鐘春燕 何宇鴻 李元樞 葉玨穎 何阮瀅 曹穎男

(廣州新華學院藥學院,廣東 廣州 510520)

非小細胞肺癌(NSCLC)發(fā)生發(fā)展與體內特定促癌基因活性增強或抑癌基因活性降低、微環(huán)境持續(xù)致?lián)p、慢性炎癥、缺氧、酸性態(tài)等因素有關。中醫(yī)理論認為癌癥的發(fā)生發(fā)展主要是由于正氣虛損、陰陽失衡,致使氣滯血瘀、痰凝毒聚導致的〔1〕,治療上以扶正袪邪為主,如益氣、養(yǎng)血、滋陰、溫陽,輔以軟堅散結、活血化瘀、化痰利濕、清熱解毒等療法,實現(xiàn)標本兼治〔2〕。雞血藤是一種傳統(tǒng)的活血補血中藥,具有活血補血、調經止痛、舒筋活絡的功效,為豆科植物密花豆的干燥藤莖〔3〕,其所含化學成分有黃酮、酚、木脂素、甾醇及揮發(fā)油等,其除了活血、促進造血的功效外,其還有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多樣藥理學活性〔4～8〕。雞血藤的黃酮類組分和縮合鞣質對腫瘤細胞有明顯的抑制作用〔9～12〕,該藥主要通過細胞凋亡和自噬、腫瘤細胞周期阻滯和抑制腫瘤轉移發(fā)揮抗腫瘤作用〔13〕。本實驗對雞血藤復方提取物進行抗腫瘤及免疫調節(jié)初步驗證,為進一步開發(fā)應用中藥抗腫瘤價值提供藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料及動物 lewis肺癌細胞株(中國科學院細胞庫/干細胞庫),復蘇培養(yǎng),以107/只接種于C57小鼠腋下用于試驗。50只SPF級雄性健康C57小鼠,購入時4周齡。體質量18～20 g,購自中山大學實驗動物中心東校區(qū),實驗動物合格證號為:NO.44008500014488。實驗動物使用許可證號:SYXK(粵)2016-0112,飼養(yǎng)于中山大學實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境動物房,溫度20～25 ℃,濕度40%～70%,換氣次數(shù)>10次/h,飼養(yǎng)密度:5只/籠,照明時間:12 h,自由攝食飲水〔飼料,生產單位:廣東省醫(yī)學實驗動物中心,生產許可證:SCXK(粵)2008-0002〕。

1.2藥材 在前期研究基礎上〔14〕根據(jù)君臣佐使進一步優(yōu)化,得到中藥復方:雞血藤20 g(批號2002003),柴胡15 g(批號2002002),蚤休15 g(批號2002006),莪術15 g(批號2004062),蜈蚣10 g(批號2002008),黃芪30 g(批號2002021),均購自清遠醫(yī)農坤載大藥房有限公司。藥材粉碎,稱重,第1次提取:將稱好的藥材置于圓底燒瓶中,加入10倍的水進行回流提取2 h(沸騰才開始計時),同時收集揮發(fā)油,用二層100目紗布進行過濾。第2次提取:往濾渣中加入8倍量的水進行提取,時間為1.5 h(沸騰才開始計時),同時收集揮發(fā)油,二層100目紗布過濾,合并二次濾液進行抽濾。抽濾液用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮,濃縮到一定程度(約2%濾液),傾出用水浴鍋繼續(xù)濃縮,濃縮到每ml含生藥量約3.2 g,加入揮發(fā)油合并為復方提取物,置于4 ℃冰箱待用。

1.3主要儀器及試劑 主要儀器:冷凍離心機(MIKRO 200R,Andreas Hettich GmbH &Co.KG)、Thermo Multiskan Go全波長酶標儀(美國Thermo Fisher公司);BSA124-CW電子天平〔賽多利斯(上海)貿易有限公司〕。主要試劑:生理鹽水水(山東華魯制藥有限公司,批號:016101215),小鼠干擾素(INF)-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(批號:H11017904),白細胞介素(IL)-4 ELISA檢測試劑盒(批號:L11017905)購自武漢華美生物科技有限公司。

1.4分組與給藥途徑 隨機分為5組,每組10只,模型組灌胃給予溶媒0.2 ml/10 g,陽性藥組腹腔注射環(huán)磷酰胺30 mg/kg。雞血藤復方提取物按照該組方的1、2、4倍于臨床等效劑量換算為小鼠劑量〔15〕:低、中、高劑量組灌胃給予6.25、12.50、25.00 ml原液/kg。

1.5荷瘤鼠制備 取復蘇的鼠源Lewis肺癌細胞5管,每管數(shù)量約為1×107,接種至C57小鼠腋下皮下,讓其自然生長,約14 d,長到直徑1 cm以上。

1.6腫瘤接種及給藥 選擇腫瘤生長旺盛且無潰破的荷瘤鼠,頸椎脫臼處死,在無菌條件下(超凈臺或接種罩),用新潔爾滅消毒皮膚,切開皮膚,剝離腫瘤。將瘤組織剪成1.5 mm3左右,用套管針接種于受試小鼠雙側腋窩皮下,次日按體質量隨機分組,同時開始給藥,各組均每日給藥1次,連續(xù) 14 d。

1.7測定指標 (1)各組小鼠于給藥前及給藥后7、14 d進行體質量稱量;(2)實驗結束后,各組小鼠摘眼球取血約0.6 ml,分離血清,冷藏備用,用于測定INF-γ、IL-4;又取血約0.4 ml抗凝,用流式細胞儀進行CD4+、CD8+檢測。(3)處死并解剖各組小鼠,分離出胸腺和脾臟,分別稱重,計算臟器指數(shù),臟器指數(shù)=胸腺或脾臟(mg)/小鼠體質量(g)。(4)各組小鼠剝除完整的腫瘤塊并馬上稱重量,計算腫瘤抑制率,腫瘤抑制率=(空白組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/瘤重×100%。(5)動物病理檢測:每組小鼠剝取Lewis肺癌實體瘤后,標本在10%甲醛溶液中固定完全后取部分腫瘤組織,經脫水、包埋、切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,用普通光學顯微鏡觀察,結合參考文獻對組織病理病變分級進行判定〔16〕,組織病理病變分級標準:組織壞死0%～5% 1分,6%～15% 2分,16%～30% 3分,31%～60% 4分,61%～100% 5分。組織病理炎癥細胞浸潤程度分級標準:正常(無炎癥細胞浸潤)0分,最輕度(浸潤<1%)1分,輕度(浸潤1%～25%)2分,中度(浸潤26%～50%)3分,重度(浸潤51%～75%)4分,超重度(浸潤76%～100%)5分。

1.8統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism6.0生物統(tǒng)計學軟件進行方差分析、Dunnett多重比較、Kruskal-Wallis秩和檢驗。

2 結 果

2.1雞血藤復方提取物對體質量的影響 如表1所示,與模型組比較,給藥7、14 d后,各給藥組體質量均有不同程度減輕,其中高劑量組、陽性藥組體質量減輕均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。

表1 各組體質量和血清IFN-γ、IL-4及瘤重、腫瘤抑制率比較

2.2雞血藤復方提取物對血清中免疫細胞因子INF-γ、IL-4的影響 如表1所示,與模型組比較,低、中、高劑量組血清中INF-γ、IL-4含量均不同程度升高,但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3雞血藤復方提取物對小鼠瘤重、腫瘤抑制率的影響 如表1所示,與模型組比較,各給藥組小鼠瘤重均不同程度降低,其中高劑量組、陽性藥組瘤重降低差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。

2.4雞血藤復方提取物對胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響 如表2所示,與模型組比較,陽性藥組脾臟指數(shù)有下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),胸腺重量、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著下降(P<0.05)。

表2 各組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、病理評分比較

2.5肉眼及鏡下觀察小鼠腫瘤病理學改變 肉眼可見:模型組腫瘤體積較大,形態(tài)不規(guī)則,質脆易破,切開后極少見腫瘤組織壞死;低劑量組腫瘤體積較模型組略小,形態(tài)不規(guī)則,切開后少見腫瘤組織壞死;中劑量組腫瘤體積較模型組減小,形態(tài)不規(guī)則,切開后可見腫瘤組織壞死;高劑量組腫瘤體積較模型組明顯減小,形態(tài)不規(guī)則,切開后可見較多腫瘤組織壞死;陽性藥組腫瘤體積較模型對照組明顯減小,切開后可見大量腫瘤組織壞死。見圖1。與模型組相比,高劑量組和陽性藥組的組織壞死程度明顯增多(P<0.05,P<0.01)。見表2。

圖1 肉眼觀測各組腫瘤形態(tài)

經顯微鏡下觀察得知:模型組腫瘤鏡下見細胞密集排列,細胞核肥大、畸形,染色深,核染色分布不均勻,病理性核分裂現(xiàn)象多見,異型性明顯。低劑量組腫瘤鏡下見細胞密集排列稍減低,細胞核肥大、畸形,染色深,核染色分布不均勻,病理性核分裂現(xiàn)象多見,異型性明顯;腫瘤組織間質中可見淋巴細胞浸潤。中劑量組腫瘤鏡下見細胞密集排列減低,染色質濃縮邊集,病理性核分裂現(xiàn)象較多,異型細胞較多;部分瘤組織破壞;腫瘤組織間質中可見淋巴細胞浸潤。高劑量組腫瘤鏡下見細胞密集排列減低,病理性核分裂現(xiàn)象降低,異型細胞降低;部分瘤組織破壞;腫瘤組織間質中可見淋巴細胞浸潤。陽性藥組腫瘤鏡下見細胞密集排列明顯減低,病理性核分裂現(xiàn)象降低,異型細胞降低;大量瘤組織破壞;腫瘤組織間質中可見大量炎細胞浸潤。見圖2。

圖2 各組腫瘤病理學改變(HE染色)

3 討 論

腫瘤的發(fā)生是細胞生長異常、分化失控的結果,目前認為是癌基因、腫瘤抑制基因、凋亡調節(jié)基因和DNA修復調節(jié)基因等多個基因聯(lián)合發(fā)生突變造成的。 近年來,臨床研究指出,惡性腫瘤發(fā)病可能和細胞因子具有密切關系,機體遭受損傷后免疫系統(tǒng)會誘導生成炎癥細胞,大量釋放炎性因子、趨化因子等,產生腫瘤微環(huán)境,加速腫瘤血管生成、增殖、細胞浸潤及轉移等〔17〕。中醫(yī)藥方劑往往有多種有效成分可針對腫瘤的多種發(fā)病機制發(fā)揮作用,調控多種信號通路,抑制多種炎癥因子的優(yōu)勢〔18〕。中醫(yī)藥在現(xiàn)代腫瘤治療中起到增效減毒、預防復發(fā)轉移等補充治療作用〔19〕。雞血藤是一味養(yǎng)血活血中藥,中醫(yī)古籍記載用于治療月經不調、血虛萎黃、風濕痹痛等癥。雞血藤具有促進骨髓造血、改善血流動力學、降壓、雙向調節(jié)免疫功能、抗病毒作用。有研究報道,雞血藤對小鼠移植性H22肝癌、Lewis肺癌、S180肉瘤均有一定的抑制作用,并且雞血藤在抗腫瘤的同時,具有增加白蛋白水平、增強免疫、減輕骨髓抑制的作用。本實驗結果提示,雞血藤復方提取物可以抑制腫瘤生長。INF-γ是重要的免疫應答調節(jié)劑,由T輔助(Th)1細胞分泌,它能激發(fā)細胞介導的免疫反應來殺滅細胞內病原菌?？稍隗w內增強自然殺傷(NK)細胞和T細胞的免疫反應〔20,21〕。激活單核巨噬細胞,增強抗原提呈,促進Th0細胞向Th1分化〔22〕。同時也可以通過調節(jié)細胞周期、抑制血管生成、增強腫瘤的免疫原性、調節(jié)腫瘤微環(huán)境等途徑抑制腫瘤發(fā)生〔23〕。IL-4由Th2細胞分泌,激發(fā)體液免疫,產生抗體,殺滅細胞外病原菌〔24〕。IL-4作用包括刺激B細胞、促使B細胞向漿細胞分化及誘導B細胞分泌免疫球蛋白(Ig)E,促使Th細胞向Th2型細胞分化,并抑制Th1型細胞產生。本實驗INF-γ和IL-4無統(tǒng)計學意義的原因可能是藥物劑量仍未到適宜濃度,后續(xù)可調整劑量進行測試。生物反應調節(jié)劑與傳統(tǒng)的化療藥物相比,細胞毒性更小,可增強機體免疫功能,對腫瘤細胞的特異性和選擇性更強。研究發(fā)現(xiàn),通過免疫治療的方法成了肺癌新的治療方法,化療與免疫治療也有一定的協(xié)同增強效果,進一步增加抗腫瘤效果〔25～28〕。本實驗結果提示,環(huán)磷酰胺在發(fā)揮抗腫瘤作用時,會明顯對人體免疫系統(tǒng)造成傷害,導致免疫功能下降,患者體質較差,易發(fā)生并發(fā)癥,增加治療難度。本研究結果提示,雞血藤復方提取物不會對人體免疫系統(tǒng)造成損傷,甚至對免疫系統(tǒng)有所增強,該復方可能利于輔助抗腫瘤治療,提高抗腫瘤效果,減輕放化療對身體造成的毒性副作用。

綜上,雞血藤復方提取物具有抑制腫瘤生長的作用,其作用機制可能是作為生物反應調節(jié)劑,參與調節(jié)免疫功能、促進腫瘤細胞死亡、抑制腫瘤細胞增殖等相關。