV毒株之間高度保守,根據(jù)GenBank公布的PEDV毒株N基因序列(登錄號:KU646831、JN173276、MK584552、KM089829、MZ364314、JX647847、ON571549、MN759311、ON649885、MH726391),參照RAA引物設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)N基因特異性RAA引物見表1(單下劃線為T7啟動(dòng)子序列)。此外,根據(jù)Cas13a蛋白crRNA識別靶序列的特性,在PEDV的N基因序列上設(shè)計(jì)3對特異性的crRNA探針(PEDV-crRNA1-3),引物序列如表1所示(雙下劃線為莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PEDV crRNA引物序列Table 1 PEDV crRNA primer sequences

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和crRNA 的制備

根據(jù)GenBank公布的PEDV AH2012/12株(登錄號:KU646831),由生工生物工程(上海)股份有限公司將N基因合成,并連接至載體pUC57,重組質(zhì)粒分別命名為pUC-N,測序正確的重組質(zhì)粒即為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。將“1.3”中合成的兩條PEDV-crRNA1-3的上、下游引物退火形成雙鏈(終濃度為10 μmol·L-1),隨后利用HiScribe T7 Quick High Yield RNA 合成試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物利用RNAXP 磁珠進(jìn)行純化,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RAA擴(kuò)增

參照RAA核酸檢測試劑盒說明書配制反應(yīng)體系(50 μL):25 μL預(yù)混液,3 μL MgOAc,RAA上、下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL,1 μL待檢樣本cDNA或DNA,用RNase free H2O補(bǔ)至50 μL,將反應(yīng)體系震蕩離心,37 ℃孵育30 min,制備RAA產(chǎn)物。

1.6 CRISPR/Cas13a檢測

利用LwCas13a核酸酶(45 nmol·L-1),crRNA探針(22.5 nmol·L-1),FT-RNA報(bào)告分子(125 nmol·L-1),RNase inhibitor(0.25 μL),dNTPs(1 mmol·L-1)和T7聚合酶(0.4 μL),檢測緩沖液補(bǔ)充至9 μL,RAA擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL,在QuantStudioTM 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR 37 ℃反應(yīng) 40 min,每間隔5 min收集熒光信號。

1.7 crRNA的篩選

以pUC-N為模板,采用“1.5”和“1.6”中的檢測方法,分別對3組crRNA進(jìn)行篩選,通過擴(kuò)增曲線的熒光值及起峰時(shí)間,選擇最佳檢測PEDV 的crRNA探針。

1.8 靈敏度試驗(yàn)

將pUC-N標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋為1.0×108～ 1.0×100copies·μL-1等 9個(gè)濃度。用已建立的RAA-Cas13a檢測方法,以稀釋后的各濃度陽性質(zhì)粒為模板,通過擴(kuò)增曲線確定該方法的靈敏度,同時(shí)設(shè)置RNase free H2O作為陰性對照,每組進(jìn)行3次重復(fù)。

1.9 特異性試驗(yàn)

選取PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV、CSFV和PRV等病毒作為特異性檢測對象,參照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書對上述病毒進(jìn)行核酸提取。用已建立的RAA-Cas13a方法進(jìn)行檢測,同時(shí)設(shè)置陰性對照,分析該檢測方法的特異性。

1.10 臨床樣本檢測

對40份臨床腹瀉哺乳仔豬腸道和肛門拭子樣本進(jìn)行檢測,采用本研究建立的RAA-Cas13a檢測方法和RT-qPCR檢測方法[14]進(jìn)行PEDV檢測,并使用SPSS軟件進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn),以評估該方法的臨床實(shí)用性。

2 結(jié) 果

2.1 crRNA的篩選

將合成的N基因進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示,在目標(biāo)大小處有特異性條帶,經(jīng)測序證實(shí)為PEDV N基因(圖1)。此外,由圖2A可知,RAA引物擴(kuò)增產(chǎn)物檢測峰圖在222 bp處有單峰,表明引物特異性良好。通過建立的RAA-Cas13a方法比較和篩選已制備的3組PEDV-crRNA,結(jié)果如圖2B所示crRNA-2與其他2組相比,熒光值最高且起峰時(shí)間最短。因此,選擇PEDV-crRNA-2用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 pUC-N質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of PCR amplification of pUC-N plasmid

A. RAA引物擴(kuò)增產(chǎn)物檢測峰圖;B. crRNA篩選結(jié)果A. RAA primer amplification product detection peak; B. The screening result of crRNA圖2 RAA引物驗(yàn)證及crRNA篩選Fig.2 The results of validation of RAA primers and crRNA screening

2.2 PEDV RAA-Cas13a 檢測方法的靈敏度評價(jià)

以9個(gè)梯度稀釋(1.0×108～ 1.0×100copies·μL-1)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及RNase free H2O作為模板進(jìn)行RAA-Cas13a方法的靈敏度評價(jià)。結(jié)果如圖3所示,在反應(yīng)5 min時(shí)即可檢測到1.0×101copies·μL-1的信號,表明本研究建立的RAA-Cas13a 檢測方法的檢測限為101copies·μL-1。

圖3 RAA-Cas13a 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity detection results of RAA-Cas13a

2.3 PEDV RAA-Cas13a 檢測方法的特異性評價(jià)

RAA-Cas13a 的分析特異性試驗(yàn)檢測結(jié)果如圖4所示,僅PEDV出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV、CSFV、PRV及陰性對照均無檢測信號,表明本研究建立的方法能特異性擴(kuò)增檢測出PEDV,而不與其他病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng),說明本檢測方法特異性強(qiáng)。

2.4 臨床樣本檢測效果評價(jià)

RAA-Cas13a分別應(yīng)用本試驗(yàn)建立的RAA-Cas13a方法和RT-qPCR方法,對臨床上采集的40份樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,RAA-Cas13a的陽性率為72.5%(29/40),RT-qPCR方法的陽性率為67.5%(27/40),陽性符合率為100%,陰性符合率為84.6%(表2),總一致性為95%,Kappa=0.881(Kappa≥0.75,表示可重復(fù)性極好)。

表2 RAA-Cas13a 和 RT-qPCR 方法對臨床樣本中的 PEDV檢測結(jié)果Table 2 Detection results of clinical samples in RAA-Cas13a and RT-qPCR assays

3 討 論

PED是一種高度傳染性的傳染病,可引起哺乳仔豬的腹瀉、嘔吐和脫水等臨床癥狀,有高致死率,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3,15-16]。目前,PEDV的疫苗保護(hù)效果較差,甚至注射過疫苗都能感染。因此,建立高效、靈敏且特異性強(qiáng)的PEDV檢測方法,對PEDV的流行病學(xué)調(diào)查和早期診斷具有重要意義。PEDV的實(shí)驗(yàn)室檢測方法很多,但大多數(shù)檢測方法需要專業(yè)操作或特殊設(shè)備,需要在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。CRISPR/Cas13a系統(tǒng)可以特異性切割目標(biāo)RNA,且具有非特異性附帶切割活性,基于該原理可在反應(yīng)體系中加入非特異RNA報(bào)告探針,實(shí)現(xiàn)對靶基因的特異檢測,這為CRISPR/Cas13a系統(tǒng)在核酸檢測領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新思路[8,17]。此外,RAA技術(shù)引物設(shè)計(jì)簡單,擴(kuò)增效率高,因此,本研究將RAA技術(shù)與CRISPR/Cas13a系統(tǒng)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了兩種技術(shù)優(yōu)勢互補(bǔ),提高檢測系統(tǒng)性,增強(qiáng)特異性。

本研究建立的RAA-Cas13a檢測方法的檢測限達(dá)到101copies·μL-1。Wang等[18]建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法僅能檢測出300 copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒;Liu等[6]開發(fā)的基于ORF3基因建立的TaqMan探針的熒光定量PCR的檢測限為37 copies·μL-1;翟剛等[19]基于M基因建立的TaqMan檢測方法最低檢測下限為1.09×101copies·μL-1;冉偉等[20]建立SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法,最低可檢測102copies·μL-1的質(zhì)粒。本研究建立的RAA-Cas13a檢測法比上述方法的靈敏度更高。同時(shí),該方法與其他6種豬源病原核酸沒有交叉反應(yīng),表明建立的方法對 PEDV 具有強(qiáng)特異性。為了評估該技術(shù)在臨床應(yīng)用中的可靠性,計(jì)算了RAA-Cas13a檢測與RT-qPCR的符合率,結(jié)果顯示,40份疑似樣品中,用RAA-Cas13a方法檢測出29份陽性,RT-qPCR法檢測出27份陽性,這27份陽性樣品在RAA-Cas13a中的檢測結(jié)果均為陽性,說明建立的RAA-Cas13a檢測方法比RT-qPCR靈敏度更高。此外,RAA反應(yīng)和CRSIRR/Cas13a檢測均在37 ℃下進(jìn)行,全部反應(yīng)都可在一臺(tái)便攜的恒溫?zé)晒鈾z測儀中完成,對硬件要求不高。

綜上所述,本研究建立的PEDV RAA-Cas13a檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求不高等優(yōu)勢,本研究結(jié)果可為PEDV檢測提供一種新方法,為今后PED的診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

4 結(jié) 論

本研究將RAA技術(shù)與CRISPR/Cas13a系統(tǒng)結(jié)合,建立了PEDV RAA-Cas13a檢測方法,該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求不高、操作簡單,可為PED的診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。