張秀娟, 范 玟, 楊 樂, 吳 楚, 楊永勝

(1.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院, 湖北 荊州 434025; 2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所, 青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青海 西寧 810001)

隨著我國工農(nóng)業(yè)和城鎮(zhèn)化的快速發(fā)展,工礦業(yè)廢棄污染物不斷排放和農(nóng)業(yè)化學(xué)用品過量使用,越來越多的重金屬進(jìn)入土壤,土壤環(huán)境污染日益嚴(yán)重。我國土壤重金屬總的點(diǎn)位超標(biāo)率為16.1%,其中鎘的點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)7.0%,在無機(jī)污染物中位居首位[1]。鎘是一種有劇毒的稀有污染重金屬,危害動(dòng)植物及人類的健康[2],且半衰期較長,遷移率較高,生物富集特性較強(qiáng),屬于需要優(yōu)先控制的重金屬污染物[3]。鎘脅迫加強(qiáng)植物細(xì)胞內(nèi)固有的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)代謝,若ROS水平超出抗氧化酶的防御機(jī)制,將引起植物細(xì)胞膜過氧化,葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)排列混亂,細(xì)胞器損傷嚴(yán)重,光合色素含量降低[4]。植物修復(fù)技術(shù)是利用超富集植物來穩(wěn)定降解土壤中的污染物[5],具有成本低、綠色環(huán)保、對環(huán)境干擾小等優(yōu)點(diǎn)[6]。近年來,對鎘污染土壤下植物生理特性的研究較多,例如小麥(Triticumaestivum)[7]、玉米(Zeamays)[8]、龍葵(Solanumnigrum)[9]、杞柳(Salixintegra)[10]以及鬼針草(Bidenspilosa)[11]等。然而,選用這些植物在修復(fù)鎘污染方面存在一定缺陷,一是選用農(nóng)作物會(huì)通過食物鏈傳播危害人類健康,二是因生物量太低而限制了在實(shí)際中的應(yīng)用。利用草坪草修復(fù)鎘污染的土壤,其產(chǎn)物不會(huì)進(jìn)入食物鏈且生物量大、安全性強(qiáng)、適用性廣[12],同時(shí)具備修復(fù)治理和美化環(huán)境的雙重作用[6],因此,草坪草修復(fù)鎘污染土壤具有獨(dú)特優(yōu)勢。

白三葉(Trifoliumrepens)為豆科車軸草屬草坪草,具有適應(yīng)性強(qiáng),耐熱、耐旱、耐寒、耐貧瘠等優(yōu)點(diǎn),是極為重要的優(yōu)質(zhì)牧草和觀賞型草坪草。禾本科的高羊茅(Festucaarundinacea)和黑麥草(Loliumperenne)是有重要農(nóng)學(xué)價(jià)值的冷季型草坪草,其根系發(fā)達(dá)、適應(yīng)范圍廣、抗逆性強(qiáng),廣泛用于綠地草坪和運(yùn)動(dòng)場草坪,同時(shí)也可作為牧草和綠肥作物。已有研究發(fā)現(xiàn)這3種草坪草對重金屬有一定的耐受能力[13-15],均有修復(fù)重金屬污染土壤的潛力。因此,本研究以白三葉、高羊茅、黑麥草為試驗(yàn)材料,探討這3種草坪草受到鎘脅迫后的生理特性及葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,從生理學(xué)和細(xì)胞學(xué)上揭示鎘對草坪草的毒害機(jī)理,以期為利用草坪草修復(fù)鎘污染的土壤提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中白三葉(‘法海’)、高羊茅(‘凱撒’)、黑麥草(‘綠洲’)的種子從北京克勞沃生態(tài)科技有限公司獲得;選用的育苗基質(zhì)購于一畝田農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)中3種草坪草的培養(yǎng)溫度均為20℃～25℃;相對濕度為50%～60%;光照周期為12 h光照/12 h黑暗交替進(jìn)行。Cd2+設(shè)置處理濃度為0,200,500,1 000,2 000 mg·kg-1,每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù),將不同質(zhì)量的氯化鎘與基質(zhì)混合均勻,裝入無污染的花盆中(d=15 cm,h=11 cm),每種草坪草種植30盆,每2天澆一次水(不含Cd2+或肥料),澆水標(biāo)準(zhǔn)以達(dá)到田間持水量的75%～80%為準(zhǔn),澆水時(shí)確保無鎘溶液滲漏,待60 d后測定其各項(xiàng)生理指標(biāo)并觀察葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.2.2生理指標(biāo)的測定 葉綠素含量采用乙醇-丙酮提取法[16]測定;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測定[17];過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性按張以順等[18]的方法測定;過氧化氫(Catalase,CAT)活性按蒼晶等[19]的方法測定;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[20]。

1.2.3葉片超顯微結(jié)構(gòu)觀察 高羊茅和黑麥草選取Cd2+濃度為0,500,2 000 mg·kg-1成熟葉片進(jìn)行切片觀察,因白三葉在Cd2+濃度為2 000 mg·kg-1時(shí)死亡,故選取Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1成熟葉片。在顯微鏡下切成6片1 mm×1 mm的葉塊,參照鄭敏娜等[21]的方法處理葉片組織,在HITACHI—H7500型投射電鏡下觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件最小顯著差異法進(jìn)行多重比較(P<0.05),數(shù)據(jù)處理用EXCEL 2007,作圖使用Origin 2019。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+脅迫對草坪草光合色素的影響

3種草坪草的葉綠素含量隨Cd2+濃度增加而降低(表1)。白三葉葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量及類胡蘿卜素含量在Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1時(shí)僅為對照的9%～18%,其差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01);其葉綠素b含量在Cd2+濃度200和500 mg·kg-1時(shí)為對照的55%和41%,差異顯著(P<0.05);其總?cè)~綠素含量和類胡蘿卜素含量在Cd2+濃度500 mg·kg-1時(shí)分別為對照的57%和33%,差異顯著(P<0.05)。

表1 不同濃度Cd2+對3種草坪草光合色素含量的影響

與對照相比,不同濃度Cd2+處理下高羊茅的葉綠素a和總?cè)~綠素含量的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01);其葉綠素b含量在Cd2+濃度200 mg·kg-1時(shí)為對照的60%,顯著低于對照(P<0.05),在Cd2+濃度500～2 000 mg·kg-1時(shí)其葉綠素b含量較對照差異達(dá)極顯著水平(P<0.01);其類胡蘿卜素含量在Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1時(shí),較對照顯著降低50%(P<0.05),在Cd2+濃度為2 000 mg·kg-1時(shí)較對照降低66%,差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。

黑麥草葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量在Cd2+濃度1 000 mg·kg-1時(shí)為對照的57%～58%,顯著低于對照(P<0.05),在Cd2+濃度2 000 mg·kg-1時(shí)為對照的31%～38%,差異達(dá)極顯著水平(P<0.01),其類胡蘿卜素含量在Cd2+濃度2 000 mg·kg-1時(shí)為對照的37%,其差異顯著(P<0.05)。

2.2 Cd2+脅迫對草坪草抗氧化酶活性及MDA含量的影響

白三葉SOD活性隨著Cd2+濃度增加而上升(圖1A),在Cd2+濃度為500和1 000 mg·kg-1時(shí)分別較對照上升131%和162%,其差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。高羊茅的SOD活性在Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1時(shí)SOD活性最高,與對照相比差異極顯著(圖1A,P<0.01),在Cd2+濃度為200和2 000 mg·kg-1時(shí),SOD活性較對照顯著上升42%和53%(P<0.05)。黑麥草的SOD活性隨著Cd2+濃度增加表現(xiàn)出先升后降再升的趨勢,其SOD活性在Cd2+濃度為200～2000 mg·kg-1時(shí)較對照升高106%和203%,其差異達(dá)極顯著水平(圖1A,P<0.01)。

圖1 不同濃度Cd2+處理對3種草坪草抗氧化酶活性和MDA含量的影響

白三葉POD活性隨著Cd2+濃度增加呈先升后降再升趨勢(圖1B),在Cd2+濃度為200和1 000 mg·kg-1時(shí)較對照升高75%和186%,其差異極顯著(P<0.01)。高羊茅的POD活性隨著Cd2+濃度增加而升高,在Cd2+濃度為500,1 000,2 000 mg·kg-1時(shí)分別為對照的2.6,3,3.9倍,其差異達(dá)極顯著水平(圖1B,P<0.01)。黑麥草的POD活性變化趨勢與白三葉一致,均隨著Cd2+濃度增加呈先升后降再升趨勢,在Cd2+濃度為2 000 mg·kg-1較對照上升74%,其差異極顯著(圖1B,P<0.01)。

白三葉CAT活性隨著Cd2+濃度增加而上升,在Cd2+濃度為200和500 mg·kg-1時(shí)與對照相比差異并不顯著(圖1C),在Cd2+濃度1 000 mg·kg-1時(shí)其CAT活性為對照的2.6倍,差異極顯著(P<0.01)。高羊茅的CAT活性在Cd2+濃度為500 mg·kg-1時(shí)較對照降低54%,差異極顯著(圖1C,P<0.01),在Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1時(shí)其CAT活性較對照升高94%,其差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。黑麥草的CAT活性隨著Cd2+濃度增加呈先升后降趨勢,在Cd2+濃度為500和1 000 mg·kg-1時(shí)分別為對照的3.1倍和3.3倍,其差異極顯著(圖1C,P<0.01),當(dāng)Cd2+濃度為200和2 000 mg·kg-1時(shí)差異并不顯著,但均高于對照。

不同濃度Cd2+脅迫均會(huì)增加白三葉、高羊茅和黑麥草的MDA含量(圖1D)。白三葉的MDA含量在Cd2+濃度200～1 000 mg·kg-1時(shí)其MDA含量為對照的5.6～6.3倍,其差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。高羊茅的MDA含量在Cd2+濃度為1 000～2 000 mg·kg-1時(shí)較對照顯著上升28%～29%(P<0.05)。黑麥草的MDA含量在Cd2+濃度500～2000 mg·kg-1時(shí)與對照相比升高68%～108%,其差異極顯著(P<0.01)。

2.3 Cd2+脅迫對草坪草葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1Cd2+脅迫對白三葉葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 白三葉葉肉細(xì)胞的各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)在對照中清晰(圖2A,D,G,J,M);當(dāng)Cd2+濃度為500 mg·kg-1時(shí)葉肉細(xì)胞中各細(xì)胞器沒有出現(xiàn)變化(圖2B,E,H,K,N);當(dāng)Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1時(shí),葉綠體發(fā)生聚集、數(shù)量減少、形狀變圓(圖2C),葉綠體膜發(fā)生不同程度的溶解,葉綠體內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)混亂、排列不整齊、部分變?yōu)闂l紋狀,質(zhì)間片層空間變小、出現(xiàn)輕微質(zhì)壁分離、部分溶解現(xiàn)象(圖2F)。

圖2 不同濃度Cd2+處理對白三葉葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.2Cd2+脅迫對高羊茅葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 在對照中,高羊茅葉肉細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞核、液泡、葉綠體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰,葉綠體的形狀為橄欖形或橢圓形,內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)明顯且排列整齊、淀粉粒清晰可見(圖3A,D,G,J,M)。在Cd2+濃度為500 mg·kg-1的處理下葉肉細(xì)胞沒有出現(xiàn)變化(圖3B,E,H,K,N);在Cd2+濃度2 000 mg·kg-1時(shí),葉綠體發(fā)生聚集、數(shù)量減少(圖3C),內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)被破壞,部分發(fā)生溶解斷裂(圖3F),細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)發(fā)生輕微凝聚(圖3L),細(xì)胞壁發(fā)生輕微質(zhì)壁分離(圖3O)。

圖3 不同濃度Cd2+處理對高羊茅葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.3Cd2+脅迫對黑麥草葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 黑麥草在對照中葉肉細(xì)胞的各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰,葉綠體為橢圓形,內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)排列整齊、大部分為矩形、基粒類囊體片層垛疊緊密;當(dāng)Cd2+濃度為500 mg·kg-1時(shí)其葉肉細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器沒有出現(xiàn)變化(圖4B,E,H,K,N);在Cd2+濃度為2 000 mg·kg-1時(shí),葉綠體數(shù)量減少,發(fā)生聚集(圖5C),內(nèi)部片層結(jié)構(gòu)模糊,基粒片層排列混亂且片層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)輕微溶解現(xiàn)象(圖4F),細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)略微凝聚(圖4L),葉綠體和細(xì)胞壁的質(zhì)壁分離現(xiàn)象明顯,細(xì)胞壁輕微皺縮,液泡略微縮小(圖4O)。

3 討論

重金屬脅迫對植物光合色素含量和葉綠體結(jié)構(gòu)的影響,直接影響其生長發(fā)育及形態(tài)功能。造成葉綠素含量降低有兩個(gè)原因,一是Cd與植物細(xì)胞中葉綠素合成酶相互作用,影響葉綠素前體合成,加快葉綠素分解[22];二是Cd破壞葉肉細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)功能,從而降低葉綠素合成酶的活性[23]。本研究表明白三葉、高羊茅和黑麥草的葉綠素含量隨Cd2+濃度增加而下降,與Huang等[24]在鎘對高羊茅光合活性的研究結(jié)果一致。高濃度Cd2+脅迫降低高羊茅葉綠素含量,影響高羊茅正常生長。類胡蘿卜素是重要的光合輔助色素,通過控制能量消耗和清除植物體內(nèi)的自由基來避免蛋白質(zhì)和葉綠素受到損傷[25],高濃度Cd2+脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基[26],超出抗氧化酶的清除能力,將會(huì)影響類胡蘿卜素合成。本研究中3種草坪草的類胡蘿卜素含量隨著Cd2+濃度增加而降低的結(jié)論,與董春燕[27]以三葉草(Trifoliumpretense)為實(shí)驗(yàn)材料的研究結(jié)果類似,當(dāng)鎘濃度為3.5 mmol·L-1時(shí)類胡蘿卜素含量較對照降低77.37%。

植物在逆境條件下會(huì)產(chǎn)生電子還原產(chǎn)物活性氧,其中包括超氧陰離子、過氧化氫等[28]。SOD酶能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫,POD酶的活性相對較高,CAT酶則能夠催化過氧化氫分解成氧和水[29]。本研究中3種草坪草在鎘脅迫下SOD和POD活性總體呈升高趨勢,與Lou等[30]發(fā)現(xiàn)在Cd脅迫下高羊茅SOD和POD活性增加,以保護(hù)植物免受重金屬誘導(dǎo)的氧化損傷的研究結(jié)論一致。抗氧化酶活性增加可將草坪草體內(nèi)過多的活性氧自由基轉(zhuǎn)化為毒害較低或無害物質(zhì),平衡活性氧含量,激活草坪草自身保護(hù)機(jī)制[6]。但是,當(dāng)重金屬濃度過高草坪草積累過量活性氧使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、色素和酶等受到氧化損傷[31],本研究中3種草坪草CAT活性隨著Cd2+濃度增加呈先升后降趨勢。韓寶賀等[32]研究結(jié)果中也有相同趨勢,低濃度Cd2+脅迫下,白三葉升高CAT活性來防止活性氧造成的毒害,但在Cd2+濃度300 μmol·L-1時(shí),植物體內(nèi)的氧化平衡被打破,其CAT活性急劇下降。MDA含量通常用于判斷植物細(xì)胞膜的損傷程度[33],其含量越高則表明對植物細(xì)胞膜的損傷越嚴(yán)重[34]。本研究中不同濃度的Cd2+脅迫均會(huì)增加草坪草的MDA含量,這與凌宇等[6]研究結(jié)果一致,在低、高濃度Cd2+脅迫下高羊茅和匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)MDA含量均高于對照。

植物細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化規(guī)律是判斷其抗逆能力的重要指標(biāo)之一[33]。植物受到鎘脅迫后其葉肉細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器的損傷主要體現(xiàn)在葉綠體、基粒片層、細(xì)胞壁、線粒體和細(xì)胞核等發(fā)生異常變化[24]。低濃度的Cd2+脅迫對草坪草葉片葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響不明顯,Cd2+濃度越高其各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損傷越嚴(yán)重,主要表現(xiàn)為細(xì)胞壁發(fā)生質(zhì)壁分離,葉綠體發(fā)生聚集、數(shù)量減少、形狀改變、內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)被破壞。孫圓圓等[35]在鎘脅迫對多花黑麥草(Loliummultiflorum)葉片超微結(jié)構(gòu)的研究中也得出相似結(jié)論,高濃度Cd脅迫對多花黑麥草葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有所損傷,部分葉綠體基粒片層溶解。綜上,草坪草受到高濃度的Cd2+脅迫后產(chǎn)生過多的活性氧自由基,其體內(nèi)將分泌大量的抗氧化酶來消除有害物質(zhì),超出抗氧化酶的清除能力,將引起膜脂過氧化反應(yīng)從而產(chǎn)生大量的MDA,損傷草坪草細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),使其發(fā)生質(zhì)壁分離,破壞葉綠體結(jié)構(gòu),進(jìn)而降低光合色素含量,抑制光合作用,毒害草坪草的生理生化,最終影響草坪草進(jìn)行正常的生命活動(dòng)。

4 結(jié)論

隨著Cd2+濃度增加,3種草坪草的生理損傷愈發(fā)嚴(yán)重,其光合色素含量不斷減少,MDA含量逐漸增加,SOD和POD活性總體上為上升趨勢,CAT活性呈先升后降趨勢。其中,Cd2+濃度為2 000 mg·kg-1時(shí),白三葉無法存活,高羊茅和黑麥草葉肉細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜和各細(xì)胞器均受到不同程度的破壞,高羊茅葉綠體損傷更嚴(yán)重。因此,黑麥草的耐受能力高于高羊茅和白三葉,建議在鎘污染較重的土壤選用高羊茅和黑麥草,鎘污染較輕的土壤選用白三葉。