林兵,田園,任瑞霞(北京利德曼生化股份有限公司醫(yī)學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室,北京100176)

葡萄糖是一種六碳糖,在自然界中分布極為廣泛,屬醇醛類。人體血液中葡萄糖是生命活動(dòng)的主要能量來源,它在人體內(nèi)能直接參與新陳代謝過程。血液中葡萄糖含量的升高見于各型糖尿病[1]、妊娠期糖尿病[2]、糖尿病昏迷[3],降低見于胰島瘤[4]、藥物性低血糖[5]、酒精誘發(fā)的低血糖[6]、紅細(xì)胞增多癥等[7]。葡萄糖作為臨床常規(guī)測(cè)量項(xiàng)目,目前檢測(cè)方法主要有氧化酶法[8]、己糖激酶法[9]、葡萄糖脫氫酶法[10]等。其中己糖激酶法具有準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn),被美國(guó)臨床化學(xué)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(AACC)于1980年提出作為候選參考方法。本研究以血清葡萄糖參考方法為比對(duì)方法,研究以不具備互換性的水溶液校準(zhǔn)品作為工作校準(zhǔn)品的賦值方法,通過采用常規(guī)測(cè)量方法與參考方法比對(duì)的方式驗(yàn)證工作校準(zhǔn)品賦值方法的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 CARY100型紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Agilent公司,XSE205DU型分析天平、S220pH計(jì)均購(gòu)自瑞士Mettler Toledo公司,移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司,離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)公司,容量瓶購(gòu)自日本ASONE公司。

Tris-Base、Tris-HCl、硫酸鋅、氫氧化鋇、5′三磷酸腺嘌呤(ATP)、氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、醋酸鎂、酚酞、乙醇、己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。有證參考物質(zhì)SRM-917c和SRM-965b Level1～4均購(gòu)自美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(NIST)。2022年RELA樣本由國(guó)際臨床化學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)提供。葡萄糖水溶液工作校準(zhǔn)品來源于北京利德曼公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與稀釋液的配制方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液:1 g/L安息香酸溶液;工作儲(chǔ)備液:用SRM917c配制,濃度為55.5 mmol/L;工作標(biāo)準(zhǔn)液:分別移取0.0、2.5、5、10、15、20 mL儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中,用1 g/L安息香酸溶液定容至刻度,配制成濃度為0.0、2.78、5.55、11.10、16.50、22.20 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3蛋白質(zhì)沉淀試劑配制與確認(rèn) 酚酞指示劑:0.125 g酚酞溶解于25 mL乙醇中;飽和氫氧化鋇溶液:80 g氫氧化鋇溶解于1 000 mL無CO2水;硫酸鋅溶液:22 g/L。0.11 mol/L氫氧化鋇溶液:245 mL飽和氫氧化鋇溶液用無CO2水稀釋至1 000 mL,以酚酞為指示劑,用10 mL 0.11 mol/L氫氧化鋇溶液滴定10 mL 22 g/L硫酸鋅溶液確認(rèn)溶液濃度是否正確,滴定允許誤差為±0.1 mL。

1.4參考方法試劑配制 Tris-HCl原液:1.5%;Tris-Base原液:1.2%;Tris-Mg緩沖液:將1.1 g醋酸鎂溶解于800 mL Tris-HCl原液和200 mL Tris-Base原液的混合液中;ATP原液:0.826 8 g ATP溶解于250 mL Tris-Mg緩沖液中;NAD+原液:0.995 2 g NAD+溶解于250 mL Tris-Mg緩沖液中;己糖激酶原液:1.25 KU己糖激酶溶解于250 mL Tris-Mg緩沖液中;6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液:1.25 KU 6-磷酸葡萄糖脫氫酶溶解于250 mL Tris-Mg緩沖液中。

反應(yīng)試劑:200 mL NAD+原液、200 mL ATP原液、800 U己糖激酶原液、800 U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶原液,混合后以Tris-Mg緩沖液定容至1 000 mL。

1.5檢測(cè)步驟 取0.5 mL血清或工作標(biāo)準(zhǔn)液加入5.0 mL 0.11 mol/L氫氧化鋇溶液中,混勻5～10 s后加入5.0 mL 22 g/L硫酸鋅溶液,劇烈震蕩,充分混勻后以1 000×g離心10 min,取上清液0.5 mL加入2.5 mL反應(yīng)試劑中,置于(25±1)℃水浴中反應(yīng)10 min,然后將溶液加入比色皿中,在紫外可見分光光度計(jì)339 nm處讀取溶液吸光度,計(jì)算葡萄糖濃度。

1.6精密度評(píng)價(jià) 取2022年RELA-A、RELA-B在多天內(nèi)重復(fù)測(cè)定,計(jì)算2份樣本的測(cè)定不精密度。

1.7正確度評(píng)價(jià) 測(cè)定有證參考物質(zhì)SRM965b Level1-4,計(jì)算實(shí)測(cè)值與參考值之間的相對(duì)偏倚。

1.8校準(zhǔn)品賦值與驗(yàn)證 以參考方法測(cè)定樣本的濃度值為橫坐標(biāo),任意校準(zhǔn)品校準(zhǔn)的常規(guī)方法測(cè)定樣本信號(hào)值為縱坐標(biāo),繪制直線方程,將常規(guī)方法測(cè)量的工作校準(zhǔn)品信號(hào)值代入直線方程中,計(jì)算其濃度。賦值后的工作校準(zhǔn)品重新校準(zhǔn)常規(guī)測(cè)量系統(tǒng),采用與參考方法比對(duì)的方式驗(yàn)證賦值的有效性。

2 結(jié)果

2.1葡萄糖工作標(biāo)準(zhǔn)液的驗(yàn)證 根據(jù)1.2所述方法配制工作標(biāo)準(zhǔn)液,每天測(cè)試2次,測(cè)試4天,以理論濃度(X)為橫坐標(biāo),測(cè)定吸光度均值(Y)為縱坐標(biāo)建立曲線,直線方程為Y=0.049 63X+0.047 93,R2=1.000 0。

2.2精密度評(píng)價(jià) 4個(gè)工作日內(nèi),2份樣本每天各測(cè)試4次,各16次測(cè)試結(jié)果的不精密度均小于1.5%,見表1。

表1 精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.3正確度評(píng)價(jià) 測(cè)量有證參考物質(zhì)SRM965 Level1-4各3次,偏差在±1.5%內(nèi),見表2。

表2 正確度驗(yàn)證結(jié)果

2.4校準(zhǔn)品賦值 參考方法和任意校準(zhǔn)品校準(zhǔn)的常規(guī)方法同時(shí)測(cè)定53例血清樣本,以參考方法測(cè)定樣本濃度值(X)與常規(guī)方法測(cè)定樣本信號(hào)(Y)擬合直線方程,Y=500.74X-82.328,R2=0.999。同時(shí)將常規(guī)方法測(cè)定的工作校準(zhǔn)品信號(hào)值代入方程中,計(jì)算濃度為9.92 mmol/L,不確定度為0.22 mmol/L(k=2)。

2.5校準(zhǔn)品賦值驗(yàn)證 賦值后的工作校準(zhǔn)品校準(zhǔn)常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)(Y)與參考方法(X)同時(shí)測(cè)試49例血清樣本,直線方程為:Y=0.994 5X+0.023,R2=0.999 5,說明工作校準(zhǔn)品賦值有效。

3 討論

本研究復(fù)現(xiàn)了血清葡萄糖參考方法,評(píng)價(jià)了參考方法的2個(gè)主要性能:正確度、精密度。2022年RELA-A、RELA-B 2份樣本的不精密度均小于1.5%,有證參考物質(zhì)SRM965 Level1-4的偏倚均在±1.5%內(nèi),說明該方法具有良好的正確度與精密度。

檢測(cè)系統(tǒng)是由儀器、校準(zhǔn)品、試劑、操作程序等組成,而使用具有互換性與溯源性的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果一致化的前提。一般認(rèn)為,校準(zhǔn)品的互換性以混合血清最為理想[11],水溶液基質(zhì)的校準(zhǔn)品互換性則需要驗(yàn)證。使用參考方法直接賦值的混合血清作為測(cè)量系統(tǒng)的校準(zhǔn)品,可實(shí)現(xiàn)溯源鏈的傳遞,提高測(cè)量系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及不同檢測(cè)系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果的一致性[12-14],但血清來源困難,無法大量制備,且在低溫儲(chǔ)存的過程中,即使分析物保持穩(wěn)定,血清基質(zhì)的變化也可能會(huì)導(dǎo)致互換性發(fā)生改變,限制了混合血清的使用。

本研究中校準(zhǔn)品的賦值方法與ISO 17511文件中描述的賦值方法不同,采用常規(guī)方法測(cè)得的信號(hào)值與參考方法測(cè)得的濃度值擬合曲線的方式對(duì)工作校準(zhǔn)品進(jìn)行賦值,避免了參考方法直接賦值校準(zhǔn)品時(shí)由于校準(zhǔn)品互換性差而導(dǎo)致結(jié)果不一致[15],同時(shí)可不再對(duì)工作校準(zhǔn)品進(jìn)行互換性驗(yàn)證即可實(shí)現(xiàn)使常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)血清樣本結(jié)果的量值溯源。減少了賦值過程,提高了常規(guī)方法測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于使用水基質(zhì)校準(zhǔn)品作為工作校準(zhǔn)品,其制備簡(jiǎn)單,制作成本低,便于獲得,穩(wěn)定好,生物安全性高,有一定的應(yīng)用價(jià)值。本研究的不足之處是未對(duì)多點(diǎn)校準(zhǔn)對(duì)葡萄糖常規(guī)方法檢測(cè)結(jié)果溯源性的影響進(jìn)行探討,因此后期需要繼續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。