陳 媛 李大鵬 成偉麗

(秦皇島市第四醫(yī)院胃腸腫瘤科,河北省秦皇島市 066000)

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤,因起病隱匿,早期無典型癥狀,多數(shù)胃癌患者確診時病情已處于中晚期,手術(shù)治療效果差,病死率高[1],故化療在中晚期胃癌的治療中意義重大。如腫瘤對化療藥物產(chǎn)生耐藥,不僅影響治療效果,還會延誤病情[2]。因此,尋找能夠客觀、準(zhǔn)確評估化療效果的生物標(biāo)記物,對胃癌患者的化療效果及預(yù)后評估具有重要意義。

奧沙利鉑和順鉑等鉑類藥物是治療胃癌的常用藥物,此類藥物可通過鉑-DNA加合物靶向DNA,引起DNA畸變而調(diào)控DNA修復(fù)。若DNA修復(fù)功能受損可引起DNA不穩(wěn)定,導(dǎo)致DNA鏈斷裂甚至細(xì)胞死亡,增加腫瘤的發(fā)生概率,但如果DNA修復(fù)能力過強(qiáng),則會產(chǎn)生耐藥[3]。因此,有效控制DNA修復(fù)基因的修復(fù)功能是保證化療效果的重要前提。癌變細(xì)胞中X-射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白6(X-ray repair cross complementing 6,XRCC6)是人體重要的DNA修復(fù)酶,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用,但其在胃癌化療效果中的研究報(bào)告較少[4]。基于此,本研究通過檢測術(shù)后行奧沙利鉑+替吉奧化療方案治療的胃癌患者XRCC6基因的基因型分布頻率,分析XRCC6基因多態(tài)性與術(shù)后化療胃癌患者預(yù)后的關(guān)系,旨在為個體性化療方案的制訂,改善患者的化療效果及預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2018年2—12月收治的99例胃癌患者作為研究對象,其中男性66例、女性33例,年齡28～83(55.32±3.26)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為胃癌;臨床分期Ⅱ～Ⅲ期;年齡>18歲;均為在我院接受胃癌切除手術(shù)和術(shù)后化療治療的初治患者;臨床資料完整;患者或家屬知情且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤者;合并先天性免疫疾病或全身血液疾病者;認(rèn)知障礙或精神疾病者;隨訪期間非疾病死亡或失訪的患者。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 術(shù)后輔助化療方案 奧沙利鉑140 mg/m2(每周期第1天給藥)溶入500 mL 5%葡萄糖溶液中,靜脈滴注2～6 h;口服替吉奧膠囊40 mg/m2(每周期第1～14天給藥),2次/d。每個治療周期為21 d,共治療4個周期。

1.3 XRCC6基因rs2267437位點(diǎn)基因型的檢測方法 抽取患者入院時空腹外周靜脈血約3 mL,置于抗凝管內(nèi),以10 000 r/min離心5 min,去除上清液,采用酚-氯仿法常規(guī)提取血清DNA。PCR擴(kuò)增的上游引物序列為5′-CTTCAGACCACTCTCTTCTC-3′,下游引物序列為5′-TCACCTCACAGTAGTCGTTG-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL,包括DNA模板2 μL、PCR Master Mix [天根生化科技(北京)有限公司]12.5 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、去離子水6.5 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性1 min,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共40個循環(huán)。使用Xmn Ⅰ限制性內(nèi)切酶[生工生物工程(上海)股份有限公司]將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng),酶切反應(yīng)體系總計(jì)20 μL,包括PCR產(chǎn)物7 μL、RE 10×Buffer 2 μL、乙?；Ｑ灏椎鞍?.2 μL、XmnⅠ 0.5 μL、去離子10.3 μL。37 ℃水浴30 min后將酶切產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠的負(fù)極加樣孔中,加入DNA Marker [天根生化科技(北京)有限公司]進(jìn)行標(biāo)記,以0.5×TBE進(jìn)行電泳,接通恒壓恒流電泳儀,電壓3～6 V,電流20 mA,電泳時間約30 min,用ZE-7型手提式紫外檢測燈(上海寶山顧村電光儀器廠)觀察電泳情況,根據(jù)凝膠電泳結(jié)果中目的基因片段出現(xiàn)的情況判斷各等位基因和基因型的分布(見圖1),電泳判定rs2267437位點(diǎn)C、G等位基因產(chǎn)物大小分別為225 bp和230 bp。采用反向測序法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,驗(yàn)證XRCC6基因有CC、CG、GG 3種基因型和C、G兩種等位基因,其中CC型為野生純合型,CG型為突變雜合型,GG型為突變純合型。

圖1 酶切產(chǎn)物XRCC6基因rs2267437位點(diǎn)產(chǎn)物電泳圖

1.4 臨床病理資料的收集 收集患者的年齡、性別、吸煙情況(吸煙量為10支/d或吸煙1年以上為存在吸煙史)、飲酒情況(每月至少飲酒1次或飲酒半年以上為存在飲酒史)、腫瘤直徑、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度、腫瘤臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床病理資料。

1.5 隨訪與分組 以電話、微信、門診等方式進(jìn)行隨訪,隨訪內(nèi)容為化療開始至化療36個月后胃癌患者的生存情況。根據(jù)存活情況,將患者分為存活組56例和死亡組43例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用COX回歸模型分析胃癌患者預(yù)后的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同預(yù)后胃癌患者臨床病理特征的比較 兩組患者的腫瘤直徑、腫瘤臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);其中,死亡組腫瘤直徑>5 cm、腫瘤臨床分期為Ⅲ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者比例更高(均P<0.05)。見表1。

表1 不同預(yù)后胃癌患者臨床病理特征的比較[n(%)]

2.2 不同預(yù)后胃癌患者XRCC6基因的基因型分布頻率的比較 兩組患者的XRCC6基因的基因型分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.468,P=0.003);其中,死亡組患者的XRCC6基因GG基因型、CG基因型的頻率均低于存活組(均P<0.05)。見表2。

表2 不同預(yù)后胃癌患者XRCC6基因的基因型分布頻率的比較[n(%)]

2.3 胃癌患者化療后預(yù)后影響因素的多因素COX回歸分析 以預(yù)后(1=死亡,0=存活)作為因變量,以腫瘤直徑(1=≥5 cm,0=<5 cm)、腫瘤臨床分期(1=Ⅲ期,0=Ⅱ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(1=是,0=否)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(1=是,0=否)、XRCC6基因的基因型(設(shè)置啞變量)作為自變量進(jìn)行多因素COX回歸分析。結(jié)果顯示,腫瘤臨床分期為Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是術(shù)后化療的胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05),而XRCC6基因突變情況是術(shù)后化療的胃癌患者預(yù)后不良的保護(hù)因素(P<0.05),見表3。

表3 多因素COX回歸分析

3 討 論

胃癌發(fā)病的分子機(jī)制尚不完全清楚,但癌基因突變被認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[5]?；熓侵杆幬镒饔糜谀[瘤細(xì)胞而引起相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)和功能改變,來抑制、殺死腫瘤細(xì)胞,進(jìn)而控制疾病進(jìn)展,但發(fā)生化療耐藥將大大降低化療的效果,嚴(yán)重影響患者預(yù)后[6]。修復(fù)酶的基因可通過單核苷酸多態(tài)性影響酶的結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)而導(dǎo)致個體出現(xiàn)化療耐藥[7],因此修復(fù)酶的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定是化療敏感的重要基礎(chǔ)。遺傳信息主要存在于DNA兩條脫氧核苷酸鏈中,雙鏈斷裂會破壞DNA完整性,進(jìn)而導(dǎo)致DNA片段損傷[8]。核苷酸切除修復(fù)是雙鏈斷裂修復(fù)的重要途徑,修復(fù)酶相關(guān)基因所編碼的蛋白在修復(fù)雙鏈斷裂過程中具有重要的作用[9],因此,此類基因或可作為評估胃癌患者化療敏感性及預(yù)后的重要參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示,術(shù)后化療的胃癌患者的預(yù)后可能與腫瘤直徑、腫瘤臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、XRCC6基因突變有關(guān)(均P<0.05),多因素COX回歸分析結(jié)果顯示,經(jīng)校正相關(guān)臨床病理特征后,XRCC6基因突變情況是術(shù)后化療的胃癌患者預(yù)后不良的保護(hù)因素(P<0.05),即攜帶XRCC6基因rs2267437位點(diǎn)CG/GG基因型的術(shù)后化療的胃癌患者預(yù)后更好,提示XRCC6基因發(fā)生雜合突變或純合突變更有利于術(shù)后化療胃癌患者的預(yù)后。鉑類藥物主要是通過破壞DNA發(fā)揮細(xì)胞毒性,進(jìn)而導(dǎo)致DNA功能損傷來發(fā)揮抗腫瘤作用[10]。DNA修復(fù)增強(qiáng)可降低化療藥物的殺傷作用,進(jìn)而影響化療效果,而DNA損傷后修復(fù)即是鉑類藥物發(fā)生耐藥的主要機(jī)制之一[11]。DNA修復(fù)是核苷酸通過識別受損DNA并進(jìn)行片段切除,然后形成新DNA的過程,Ku70蛋白是在此修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用的酶[12]。如核苷酸剪切修復(fù)功能降低,腫瘤細(xì)胞的DNA損傷后修復(fù)則受到抑制,進(jìn)而腫瘤細(xì)胞增殖受阻,此時患者獲得較好的化療效果[13]。XRCC6基因編碼的Ku70蛋白可與Ku80結(jié)合以激活DNA蛋白激酶,開啟修復(fù)過程,而XRCC6基因rs2267437位點(diǎn)基因突變可影響Ku70蛋白表達(dá),導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂、修復(fù)途徑被抑制,進(jìn)而導(dǎo)致DNA修復(fù)能力降低,抑制鉑類藥物化療耐藥發(fā)生,化療患者可獲得更好的預(yù)后[14]。此外,還有研究表明,XRCC6基因是調(diào)控雙鏈斷裂修復(fù)過程的重要分子,其發(fā)生突變后可通過影響核苷酸對DNA的修復(fù)作用,推測可能是XRCC6基因突變降低了核苷酸表達(dá),進(jìn)而影響了DNA修復(fù)功能,減少化療耐藥的發(fā)生,故患者預(yù)后更好[15]。 因此,攜帶XRCC6基因rs2267437位點(diǎn)CG/GG基因型的術(shù)后化療的胃癌患者預(yù)后更好。

綜上所述,XRCC6基因多態(tài)性與術(shù)后化療的胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān),攜帶XRCC6基因 rs2267437位點(diǎn)CG/GG基因型的術(shù)后化療的胃癌患者預(yù)后更好。臨床上可通過檢測XRCC6基因多態(tài)性,預(yù)測鉑類藥物化療應(yīng)答效果,進(jìn)而為個性化化療方案的制訂提供參考依據(jù)。然而本研究結(jié)論還有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證,同時XRCC6基因多態(tài)性在胃癌化療耐藥中的作用機(jī)制也尚待深入挖掘。