神英超,陶 力,任 宏,王希生,田書岳,杜 明,芒 來,格日樂其木格

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 內(nèi)蒙古自治區(qū)馬遺傳育種與繁殖重點實驗室,呼和浩特 010018)

卵母細胞體外成熟(IVM)的效率及質(zhì)量決定了體外受精技術(shù)的成功率。體外收集的馬卵丘-卵母細胞復(fù)合體(COCs),約有60%為卵丘擴展型,30%為卵丘緊湊型,10%為退化狀態(tài)[1]。擴展型的COCs被認為是來自閉鎖卵泡[2],而馬的擴展型卵母細胞體外成熟和發(fā)育能力好于緊湊型卵母細胞[3-4]。一些研究人員也從不同角度對馬不同類型卵母細胞成熟發(fā)育能力存在差異的現(xiàn)象進行了探究,在染色質(zhì)構(gòu)象方面,緊湊型卵母細胞的染色質(zhì)呈彌散狀,而擴展型的卵母細胞染色質(zhì)聚集分布,因此可能擁有更好的核成熟能力[3];在代謝方面,擴展型COCs展現(xiàn)出較低的葡萄糖消耗[5]。此外,深入了解擴展型和緊湊型COCs的發(fā)育需求,將有助于提高馬卵母細胞的利用效率。

現(xiàn)有的馬卵母細胞體外成熟體系效率仍然較低[6]。馬卵母細胞在排卵前或排卵期間逐漸成熟,其成熟的最后階段需要輸卵管提供合適的環(huán)境[7-8]。在馬卵母細胞IVM過程中與馬輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)可以提高其成熟和發(fā)育能力[8]。這表明馬卵母細胞可能有其獨特的成熟機制。而到目前為止,對馬卵母細胞成熟和發(fā)育的特殊分子機制知之甚少,馬IVM體系大多借鑒或模仿其他哺乳動物的體系。因此,本研究選取了一些與卵母細胞發(fā)育/成熟相關(guān)的激素和生長因子:促卵泡素(FSH)[9]、促黃體素(LH)[10]、胰島素生長因子1(IGF1)[11]、胰島素生長因子2(IGF2)[12]、雌二醇(estradiol)[13]、生長分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)[14],通過檢測其受體基因在馬不同類型COCs中的表達,并檢測相應(yīng)的因子或激素對馬卵母細胞體外成熟的影響,探討兩種COCs成熟和發(fā)育能力存在差異的可能因素,尋找可提高馬卵母細胞體外成熟效率的方法。

1 材料與方法

1.1 馬卵丘-卵母細胞復(fù)合體(COCs)及卵泡壁顆粒細胞的收集

蒙古馬卵巢采集于呼和浩特市郊區(qū)屠宰場,離體卵巢放入含37 ℃生理鹽水的保溫杯中,于2 h內(nèi)運回實驗室。

馬卵巢運回實驗室后,首先去除外部的白膜,用帶有18 G針頭的50 mL注射器抽取卵泡液,并將卵泡液倒在培養(yǎng)皿中,在體視鏡下進行COCs的收集。抽完所有卵泡后,在10 cm培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀將馬卵巢切開,輕刮卵泡壁,并用無菌生理鹽水沖洗,所有卵泡沖洗完后,在體視鏡下尋找和收集沖洗液中的COCs和壁顆粒細胞。將收集到的COCs和壁顆粒細胞轉(zhuǎn)移至M199操作液(Gibco)中,根據(jù)卵丘形態(tài)將COCs分為擴展型(Ex)和緊湊型(Cp)[15]。

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

將收集到的擴展型COCs和緊湊型COCs分別用0.1%透明質(zhì)酸酶(Gibco)37 ℃消化2 min,隨后用渦旋儀渦旋30～60 s,充分分離卵丘顆粒細胞和卵母細胞。將收集到的壁顆粒細胞及兩種類型的卵母細胞和卵丘細胞轉(zhuǎn)移至RLT裂解液中(Qiagen),用RNeasy mini kit(Qiagen)試劑盒提取RNA。使用酶標儀測定提取RNA溶液的OD260 nm/OD280 nm值,確定RNA的質(zhì)量和濃度,用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermofisher)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3 qPCR

qPCR所用引物使用Primer5 軟件進行設(shè)計,由上海生工公司合成,引物信息見表1。qPCR體系為:SYBR Premix Ex Taq酶(TaKaRa)5 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA 0.5 μL,ddH2O 3.7 μL,體系總共為10 μL。使用CFX96實時定量PCR儀(Biored)進行PCR反應(yīng)。測得的Ct值使用2-ΔΔCt方法進行分析。

1.4 免疫熒光染色

通過離體卵巢收集到的馬COCs和壁顆粒細胞轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛中固定40 min。使用PBS溶液清洗3遍后,轉(zhuǎn)移至透膜液(PBS+0.1%Triton)中透膜20 min,然后轉(zhuǎn)移至封閉液(PBS+3%BSA)中封閉30 min。一抗用封閉液按比例稀釋:FSHR Ab (Affinity, 1∶100),Estrogen Receptor-alpha Ab (Affinity, 1∶100),Estrogen Receptor-beta Ab (Affinity, 1∶100),BMPR1 Ab (Affinity, 1∶100), BMPR2 Ab (Affinity, 1∶100), IGF1R Ab (Affinity, 1∶100), ALK5 Ab (Affinity, 1∶100), IGF2 Receptor Ab (Abbexa, 1∶200)。將細胞轉(zhuǎn)移至100 μL稀釋的抗體溶液中,4 ℃過夜。一抗孵育結(jié)束后用PBS清洗3次,然后使用稀釋的Alexa Flour 488二抗(Thermofisher, 1∶1 000)室溫孵育1 h。PBS清洗兩次,使用DAPI(Solarbio)室溫孵育10 min進行核染色,PBS清洗兩次,使用防熒光猝滅劑(Thermofisher)進行封片。使用OLYMPUS FV3000 confocal顯微鏡進行觀察和拍照。

1.5 馬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)

馬IVM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為M199、10% FBS、0.11 mg·mL-1丙酮酸鈉、0.05 mg·mL-1L-谷氨酰胺、0.01 mg·mL-1FSH、200 ng·mL-1IGF-1 和 0.1 IU·mL-1Penicillin Streptomycin,所用試劑均購自Gibco公司。此外,添加不同激素/因子觀察對馬卵細胞體外成熟率的影響,包括0.5 mg·mL-1雌二醇(Yuanye)、100 ng·mL-1BMP15 (Bio-techne)、100 ng·mL-1GDF9 (Bio-techne)和200 ng·mL-1IGF-2 (PrimeGene)。IVM試驗兩種類型COCs共同培養(yǎng),未做區(qū)分。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基配好后,提前加到培養(yǎng)皿中,用石蠟油封蓋。在37 ℃,5% CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中平衡4 h以上。體外收集馬COCs后,在M199操作液中清洗一次,使用口吸管在IVM培養(yǎng)基清洗4次后,放入含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng),30 h后收集培養(yǎng)后的COCs,用0.1%透明質(zhì)酸酶消化脫去顆粒細胞,通過顯微鏡觀察極體排出情況確定成熟的卵母細胞個數(shù),進一步用DAPI染色確定核成熟狀態(tài)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

熒光定量PCR數(shù)據(jù)使用單因素方差分析進行差異顯著性分析,采用卡方分析比較各組成熟卵母細胞的成熟率差異。

2 結(jié) 果

2.1 Ex-COCs和Cp-COCs中不同F(xiàn)SH、LH、IGF1、IGF2、Estrogen、BMP15、GDF9受體基因mRNA表達譜

馬擴展型和緊湊型COCs形態(tài)如圖1A所示,Ex-COCs有擴散的較為松散的卵丘顆粒細胞,而Cp-COCs的卵丘細胞呈現(xiàn)緊密而收縮的狀態(tài)。本研究挑選了一些與卵細胞發(fā)育相關(guān)的激素和生長因子:FSH、LH、IGF1、IGF2、Estrogen、BMP15和GDF9,通過qPCR試驗檢測其受體基因在馬不同類型COCs中的表達情況。FSHR、ESR1、ESR2、BMPR1和BMPR2在Cp-COCs的卵丘顆粒細胞(CpC)中的表達顯著高于Ex-COCs卵丘顆粒細胞(ExC)(P<0.05),但Cp-COCs的卵母細胞(CpO)的表達量顯著低于Ex-COCs的卵母細胞(ExO)(P<0.05);IGF1R在CpC的表達量顯著高于ExC,而在CpO的表達量顯著低于ExO(P<0.05);IGF2R在ExO的表達量顯著高于CpO(P<0.05),在CpC和ExC之間無顯著差異;ALK5在ExC的表達量顯著高于CpC(P<0.05),而在CpO和ExO之間無顯著差異(圖1B)。在兩種類型的COCs中均未檢測到LHR的表達,而在壁顆粒細胞和卵巢組織可檢測到其表達(圖1B)。在Cp-COCs中,卵丘顆粒細胞多數(shù)的激素生長因子受體基因表達量高于卵母細胞,而在Ex-COCs中,卵母細胞與卵丘顆粒細胞的激素生長因子受體表達水平相似,表明Ex-COCs的卵母細胞有更獨立的激素生長因子利用能力和發(fā)育能力。

2.2 受體蛋白免疫熒光染色

對Ex-COCs和Cp-COCs進行了免疫熒光染色以確定受體蛋白的表達。圖2所示為FSHR、IGF1R、IGF2R、ERα、ERβ、BMPR1B、BMPR2和ALK5 在馬Ex-COCs和Cp-COCs中的熒光染色圖,所有的受體蛋白在兩種類型的COC中均有明顯的表達。在壁顆粒細胞中,所有的受體蛋白也有明顯的表達(圖3)。

2.3 相關(guān)激素/因子添加對馬卵母細胞體外受精的影響

在國內(nèi)外眾多實驗室的馬卵母細胞IVM培養(yǎng)基中通常會添加FSH和IGF1,為了進一步確定其他調(diào)節(jié)劑,包括E2、IGF2、BMP15和GDF9是否能促進馬卵母細胞體外成熟,本研究在基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)體系(basic medium)中添加了這些激素/生長因子,檢測其對馬卵母細胞成熟率的影響。如表2所示,IGF2和E2有促進細胞整體成熟的潛力,比基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成熟率提高約10%,而BMP15和GDF9則沒有明顯的促進作用。

表2 不同激素/生長因子對馬卵母細胞體外成熟率的影響Table 2 The effect of hormone or growth factors on maturation of equine oocytes

3 討 論

本研究旨在闡明緊湊型和擴展型馬COCs中一些調(diào)節(jié)哺乳動物卵母細胞發(fā)育的重要激素和生長因子表達的差異,從而為探究兩種卵母細胞在體外發(fā)育能力存在差異的原因,尋找提高馬IVM整體效率的方法。

與緊湊型卵母細胞相比,馬擴展型的卵母細胞具有更好的減數(shù)分裂和發(fā)育能力[1,16]。在本研究結(jié)果中,大多數(shù)情況下,擴展型的卵丘和卵母細胞中激素和生長因子受體的mRNA水平相當,但對于緊湊型的COCs,多數(shù)情況下卵丘細胞表達水平顯著高于卵母細胞,這可能說明,與Cp-COCs卵母細胞相比,Ex-COCs卵母細胞在發(fā)育過程中可能更依賴于自身。FSH和LH作為體內(nèi)調(diào)節(jié)卵泡和卵母細胞發(fā)育的主要激素,被廣泛用于哺乳動物卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)[17-18]。在馬的顆粒細胞、卵丘細胞、卵母細胞和黃體組織中均可檢測到FSHR的mRNA和蛋白[19-20],研究發(fā)現(xiàn)在mRNA水平上,FSHR在馬Ex-和Cp-COCs卵丘和卵母細胞中的表達存在差異。然而,在本研究結(jié)果中,LHR在兩種類型的體外卵泡中收集的卵丘和卵母細胞中均檢測不到,Goudet等[21]研究發(fā)現(xiàn),成熟后的馬顆粒細胞和卵丘細胞中均有LHR的表達。通常情況下,在許多哺乳動物中,LH和FSH通過影響E2-camp介導(dǎo)減數(shù)分裂阻滯來抑制雌激素的表達,從而促進減數(shù)分裂的恢復(fù)[22],而有研究證明E2促進馬卵母細胞成熟[23-24],在本研究中添加E2也將馬IVM成熟率提高約10%。母馬排卵時E2會有短暫提高,而LH水平短暫降低[25],有趣的是,類似的現(xiàn)象在狨猴也被發(fā)現(xiàn)[26]。因此需要更詳細的研究來了解E2和LH對馬卵母細胞發(fā)育和成熟的影響,以及在母馬排卵過程中所發(fā)揮的作用。

研究表明,IGF1對體外培養(yǎng)的馬卵母細胞核成熟率有積極影響[24]。對其他物種的研究發(fā)現(xiàn),在減數(shù)分裂恢復(fù)期間,類固醇和IGF1之間存在潛在的協(xié)同作用[27],并且IGF1通過EGF樣配體/EGFR通路促進卵母細胞成熟[28]。此外,在人類中,IGF1可以從形態(tài)和正常紡錘體水平上改善卵母細胞的質(zhì)量,從而有利于受精卵的發(fā)育[29]。同樣,在本研究中,IGF1R蛋白在卵丘和卵母細胞兩種類型的細胞核中高表達,表明IGF1在調(diào)節(jié)馬卵母細胞的發(fā)育中起作用。與IGF1相比,IGF2很少用于馬的IVM[30],并且從未研究過其對馬卵母細胞的影響。然而,本研究結(jié)果表明,IGF2在兩種COCs中都有明顯的表達,并且添加IGF2可以提高馬的卵母細胞成熟率。因此IGF1和IGF2在馬卵母細胞成熟發(fā)育能力方面的調(diào)節(jié)作用值得進一步探究。

BMP15和GDF9是重要的卵母細胞分泌因子(OSF),調(diào)節(jié)卵丘顆粒細胞的發(fā)育和功能,從而促進和幫助自身的發(fā)育[31]。對BMP15和GDF9進行免疫抑制可抑制母馬排卵,這可作為一種母馬避孕的方法[32],因此,BMP15和GDF9可能對母馬卵泡和卵母細胞的發(fā)育有一定的影響。本研究發(fā)現(xiàn),GDF9和BMP15的受體(BMPR1B,BMPR2)和ALK5在顆粒細胞、卵囊細胞及卵母細胞中均有表達,但單獨添加BMP15或GDF9并不能提高成熟一致率,這與對小鼠的研究結(jié)果一致[33]?？紤]到在卵母細胞成熟培養(yǎng)基中添加外源性的GDF9和BMP15可提高小鼠[33]和牛[34]的后續(xù)胚胎發(fā)育和胎兒存活率,而不是成熟率,因此還需要進一步研究GDF9和BMP15對馬卵母細胞成熟及后續(xù)合子發(fā)育的影響。

卵母細胞成熟是多種因素共同作用的復(fù)雜過程。由于馬卵母細胞的成熟時間點和成熟位置較其他物種特殊,因此其可能在卵母細胞成熟發(fā)育機制方面有所不同,需要在這方面進行新的嘗試和研究。由于馬卵巢不宜獲得,而且卵泡較少,因此很難收集到大量的優(yōu)質(zhì)卵母細胞用于IVM和IVF的研究,在本試驗中,在不丟棄非優(yōu)質(zhì)卵母細胞(卵丘不完整或無卵丘細胞包被)的情況下,成熟率可以達到30%～41.2%,達到馬卵母細胞體外成熟率的平均水平[1,35]。由于本試驗所采集的均為2～3歲母馬的卵母細胞,也可能是造成卵母細胞成熟率不高的原因之一[36-37]。此外,由于用于試驗的卵母細胞數(shù)量有限,添加IGF2和E2組的成熟率相對于其它組提高了約10%,但無統(tǒng)計學(xué)差異,后續(xù)的試驗需要采集更多的卵母細胞進行檢測和分析。馬屬于單排卵動物,卵巢有排卵窩,且各種促排激素對其卵泡發(fā)育和促排效果不顯著,因此無論通過離體卵巢收集卵母細胞還是通過體內(nèi)活體采卵(OPU)抽取卵母細胞,獲得的高質(zhì)量卵細胞均很少,因此兩種類型的卵母細胞都需要高效利用。

4 結(jié) 論

綜上所述,馬擴展型和緊湊型COCs中FSH、LH、IGF1、IGF2、雌二醇、BMP15和GDF9等重要激素或生長因子受體的表達水平差異可以解釋其體外成熟和發(fā)育能力差異的原因,在成熟培養(yǎng)體系中添加IGF2和E2等可能會提高馬兩種類型卵母細胞的體外成熟率。