楊 丹, 吳 碩, 陳丹丹, 張 慶

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院, 廣東木本飼料工程技術(shù)研究中心, 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510642)

全株玉米(Zeamays)是一種重要的青貯飼料原料,擁有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,良好的適口性和消化率[1]。全株玉米青貯是反芻動(dòng)物養(yǎng)殖過程中消耗最多的飼草產(chǎn)品,在畜牧養(yǎng)殖中占有重要地位[2]。然而,全株玉米青貯打開使用時(shí)極易發(fā)生有氧變敗,造成大量干物質(zhì)損失,甚至產(chǎn)生真菌毒素,滋生致病菌,導(dǎo)致動(dòng)物的發(fā)病甚至死亡。我國(guó)全株玉米青貯管理水平低,極易面臨有氧變敗的問題[3]。

植物精油是在植物中提取的揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物,因其抗氧化、抑菌消炎、預(yù)防疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),防止飼料霉變等功效,在畜牧生產(chǎn)應(yīng)用廣泛[4-5]。植物精油在食品加工中常被用做天然防腐劑,能夠?qū)χ虏⌒源竽c桿菌和金黃色葡萄球菌等食源性致病菌起抑制作用[6]。同時(shí),添加桉葉精油和迷迭香精油可以降低柱花草青貯pH值,抑制大腸桿菌,提高乳酸含量和蛋白質(zhì)保存,顯著改善了青貯飼料品質(zhì)[7]。添加山蒼子精油可以抑制霉菌,減緩青貯玉米中粗蛋白質(zhì)和氨基酸的損失[8]。植物精油抑菌效果良好,特別是對(duì)引起青貯有氧變敗的酵母菌和霉菌等真菌有良好的抑制作用,在提高全株玉米青貯有氧穩(wěn)定有潛在的應(yīng)用價(jià)值[9]。

黃梁木(Neolamarckiacadamba)是一種起源于熱帶和亞熱帶的常綠闊葉喬木,含有豐富的生物活性成分如黃酮、酚類、生物堿、萜類、皂苷、多糖及單寧等,具有抗菌消炎、降血糖、抗腹瀉、抗氧化及抗癌等功效,用途極為廣泛[10-11]。近年來,因其生長(zhǎng)速度快,葉片蛋白質(zhì)含量高,且富含多種活性成分被廣泛用做木本飼料[12-13]。黃梁木葉自然青貯品質(zhì)pH值可達(dá)3.86～4.02,能夠有效抑制不良微生物,作為添加劑可以降低苜蓿、柱花草和全株玉米青貯中不良微生物的含量,提高青貯后牧草中蛋白質(zhì)的保存率[14]。

目前,大多數(shù)研究都集中黃梁木提取物的生物活性,據(jù)其他學(xué)者的研究報(bào)道[15],推測(cè)黃梁木中可能含有揮發(fā)性抑菌活性成分,能夠影響青貯中有氧穩(wěn)定,但關(guān)于黃梁木中揮發(fā)性活性成分的研究還較少。因此,本研究采用水蒸氣蒸餾法在黃梁木鮮葉中提取黃梁木精油,并通過氣相-質(zhì)譜聯(lián)用探究黃梁木精油主要成分及對(duì)全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響,為促進(jìn)黃梁木在畜牧業(yè)中的應(yīng)用,減少飼料損失和提高全株玉米有氧穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及精油制備

本試驗(yàn)所選用的華美糯玉米和黃梁木種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林北試驗(yàn)田。黃梁木精油以黃梁木葉片為原料,采用水蒸氣蒸餾法提取。黃梁木葉片冷凍粉碎后置于圓底燒瓶中,加入蒸餾水,蒸餾提取至無油狀物餾出為止(料液比1∶2,提取時(shí)長(zhǎng)約3 h)。將蒸餾出的黃梁木精油以每分鐘6 000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速離心10 min,除去上層蒸餾水,并用足量的無水Na2SO4干燥后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2022年6月乳熟期人工收割華美糯玉米,用粉碎機(jī)將采集材料粉碎成1～2 cm的小段,混合均勻后取1 kg全株玉米裝入青貯袋并用真空封口機(jī)密封。青貯70天后按照0.625(N1),1.25(N2),2.5(N4)和3.75(N6)mL·kg-1比例添加黃梁木精油,并設(shè)立空白對(duì)照組(CK)。不同處理組樣品混合均勻后裝入塑料桶,用一層聚乙烯塑料薄膜覆蓋桶,扎出氣孔,一共5個(gè)處理組,每組3個(gè)重復(fù),在室溫保存。在有氧暴露第0天和第7天對(duì)青貯飼料進(jìn)行發(fā)酵特性、化學(xué)成分和有氧穩(wěn)定性分析。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1有氧穩(wěn)定性測(cè)定 用溫度記錄儀(SMOWO MDL-1048A,上海天賀自動(dòng)化儀表有限公司)監(jiān)測(cè)塑料桶樣品中心內(nèi)的溫度和環(huán)境溫度,設(shè)定每隔10 min記錄一次溫度。有氧穩(wěn)定性是指青貯溫度不高于環(huán)境溫度2℃的保存時(shí)間。

1.3.2微生物數(shù)量測(cè)定 根據(jù)Wang等[16]所述,分別在有氧暴露的第0天和第7天測(cè)定了青貯樣品的發(fā)酵特性和化學(xué)成分。將10 g的鮮樣加入90 mL無菌生理鹽水,搖晃混勻,將上清液從10-1梯度逐層稀釋至10-6倍,用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定乳酸菌、大腸桿菌和酵母菌的數(shù)量。

1.3.3pH值及化學(xué)成分測(cè)定 取10 g鮮樣加入90 mL純水于4℃冰箱充分浸泡,24 h后取出用定性濾紙過濾,使用雷磁PHS-3C型pH計(jì)(上海市精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定濾液pH值。采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性碳水化合物含量[17]。取適量樣品,稱重記錄,置于65℃恒溫干燥箱烘干48 h,計(jì)算樣品烘干后的重量與烘干前的重量的百分比就是干物質(zhì)含量。稱取烘干后粉碎的樣品0.5 g,加入適量催化劑(硫酸銅與硫酸鉀按1∶5的比例配置)和濃硫酸于420℃消煮2 h,消煮完畢使用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量(Kjeltec8400,美國(guó)FOSS)。使用纖維分析儀(2000,英國(guó)Ringbio)分析中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量[18]。

1.3.4黃梁木精油成分分析 采用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析黃梁木精油的主要成分。從-80℃冰箱中取出樣品進(jìn)行液氮研磨,渦旋混合均勻,每個(gè)樣本稱取約1 mL于頂空瓶中,加入飽和NaCl溶液和10 μL(50 μg·mL-1)內(nèi)標(biāo)溶液,全自動(dòng)頂空固相微萃取HS-SPME進(jìn)行樣本萃取,以供GC-MS分析。HS-SPME萃取條件:在60℃恒溫條件下,震蕩5 min,120 μm DVB/CWR/PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶,頂空萃取15 min,于250℃下解析5 min,然后進(jìn)行GC-MS分離鑒定。色譜條件:DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA),載氣為高純氦氣(純度不小于99.999%),恒流流速每分鐘1.2 mL,進(jìn)樣口溫度250℃,不分流進(jìn)樣,溶劑延遲3.5 min。程序升溫:40℃保持3.5 min,以每分鐘10℃升至100℃,再以每分鐘7℃升至180℃,最后以每分鐘25℃升至280℃,保持5 min。質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230℃,四級(jí)桿溫度150℃,質(zhì)譜接口溫度280℃,電子能量70 eV,掃描方式為選擇離子檢測(cè)模式(SIM),定性定量離子精準(zhǔn)掃描(GB 23200.8-2016)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,SPSS 23.0對(duì)整理好的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,使用鄧肯極差法對(duì)各個(gè)樣本均值之間的差異多重比較,P<0.05為差異顯著。使用GraphPad Prism 8、Adobe Illustrator CC2018進(jìn)行繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃梁木精油的主要成分

通過水蒸氣蒸餾法提取的黃梁木精油是一種淡黃色透明油狀液體,密度(1.19 g·mL-1)高于水。黃梁木精油經(jīng)GC-MS檢測(cè)的總離子流圖如圖1所示,一共分離鑒定出977種代謝物。主要化學(xué)成分名稱、相對(duì)含量和分類見表1和圖3。黃梁木精油成分復(fù)雜,含有多種化合物,其中種類較豐富的有萜類219種(22.4%),酯類156種(16.0%),酮98種(10.0%),醇97種(9.9%),雜環(huán)化合物97種(9.9%),醛76種(7.7%),烴類75種(7.6%)和芳烴類74種(7.5%)。相對(duì)含量較高的化學(xué)成分是1,5-二甲基-2,6-雙(亞甲基)-環(huán)辛烷(34.15%),N-苯基-甲酰胺(23.20%),甲酸芳樟酯(12.09%),(1α,4α,4aα,5aα)-4,4a,5,5a-四氫-6,6-二甲基-1,4-甲基-1H-環(huán)丙[d]噠嗪(7.09%),1-甲基-4-硝基-苯(2.32%),4-甲基-苯甲酸(2.19%),L-香30芹醇(1.98%)和5-甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)己酮(1.32%)。

表1 黃梁木精油的主要成分名稱和相對(duì)含量

表3 青貯原料特征

圖1 黃梁木精油總離子流圖

圖2 黃梁木精油主要物質(zhì)種類占比扇形圖

圖3 不同處理全株玉米青貯有氧暴露期間溫度變化圖

2.2 青貯原料的特點(diǎn)

全株玉米新鮮原料的干物質(zhì)含量為20.09% DM,粗蛋白質(zhì)含量為9.79% DM。中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和可溶性碳水化合物含量分別為50.25% DM,22.71% DM和17.54% DM。微生物乳酸菌、酵母菌、霉菌和大腸桿菌分別為6.49,4.63,3.59和7.32 lg cfu·g-1FM。

2.3 全株玉米青貯添加黃梁木精油的有氧穩(wěn)定性

由圖3和圖4可知,黃梁木精油可以提高全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性,CK組全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性為46.17 h,N1和N2組的有氧穩(wěn)定性分別為52.17 h和82.5 h。當(dāng)黃梁木添加量為N4(2.5 mL·kg-1)和N6(3.75 mL·kg-1)時(shí),全株玉米青貯在有氧暴露7天之內(nèi)均比較穩(wěn)定,N4處理組的全株玉米青貯在有氧暴露84 h后溫度略有升高但低于室溫2℃,而N6處理組的全株玉米青貯有氧暴露7天內(nèi)溫度保持和室溫一致。在全株玉米青貯中添加2.5 mL·kg-1的黃梁木精油即可保持青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。

圖4 不同處理全株玉米青貯有氧穩(wěn)定

2.4 有氧暴露后全株玉米青貯的發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分

有氧暴露對(duì)全株玉米青貯干物質(zhì)含量、pH值、乳酸菌數(shù)量和酵母菌數(shù)量均有顯著影響(P<0.05)(表4)。CK組在有氧暴露7天后干物質(zhì)含量顯著降低(P<0.05),從22.24%下降到16.34%。pH值和微生物數(shù)量均顯著上升(P<0.05)。隨著黃梁木精油添加比例的增加,全株玉米青貯的干物質(zhì)含量顯著升高(P<0.05),pH值、乳酸菌數(shù)量和酵母菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)。其中,N4處理的干物質(zhì)、pH值和乳酸菌數(shù)量與CK組無明顯變化,N6處理組的能夠降低全株玉米青貯pH值,達(dá)到最低值,為3.88。精油添加組中的大腸桿菌和霉菌數(shù)量除N1處理組以外,其他組均未被檢測(cè)到。

表4 全株玉米青貯有氧暴露后發(fā)酵參數(shù)和微生物數(shù)量

有氧暴露對(duì)全株玉米青貯中的蛋白組分和纖維產(chǎn)生顯著的影響(表5)。CK組在有氧暴露7天后粗蛋白質(zhì)含量從9.40%到12.48%,中性洗滌纖維含量從49.18%到61.58%,酸性洗滌纖維含量從21.77%到30.97%,均顯著上升(P<0.05)。添加黃梁木精油后,N1,N2,N4組的粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均顯著降低(P<0.05)。當(dāng)黃梁木添加量為N4(2.5 mL·kg-1)和N6(3.75 mL·kg-1)時(shí),飼料中的粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量與有氧暴露第0天無顯著變化。

表5 全株玉米青貯有氧暴露后的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)

3 討論

3.1 黃梁木精油的成分

黃梁木精油成分復(fù)雜,含有多種代謝物。大多數(shù)植物精油的成分以萜烯類化合物、芳香族化合物和脂肪族化合物等成分為主[19]。黃梁木精油含有相對(duì)含量較高的烴類、芳烴和酯類等物質(zhì)。另外,黃梁木精油還含有種類較豐富的雜環(huán)化合物,彭莘媚等[20]發(fā)現(xiàn)香豆素雜環(huán)化合物具有廣泛的生物活性,其結(jié)構(gòu)中的香豆素環(huán)和噻唑環(huán)對(duì)抗真菌活性起促進(jìn)作用。因此,本研究中相對(duì)含量較高的雜環(huán)化合物可能是黃梁木精油抑菌效果良好的原因之一。Das等[21]發(fā)現(xiàn),芹菜精油中含量最高的單體化合物乙酸芳樟酯對(duì)真菌具有較好的抑菌效果,僅5.5 μL·mL-1的乙酸芳樟酯就能抑制黃曲霉合成黃曲霉毒素。因此,黃梁木精油主要成分之一的甲酸芳樟酯可能對(duì)真菌具有較好的抑制效果。將黃梁木精油用于提高全株玉米青貯有氧穩(wěn)定可能是一條有效的途徑。

3.2 青貯前全株玉米鮮料的化學(xué)特性和微生物數(shù)量

本研究中,全株玉米的DM含量低于已有研究測(cè)定的玉米值(DM:27.2%)[22],DM和WSC含量對(duì)于青貯至關(guān)重要,為乳酸菌提供足夠的發(fā)酵底物[23]。據(jù)Bai等[24]通過對(duì)比兩種不同水分水平的玉米植株,發(fā)現(xiàn)高含水量的全株玉米青貯飼料比低水分的全株玉米青貯飼料表現(xiàn)出更高的有氧穩(wěn)定性。另外,微生物數(shù)量是決定青貯發(fā)酵的因素之一,全株玉米的乳酸菌數(shù)量已達(dá)到良好青貯飼料標(biāo)準(zhǔn)(>5.0 lg cfu·g-1FM)可以進(jìn)行大量的乳酸發(fā)酵[26]。但酵母菌和大腸桿菌的數(shù)量與乳酸菌差異變化不顯著,可能會(huì)影響乳酸菌發(fā)酵,產(chǎn)生有害物質(zhì),造成蛋白質(zhì)損失,降低青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)[15]。

3.3 黃梁木精油對(duì)全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響

有氧穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)青貯飼料品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo),由于青貯飼料有氧暴露是無法避免的,往往會(huì)導(dǎo)致飼料的營(yíng)養(yǎng)成分流失、毒素積累,而較高的有氧穩(wěn)定性可以使青貯保持優(yōu)良的適口性,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不易被降解[25]。當(dāng)好氧真菌暴露在空氣中大量繁殖生長(zhǎng),乳酸和可溶性碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗,代謝產(chǎn)熱,從而青貯飼料的pH值和溫度逐漸上升。隨著有氧暴露時(shí)間延長(zhǎng),青貯溫度在好氧真菌旺盛生長(zhǎng)期間達(dá)到峰值,添加黃梁木精油后顯著降低了全株玉米青貯飼料的最高溫度[27]。N4處理組的全株玉米青貯在有氧暴露84 h后溫度略有升高但低于室溫2℃,而N6處理組的全株玉米青貯有氧暴露7天內(nèi)溫度保持和室溫一致。這可能是有氧暴露7天后,添加黃梁木精油顯著降低了酵母菌數(shù)量,抑制好氧真菌生長(zhǎng)。當(dāng)添加2.5 mL·kg-1的黃梁木精油時(shí)即可以有效提高全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性。

3.4 有氧暴露階段黃梁木精油對(duì)全株玉米青貯品質(zhì)的影響

黃梁木精油可以提高華美糯全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性,抑制酵母菌、霉菌等不良微生物的生長(zhǎng),避免干物質(zhì)的降解[28]。本研究中,添加黃梁木精油很好的抑制了大腸桿菌和霉菌的生長(zhǎng)。N2、N4和N6處理的大腸桿菌和霉菌均低于檢測(cè)值。表明黃梁木精油中的一些活性成分抑菌作用明顯,抑制了不良微生物的活性,并且精油添加量越高,抑菌作用更顯著。華美糯全株玉米青貯有氧暴露以后,干物質(zhì)中纖維含量顯著升高。纖維含量是評(píng)價(jià)青貯飼料的一個(gè)重要指標(biāo),飼料中高含量的粗纖維會(huì)降低動(dòng)物的采食量和干物質(zhì)消化率,甚至?xí)档蜕a(chǎn)性能[29]。本試驗(yàn)中,全株玉米青貯的粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量在有氧暴露階段顯著上升,這可能很大程度上受酵母菌影響。在有氧暴露期間,酵母菌等好氧微生物消耗了青貯中可溶性碳水化合物、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),造成有氧變質(zhì),導(dǎo)致纖維、粗蛋白在干物質(zhì)中的含量相對(duì)上升,纖維含量的升高也表明青貯品質(zhì)的下降[30-31]。在全株玉米中添加黃梁木精油可以抑制不良微生物的活性,減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失[32]。

4 結(jié)論

黃梁木精油成分復(fù)雜,含有多種代謝物,其中種類較豐富的有萜類(219種)、酯類(156種)和酮(98種),相對(duì)含量最高的化合物是1,5-二甲基-2,6-雙(亞甲基)-環(huán)辛烷(34.15%)。有氧暴露7天后,添加黃梁木精油可以抑制大腸桿菌、霉菌和酵母菌等不良微生物的活性,減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失,對(duì)青貯飼料的有氧穩(wěn)定具有改善作用。不同添加量的黃梁木精油均可以提高全株玉米(華美糯)青貯的有氧穩(wěn)定性,當(dāng)黃梁木精油的添加量為2.5 mL·kg-1即可保持全株玉米青貯有氧穩(wěn)定性。